細(xì)胞貼壁原理

1、細(xì)胞貼壁原理懸浮細(xì)胞：細(xì)胞生長(zhǎng)不依靠支持物表面，在培育液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，這類細(xì)胞稱為懸浮細(xì)胞。如淋巴細(xì)胞。 貼壁細(xì)胞：在動(dòng)物細(xì)胞培育過程中，必需有可以貼附的支持物表面，其依靠自身分泌或培育基中的貼附因子才能在該表面生長(zhǎng)增殖的離體動(dòng)物的培育細(xì)胞。 兼性貼壁細(xì)胞：有些細(xì)胞并不嚴(yán)格地依靠支持物，它們既可以貼附于支持物表面生長(zhǎng)，但在肯定條件下，它們還可以在培育基中呈懸浮狀態(tài)良好地生長(zhǎng)，這類細(xì)胞稱之為兼性貼壁細(xì)胞。 貼壁細(xì)胞分為，上皮細(xì)胞型，成纖維細(xì)胞型，游走細(xì)胞型和多型細(xì)胞型，在顯微鏡下觀看時(shí)，貼壁細(xì)胞在瓶底伸展并延長(zhǎng)成梭型或不規(guī)章的三角形或扇形或其它形態(tài)，而且晃動(dòng)培育

2、液時(shí)，細(xì)胞不動(dòng)。 懸浮細(xì)胞漂在培育液中，呈圓形，晃動(dòng)培育液時(shí)細(xì)胞也隨著漂動(dòng)  貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞跟懸浮的細(xì)胞都有很多種。 活體體內(nèi)的細(xì)胞當(dāng)離體置于體外培育時(shí)大多數(shù)均以貼壁方式生長(zhǎng)，主要包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，比如成纖維細(xì)胞，骨骼組織（骨及軟骨），心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)分泌細(xì)胞，黑色素細(xì)胞及各種腫瘤細(xì)胞等。 少數(shù)細(xì)胞在體外培育是懸浮生長(zhǎng)，包括一些取自血、脾或骨髓的培育細(xì)胞，尤其是血液白細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞 。 體外培育貼壁細(xì)胞重要的生長(zhǎng)特點(diǎn)有：貼附和伸展以及接觸抑制和生長(zhǎng)的密度限制。貼附并伸展，是多數(shù)體外培育細(xì)胞的基

3、本生長(zhǎng)特點(diǎn)。雖然血細(xì)胞如淋巴細(xì)胞在活體體內(nèi)并無聚集的傾向并在體外可于懸浮狀態(tài)中生長(zhǎng)，但是大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)和體外均附著于肯定的底物而生長(zhǎng)，在體外時(shí)這些底物可以是其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。培育細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將漸漸伸展而形成肯定的形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣或上皮細(xì)胞樣等。細(xì)胞附著于底物時(shí)并非一種需要能量的過程，一般認(rèn)為與電荷有關(guān)。據(jù)資料記載，37時(shí)在2min內(nèi)細(xì)胞之間即可形成鍵，該鍵可對(duì)0.01%胰蛋白酶起作用且僅發(fā)生于細(xì)胞之間，而細(xì)胞與底物之間則無；8 min后才有穩(wěn)定的鍵形成。一些特殊的促細(xì)胞附著的物質(zhì)（如層粘連蛋白、纖維鏈接蛋白、III型膠原

4、、血清擴(kuò)展因子等）可能參與細(xì)胞的貼附過程。這些促細(xì)胞附著因子均為蛋白質(zhì)，存在于培育液尤其血清之中。在培育過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附有促貼附物質(zhì)的底物附著，以后細(xì)胞將伸展成其原來的形態(tài)。一般來說，從底物脫離下來的貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞，不能長(zhǎng)期在懸浮中生長(zhǎng)而將漸漸退變，除非這是一些轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞。另外，經(jīng)過無血清馴化后的細(xì)胞，會(huì)從貼壁生長(zhǎng)轉(zhuǎn)到懸浮生長(zhǎng)，目前在生物工程制藥領(lǐng)域，趨勢(shì)是使用無血清的懸浮培育為主。體外培育細(xì)胞重要的生長(zhǎng)特點(diǎn)有：貼附和伸展以及接觸抑制和生長(zhǎng)的密度限制。貼附并伸展，是多數(shù)體外培育細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)。雖然血細(xì)胞如淋巴細(xì)胞在活體

5、體內(nèi)并無聚集的傾向并在體外可于懸浮狀態(tài)中生長(zhǎng)，但是大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)和體外均附著于肯定的底物而生長(zhǎng)，在體外時(shí)這些底物可以是其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。培育細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將漸漸伸展而形成肯定的形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣或上皮細(xì)胞樣等。細(xì)胞附著于底物時(shí)并非一種需要能量的過程，一般認(rèn)為與電荷有關(guān)。據(jù)資料記載，37時(shí)在2min內(nèi)細(xì)胞之間即可形成鍵，該鍵可對(duì)0.01%胰蛋白酶起作用且僅發(fā)成于細(xì)胞之間，而細(xì)胞與底物之間則無；8 min后才有穩(wěn)定的鍵形成。一些特殊的促細(xì)胞附著的物質(zhì)（如層粘連蛋白、纖維鏈接蛋白、III型膠原、血清擴(kuò)展因子等）可能參與細(xì)胞的貼附過

6、程。這些促細(xì)胞附著因子均為蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞膜表面或培育液尤其血清之中。在培育過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附有促貼附物質(zhì)的底物附著，以后細(xì)胞將伸展成其原來的形態(tài)。一般來說，從底物脫離下來的貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞，不能長(zhǎng)期在懸浮中生長(zhǎng)而將漸漸退變，除非這是一些轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞。摘自司徒鎮(zhèn)強(qiáng)主編的細(xì)胞培育一書，具體內(nèi)容見1.2 培育細(xì)胞的特性1、細(xì)胞貼壁原理         培育細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將漸漸伸展而形成肯定的形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣或上皮細(xì)胞樣等。細(xì)胞附著于底

7、物時(shí)并非一種需要能量的過程，一般認(rèn)為與電荷有關(guān)。據(jù)資料記載，37時(shí)在2 min內(nèi)細(xì)胞之間即可形成鍵，該鍵可對(duì)0.01%胰蛋白酶起作用且僅發(fā)覺于細(xì)胞之間，而細(xì)胞與底物之間則無；8 min后才有穩(wěn)定的鍵形成。         一些特殊的促細(xì)胞附著的物質(zhì)（如層粘連蛋白、纖維鏈接蛋白、III型膠原、血清擴(kuò)展因子等）可能參與細(xì)胞的貼附過程。這些促細(xì)胞附著因子（或貼壁因子）均為蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞膜表面或培育液尤其血清之中。在培育過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附有促貼附物質(zhì)的底物附著，以后細(xì)胞將伸展成其原來的形態(tài)。一般

8、來說，從底物脫離下來的貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞，不能長(zhǎng)期在懸浮中生長(zhǎng)而將漸漸退變，除非這是一些轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞。另外，經(jīng)過無血清馴化后的細(xì)胞，會(huì)從貼壁生長(zhǎng)轉(zhuǎn)到懸浮生長(zhǎng)，目前在生物工程制藥領(lǐng)域，趨勢(shì)是使用無血清的懸浮培育為主。2、貼壁細(xì)胞如何分別下來？         假如把貼壁的細(xì)胞洗下來最常用的方法就是加入胰蛋白酶消化，37環(huán)境下放置35min便可，但是殘留培育瓶?jī)?nèi)的胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞有毒性作用，所以都會(huì)添加低濃度的血清以中和胰蛋白酶的。用超聲的方法也可以把細(xì)胞分別下來，但是要留意超聲的頻率不能太大，而且細(xì)胞很嬌嫩，超聲會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的裂開。這是由細(xì)

9、胞的性質(zhì)特點(diǎn)打算的。3、是否全部動(dòng)物細(xì)胞都要貼壁生長(zhǎng)？         有些細(xì)胞是必需要附著在支持物上才可以生長(zhǎng)的，比如肝細(xì)胞，胃上皮細(xì)胞等等 而有些細(xì)胞可以懸浮生長(zhǎng)，比如骨髓細(xì)胞白，血病細(xì)胞等等這些細(xì)胞的生長(zhǎng)都是需要添加血清的，而不是有些人說的，加入血清后會(huì)貼壁。體外培育細(xì)胞重要的生長(zhǎng)特點(diǎn)：貼附和伸展以及接觸抑制和生長(zhǎng)的密度限制。提高羊水細(xì)胞培育成功率的方法來自: 生物01丁08 2007-09-27 19:43:46摘要:目的提高羊水培育的成功率。 方法正常羊水保留換液標(biāo)本,以備復(fù)查;特別羊水接受細(xì)胞分別技術(shù)提

10、取羊水中的有效細(xì)胞成分;準(zhǔn)時(shí)發(fā)覺污染羊水并進(jìn)行抗菌處理。 結(jié)果提高了羊水培育的成功率(99·4% )并縮短特別羊水的培育時(shí)間,解決了部分污染羊水的污染問題(2/3)。 結(jié)論保留換液標(biāo)本可有效解決因收集不當(dāng)而導(dǎo)致無法診斷的問題;細(xì)胞分別技術(shù)可提高特別羊水細(xì)胞培育的成功率并縮短培育時(shí)間,污染的羊水也可抗菌后培育成功。 羊水細(xì)胞培育由于技術(shù)要求高、難度大、周期長(zhǎng)、易污染、分裂相較少、對(duì)人員素養(yǎng)要求高等問題而難以普及,但是羊水細(xì)胞培育及染色體制備與核型分析是產(chǎn)前診斷染色體病的主要手段。多年來對(duì)羊水細(xì)胞的培育及其染色體制片雖不斷有所改進(jìn),但羊水細(xì)胞培育與制片的難度

11、仍沒有絲毫降低1, 7。近年興起的基因診斷由于特異性強(qiáng)、設(shè)備要求高、監(jiān)測(cè)范圍窄、試驗(yàn)影響因素多等缺陷仍無法取代羊水細(xì)胞培育與核型分析在產(chǎn)前診斷中的價(jià)值與地位。幾年來,我們針對(duì)血性羊水、胎糞、胎脂污染及細(xì)菌污染等嚴(yán)峻影響羊水培育的成功問題進(jìn)行了一些探究,并取得了比較滿足的效果,現(xiàn)報(bào)告如下。 資料與方法 1.試劑與器材一次性無菌離心管和50ml的培育瓶是美國Fancon公司生產(chǎn)的,羊水培育基為美IrvineScientific公司生產(chǎn)ChangMedium C專用羊水培育基,CO2培育箱為FORMAL 3131。倒置顯微鏡為OLYMPUS CKX-41。 2.對(duì)象經(jīng)產(chǎn)

12、前篩查評(píng)估結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)病率的孕婦或有其它產(chǎn)前診斷指征、孕周在1627w的孕婦。 3.羊水采集方法B超定位后,常規(guī)消毒,接受22號(hào)PIE穿刺針穿刺,最初用5ml注射器抽取約2ml羊水棄去,再換一20ml注射器抽取羊水約20m,l注入兩個(gè)1次性的無菌離心管中,標(biāo)本盡快送試驗(yàn)室接種。 4.一般羊水的處理方法正常的羊水與輕度血性羊水以12001300rpm離心10min,棄去上清液,保留0. 5ml羊水,輕輕混懸細(xì)胞,以備接種用。 5.嚴(yán)峻血性羊水的處理以1200 1300 rpm離心10min后,將上清液移入另1無菌離心管中,保留約1ml羊水并混勻,另取1離心管加入約

13、2ml無菌淋巴細(xì)胞分別液,再將混勻的羊水細(xì)胞懸液12ml緩緩加入淋巴細(xì)胞分別液的上層,要求分層清楚,以12001300 rpm離心10 min后,液體分4層:自下而上依次為紅細(xì)胞、分別液、羊水細(xì)胞、羊水。 吸取中層薄薄的一層羊水細(xì)胞于1離心管中用首次分別出來的羊水上清液洗滌分別出來的羊水細(xì)胞23次,以除去混入的細(xì)胞分別液,最終留下0. 5ml羊水,輕輕混懸細(xì)胞,以備接種用。嚴(yán)峻胎糞、胎脂污染的羊水也可用此細(xì)胞分別方法提純羊水細(xì)胞。 6.羊水細(xì)胞培育與制片將羊水細(xì)胞用無菌滴管打勻,接種于50ml塑料培育瓶中,并加入ChangMedium C培育液4m,l用滴管輕輕混勻,蓋上瓶

14、蓋,切勿擰緊,置于5% CO2培育箱中培育。到第5天若觀看到有較好的梭形細(xì)胞克隆則更換新穎培育液。將原來的培育液及混懸的羊水細(xì)胞轉(zhuǎn)入一個(gè)備用的無菌小瓶中,封蓋仍放入5% CO2培育箱中。收獲時(shí)在培育終止前4h加入秋水仙素,最終濃度為2. 0mg/ml2. 5mg/ml。羊水細(xì)胞的收獲、制片、顯帶等 操作同傳統(tǒng)的方法。如若收獲失敗,制片中沒有可用于分析的染色體核型,則將備用小瓶中的羊水細(xì)胞重新分別接種入細(xì)胞培育瓶中并加入新穎的培育液4m,l后面的步驟同新接種的羊水細(xì)胞培育步驟一樣。 7.污染羊水的處理羊水細(xì)胞接種后,前兩天每天觀看12次,以便觀看是否有污染,若無污染,則不再觀

15、看,若有污染的證據(jù)應(yīng)馬上加入廣譜抗生素(如阿莫西林或氨芐西林),濃度為10g/ml15g/m,l加入12h后,觀看抗菌效果,假如有抗菌效果則再加入1次抗生素,假如抗菌效果不明顯,再加入另一種抗生素(如頭孢曲松)15g/ml20g/ml。每24h加入1次,一般不超過3次(抗生素在體外代謝較慢,藥物濃度有累加效果),待有細(xì)胞貼壁時(shí)馬上更換新穎的培育液,并加入10g/ml15g/ml的廣譜抗生素。 結(jié)果 1.總共338例羊水標(biāo)本一次性培育成功率達(dá)到99. 4%(2例失敗)。325例一般羊水收獲時(shí)間平均為7. 8d,最早的· 45·中國優(yōu)生與遺傳雜志2

16、007年第15卷第6期在第一次換液(第5天)即可收獲,最長(zhǎng)的為16d。2. 9例嚴(yán)峻血性羊水均培育成功,前3例未經(jīng)過處理培育周期為1533d,經(jīng)過細(xì)胞提純處理的后6例羊水培育收獲時(shí)間為718d,處理后的羊水貼壁時(shí)間明顯提前。 3. 4例微生物污染的羊水1例未作任何處理,培育失敗;另3例發(fā)覺污染后馬上加入廣譜抗生素, 1例因發(fā)覺較晚培育失敗, 2例培育成功,收獲時(shí)間分別為13d、18d。 4.收獲的336例羊水細(xì)胞,每例制備68張染色體玻片, 229例可獲15個(gè)以上可分析的核型;另有7例收獲制片后,無法進(jìn)行核型分析,又將備用瓶中的羊水細(xì)胞重新接種,2次或3次培育、收獲、制片成

17、功。 爭(zhēng)辯 影響羊水細(xì)胞培育成功率的因素很多2, 6,但主要的是培育基的質(zhì)量和羊水中存活細(xì)胞的數(shù)量。我們應(yīng)用了多種品牌的羊水培育基,認(rèn)為美國IrvineScientific公司生產(chǎn)的ChangMedium C專用羊水培育基效果較好,細(xì)胞貼壁時(shí)間早,生長(zhǎng)快。對(duì)1727w的羊水培育狀況進(jìn)行分析后,認(rèn)為羊水的最佳采集時(shí)間為1824w之間。18w之前羊水中細(xì)胞比較少,貼壁細(xì)胞克隆少,收獲較晚; 25w之后的羊水有形成分增多,常較混濁,由于有形成分較多(包括大量的死細(xì)胞),嚴(yán)峻地影響了活細(xì)胞的貼壁,因此也造成收獲時(shí)間延長(zhǎng)。孕周大的羊水一旦發(fā)覺幾個(gè)貼壁克隆時(shí)就應(yīng)準(zhǔn)時(shí)換液,消退大量有形成

18、分對(duì)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。孕周越大,死細(xì)胞越多、雜質(zhì)越多、活細(xì)胞越少,細(xì)胞貼壁越困難。羊水收集時(shí)機(jī)的把握是能否制得良好染色體核型玻片的關(guān)鍵3。細(xì)胞克隆多、面積大、透亮細(xì)胞多時(shí)可收獲較多的分裂相。實(shí)踐中我們觀看到:類圓形細(xì)胞克隆收獲的分裂相最好,梭長(zhǎng)形羊水細(xì)胞克隆收獲時(shí)分裂相易受細(xì)胞數(shù)量的影響。這可能與類圓形細(xì)胞貼壁可能不是很緊,易收獲、低滲效果好、滴片時(shí)細(xì)胞易裂開有關(guān)而梭長(zhǎng)形羊水細(xì)胞克隆貼壁緊、不易因低滲腫脹、滴片時(shí)細(xì)胞不易裂開,因此核型分散效果相對(duì)較差。所以要彌補(bǔ)梭長(zhǎng)形羊水細(xì)胞克隆的這一缺點(diǎn),就必需要有較多的貼壁細(xì)胞和透亮細(xì)胞。假如細(xì)胞克隆較少且生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)較少,應(yīng)準(zhǔn)時(shí)進(jìn)行傳代3,以便獲得較多

19、的細(xì)胞克隆,否則一個(gè)細(xì)胞克隆時(shí)間過長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的速度就會(huì)變慢,分裂相對(duì)削減。對(duì)嚴(yán)峻血性羊水來說,由于混入了大量的紅細(xì)胞,嚴(yán)峻的影響了成活羊水細(xì)胞的貼壁4,同時(shí)羊水中混入的血漿也簡(jiǎn)潔使羊水凝集,常規(guī)分別獲得的羊水細(xì)胞中除混有大量的紅細(xì)胞外,還混有纖維蛋白絲等,這些成分對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)也有抑制作用;大量的紅細(xì)胞不僅嚴(yán)峻影響羊水細(xì)胞的貼壁而且在羊水培育的過程中紅細(xì)胞會(huì)不斷的破壞,釋放的血紅素對(duì)羊水細(xì)胞也有肯定的毒性作用。我們通過細(xì)胞分別技術(shù),提純羊水細(xì)胞,消退了紅細(xì)胞對(duì)羊水細(xì)胞貼壁的影響,消退了纖維蛋白及其降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,消退了血紅素對(duì)羊水細(xì)胞的毒性作用,使血性羊水的收獲時(shí)間明顯提前。從羊水采集

20、到收獲的過程比較簡(jiǎn)單漫長(zhǎng),其中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能對(duì)羊水或培育物造成污染5, 6, 7,我們?cè)谌粘９ぷ髦锌隙ㄒ獓?yán)格操作規(guī)程,留意無菌操作。同時(shí)嚴(yán)密觀看,一旦發(fā)覺有污染現(xiàn)象應(yīng)準(zhǔn)時(shí)實(shí)行措施,首要的方法是加入抗生素。我們?cè)诎l(fā)覺羊水有污染時(shí)加入抗生素,準(zhǔn)時(shí)的挽救了部分污染標(biāo)本,削減了病人的苦痛,提高了試驗(yàn)技能。由于抗生素在抗菌的同時(shí)也會(huì)抑制羊水細(xì)胞的生長(zhǎng),因此加入抗生素的量和種類肯定要合適。我們目前應(yīng)用的抗生素的量也只是一個(gè)探究用量,最佳抗生素用量還有待于進(jìn)一步探究。解決羊水微生物污染的關(guān)鍵還是嚴(yán)格無菌操作程序。綜上所述,接受合格的培育基、備份式的羊水細(xì)胞收獲、血性羊水的細(xì)胞純化及在污染羊水細(xì)胞培育

21、瓶中加入合適的抗生素等可以增加羊水細(xì)胞的貼壁幾率、縮短羊水細(xì)胞培育時(shí)間、提高羊水細(xì)胞培育的成功率,具有重要的臨床意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 參考文獻(xiàn) 1周煥庚,夏家輝,張思仲,主編.人類染色體M.北京:科學(xué)技術(shù)出版社, 1987. 2劉曉翌,肖曉素,樊尚榮,等.羊水細(xì)胞染色體制備方法的爭(zhēng)辯J.中國婦產(chǎn)科臨床雜志, 2004, 5(4): 296-300. 3鄭育紅,孫筱放,孫小蔓.原瓶傳代培育應(yīng)用于羊水產(chǎn)前診斷中的爭(zhēng)辯J.中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2002, 1(6): 58-59. 4許爭(zhēng)峰,胡婭莉,朱瑞芳.高效羊水細(xì)胞培育技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用J.中華婦產(chǎn)科雜志, 2006, 41(4): 275. 5Seguin LR, PalmerCG. Variable inf1uencing growth andmorphologyand colonies of cells from human amniotic fluid J. Prenat Diagn,1983, 3: 110. 6TurhanN0,ErenU, SeckinNC. Second-trimestergenetic amnio cente-sis:5-year experienJ.ArchGynecolObstet,2005,271:19-21.&#