構(gòu)建具有神經(jīng)支配的工程化心肌組織的初步研究

1、構(gòu)建具有神經(jīng)支配的工程化心肌組織的初步研究 11-02-08 17:03:00 編輯：studa20 作者：王靜，郭立國，馮金升，任紅茹【摘要】【關鍵詞】 組織工程；心肌細胞；PC12細胞；共培養(yǎng)；神經(jīng)支配；神經(jīng)生長因子 Abstract：To investigate the possibility of neuronal PC12 cells being used as models to investigate the innervation of tissue-engineered cardiac tissue.Neonatal rat primary cardiacmyocytes i

2、solated with using 0.25% trypsin containing 0.04%EDTA were cocultured with the NGF induced sympathetic neuron-like PC12 cells in liquid type I collagen liquid . After that , H.E. staining , immunhistochemistry staining and transmission electron microscopy were used to evaluate it. Result showed that

3、 in the 3-D co-culture model, NGF induced PC12 cells outgrew processes which reached the surface of the cardiacmyocytes and moved along with the beat of cardiomyocytes. Their varicosities also touched with cariamyocytes.The results of our study suggest that PC12 cells is a feasible model to be used

4、in the study of neural innervation of tissue engineered cardiac tissue. And the cardiomyocytes may be innervated in this model. Key words：Tissue engineering； Cardiomyocytes； PC12;；Co-culture；Innervation； Nerve growth factor 1 引 言 神經(jīng)系統(tǒng)對機體各組織、器官及系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育過程具有重要作用。神經(jīng)系統(tǒng)使機體各部分在功能上成為整體。近年來，組織工程研究發(fā)展迅速，國內(nèi)外研究

5、人員相繼成功地體外復制了軟骨1、骨2、皮膚3以及心肌4等組織。但是，要保證組織工程化產(chǎn)品在體內(nèi)移植后的存活，充分的血液供應和完善的神經(jīng)支配起著決定性因素。如何在構(gòu)建工程化組織的同時重建其血液供應和神經(jīng)支配，已成為組織工程研究從基礎研究向臨床應用過渡的關鍵性問題。到目前為止，工程化心肌組織的血管化5研究進展順利，而其神經(jīng)支配研究由于神經(jīng)系統(tǒng)的復雜性及缺乏合適的體外模型，目前尚未見報道。 心肌和其他肌肉組織一樣，神經(jīng)的有效支配在其發(fā)揮正常生理功能方面起著重要作用。Dianne6等（1991年）將胸腰部交感神經(jīng)節(jié)和心肌細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)具有腎上腺素能支配的心肌細胞的體積明顯增大，表明神經(jīng)支配有利于心肌

6、細胞的生長。李振中7等（1996年）將大鼠脊神經(jīng)節(jié)與心肌細胞聯(lián)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維終止于搏動的心肌細胞表面。上述通過二維條件下，心肌細胞與神經(jīng)細胞共培養(yǎng)的結(jié)果表明，神經(jīng)細胞與心肌細胞共培養(yǎng)能夠相互影響，并有利于心肌細胞的生長發(fā)育和功能的發(fā)揮。 由于原代分離培養(yǎng)的交感神經(jīng)元對體外生存環(huán)境要求較高，而NGF誘導后的交感神經(jīng)元樣PC12細胞培養(yǎng)條件更為簡單，培養(yǎng)過程中狀態(tài)也相對穩(wěn)定。工程化心肌組織的培養(yǎng)環(huán)境主要涉及到心肌組織的生長與存活，因此很難同時滿足原代分離神經(jīng)元的生長要求?；诖耍狙芯窟x用NGF誘導分化的PC12細胞與心肌細胞在液態(tài)膠原中共培養(yǎng)作為模型，對構(gòu)建具有神經(jīng)支配的工程化心肌組織進行

7、了初步的探索性研究，以探討體外再造具有神經(jīng)支配的心肌組織工程的可行性，并為心肌組織工程的神經(jīng)支配研究提供初步的資料。 2 材料與方法 2.1 材料 22 方法 11-02-08 17:03:00 編輯：studa20 3結(jié) 果 3.1 相差顯微鏡下觀察的結(jié)果 相差顯微鏡下觀察，第二天即可見單個的神經(jīng)細胞長出突起，隨著時間的延長，長出突起的細胞越來越多，突起也越來越長，在心肌細胞的表面延伸（見圖1A）。心肌細胞在培養(yǎng)的第二天即可見單個細胞在跳動，第三天即可見一簇一簇的細胞在跳動，第五天神經(jīng)細胞生長的神經(jīng)突起呈放射狀到達心肌細胞的表面并隨心肌細胞一起跳動（見圖1B）。圖1 PC12與心肌細胞在液態(tài)

8、膠原中混合培養(yǎng)的相差顯微 鏡下觀察的結(jié)果 A.神經(jīng)細胞長出的神經(jīng)突起（）分別到達心肌細胞 （）的表面(40) B.神經(jīng)細胞長出的神經(jīng)突起（）呈放射狀到達心肌 細胞的表面并隨心肌細胞一起跳動(40) Fig 1 Phase contrast microscope result of innervated tissue-engineered cardiac sheet(40) 3.2 HE染色結(jié)果 由于本實驗采用低密度的PC12細胞植入，因此PC12細胞分散在原代心肌細胞的網(wǎng)絡中。PC12細胞的核較大，而心肌細胞的核較小，核均為藍色（見圖2）。 3.3 免疫組化染色結(jié)果 采用a-肌小節(jié)肌動蛋白免疫

9、組化染色對心肌細胞進行鑒定，胞漿呈棕色(見圖3A)。采用NF對神經(jīng)纖維進行免疫組化染色（見圖3B），可觀察到NF陽性的細胞胞核較大，其周圍有一些染色陰性的心肌細胞，胞核較小。 3.4 透射電鏡觀察結(jié)果 PC12細胞與新生大鼠心肌細胞在液態(tài)膠原中混合培養(yǎng)后，圖中可見心肌細胞、心肌纖維和神經(jīng)突起。N1、N2 為神經(jīng)纖維，C為心肌細胞（見圖4）。M為心肌纖維（見圖5），S為PC12與心肌細胞之間的突觸（見圖6）。4 討 論 本研究以NGF誘導后的交感神經(jīng)元樣PC12細胞與新生大鼠心肌細胞共培養(yǎng)和體外構(gòu)建組織工程化心肌片層的研究為基礎，以NGF誘導后的交感神經(jīng)元樣PC12細胞與新生大鼠新室肌細胞為種子

10、細胞，以膠原、Matrigel為支架材料，進行構(gòu)建具有神經(jīng)支配的工程化心肌片層的初步探索性研究。通過組織學、免疫組化的檢測與透射電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)PC12細胞在三維條件下，經(jīng)NGF誘導產(chǎn)生較長的神經(jīng)突起；PC12細胞與心肌細胞在三維條件下共培養(yǎng)，神經(jīng)細胞生長的神經(jīng)突起呈放射狀到達心肌細胞的表面與心肌細胞一起跳動，且長出的神經(jīng)突起能與原代心肌細胞形成形態(tài)上非常疑似突觸連接的結(jié)構(gòu)。 由于各組織與器官中神經(jīng)系統(tǒng)的復雜性，到目前為止，組織工程化產(chǎn)品的神經(jīng)支配研究進展相對比較緩慢，僅在骨組織工程的神經(jīng)支配研究中取得部分進展，張元平等10（2005）將感覺神經(jīng)、運動神經(jīng)分別植入組織工程骨修復兔股骨缺損，與單

11、純組織工程骨和組織工程骨中植入血管束的修復效果相比較，發(fā)現(xiàn)利用感覺神經(jīng)束植入的方法可以提高組織工程骨的成骨作用,而植入運動神經(jīng)束卻無此作用。這項研究為組織工程骨的神經(jīng)化重建奠定了一定的基礎。而其它組織工程化產(chǎn)品的神經(jīng)支配研究則未見報道。 近年來組織工程研究領域發(fā)展迅速，心肌組織工程研究也取得了很大的進展，國內(nèi)外有關心肌組織構(gòu)建物的報道日益增多，德國科學家Zimmermann 等人11（2002年）成功在體外構(gòu)建了組織工程心肌條帶，軍事醫(yī)學科學院趙云山博士等12（2004年）在Zimmermann研究基礎上，構(gòu)建出類似天然心肌的心肌條帶，并對細胞接種濃度及膠原凝膠含量與再造條件的關系進行了深入研

12、究。上述體外培養(yǎng)的可供移植的環(huán)狀條帶給治療心臟疾患帶來了新的希望。但是，要保證工程化心肌組織在體內(nèi)移植后的存活，充分的血液供應和完善的神經(jīng)支配起著決定性因素。 隨著心肌組織工程研究深入，以及向臨床過渡的逐漸展開，一個主要的問題就是如何使構(gòu)建的工程化心肌組織在體內(nèi)存活并迅速發(fā)揮作用。帶有血管系統(tǒng)和神經(jīng)支配的復合工程化心肌組織符合仿生學觀點，是理想的解決方案。關于心肌組織血液供應的形式已有較廣泛的研究，比如, 國內(nèi)外一些實驗室應用混合細胞構(gòu)建工程化組織的技術方法，觀察不同細胞間的相互作用對血管形成的影響, 嘗試進行工程組織體外人工血管化，使移植后的組織盡快與宿主之間建立血液循環(huán)。Zimmerman

13、n等13（2003）發(fā)現(xiàn)，在缺血模型中，利用混有其它細胞的心肌細胞構(gòu)建的工程化心肌組織的心肌收縮力比單純由心肌細胞構(gòu)建的強兩倍。不僅如此，Zimmermann等14（2002）還觀察到，混合細胞構(gòu)建的工程化心肌組織，同時出現(xiàn)了初級毛細血管和大血管樣結(jié)構(gòu)。這些血管樣結(jié)構(gòu)在移植后較快與宿主建立了血液循環(huán)。 在心肌組織的神經(jīng)支配方面，由于心肌的神經(jīng)支配比較復雜，且沒有合適的體外研究模型。因此，一方面要對心臟神經(jīng)的解剖學、形態(tài)學、生理學做進一步的研究，另一方面應對心肌組織工程神經(jīng)支配的方式進行必要的探索，以便加快心肌組織工程向臨床的應用。雖然近年來心肌組織工程血管化研究發(fā)展迅速，但是，到目前為止，心肌

14、組織工程的神經(jīng)支配研究尚未見報道。本研究是在以往研究的基礎上，首次對工程化心肌組織的神經(jīng)支配進行探索性研究?！緟⒖嘉墨I】 1Masuda K,HejnaMJ, HejnaMJ.A novel two-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by muture bovine chondrocytes:the alginate-recovered-chondrocyte(ARC)methodJ. Journal of Orthopaedic Research,2003,21:139-148.2Devin JE,Lau

15、rencin CT, Laurencin CT .Three-dimensional deg 11-02-08 17:03:00 編輯：studa20 3結(jié) 果 3.1 相差顯微鏡下觀察的結(jié)果 相差顯微鏡下觀察，第二天即可見單個的神經(jīng)細胞長出突起，隨著時間的延長，長出突起的細胞越來越多，突起也越來越長，在心肌細胞的表面延伸（見圖1A）。心肌細胞在培養(yǎng)的第二天即可見單個細胞在跳動，第三天即可見一簇一簇的細胞在跳動，第五天神經(jīng)細胞生長的神經(jīng)突起呈放射狀到達心肌細胞的表面并隨心肌細胞一起跳動（見圖1B）。圖1 PC12與心肌細胞在液態(tài)膠原中混合培養(yǎng)的相差顯微 鏡下觀察的結(jié)果 A.神經(jīng)細胞長出的神經(jīng)突

16、起（）分別到達心肌細胞 （）的表面(40) B.神經(jīng)細胞長出的神經(jīng)突起（）呈放射狀到達心肌 細胞的表面并隨心肌細胞一起跳動(40) Fig 1 Phase contrast microscope result of innervated tissue-engineered cardiac sheet(40) 3.2 HE染色結(jié)果 由于本實驗采用低密度的PC12細胞植入，因此PC12細胞分散在原代心肌細胞的網(wǎng)絡中。PC12細胞的核較大，而心肌細胞的核較小，核均為藍色（見圖2）。 3.3 免疫組化染色結(jié)果 采用a-肌小節(jié)肌動蛋白免疫組化染色對心肌細胞進行鑒定，胞漿呈棕色(見圖3A)。采用NF對神經(jīng)

17、纖維進行免疫組化染色（見圖3B），可觀察到NF陽性的細胞胞核較大，其周圍有一些染色陰性的心肌細胞，胞核較小。 3.4 透射電鏡觀察結(jié)果 PC12細胞與新生大鼠心肌細胞在液態(tài)膠原中混合培養(yǎng)后，圖中可見心肌細胞、心肌纖維和神經(jīng)突起。N1、N2 為神經(jīng)纖維，C為心肌細胞（見圖4）。M為心肌纖維（見圖5），S為PC12與心肌細胞之間的突觸（見圖6）。4 討 論 本研究以NGF誘導后的交感神經(jīng)元樣PC12細胞與新生大鼠心肌細胞共培養(yǎng)和體外構(gòu)建組織工程化心肌片層的研究為基礎，以NGF誘導后的交感神經(jīng)元樣PC12細胞與新生大鼠新室肌細胞為種子細胞，以膠原、Matrigel為支架材料，進行構(gòu)建具有神經(jīng)支配的工

18、程化心肌片層的初步探索性研究。通過組織學、免疫組化的檢測與透射電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)PC12細胞在三維條件下，經(jīng)NGF誘導產(chǎn)生較長的神經(jīng)突起；PC12細胞與心肌細胞在三維條件下共培養(yǎng)，神經(jīng)細胞生長的神經(jīng)突起呈放射狀到達心肌細胞的表面與心肌細胞一起跳動，且長出的神經(jīng)突起能與原代心肌細胞形成形態(tài)上非常疑似突觸連接的結(jié)構(gòu)。 由于各組織與器官中神經(jīng)系統(tǒng)的復雜性，到目前為止，組織工程化產(chǎn)品的神經(jīng)支配研究進展相對比較緩慢，僅在骨組織工程的神經(jīng)支配研究中取得部分進展，張元平等10（2005）將感覺神經(jīng)、運動神經(jīng)分別植入組織工程骨修復兔股骨缺損，與單純組織工程骨和組織工程骨中植入血管束的修復效果相比較，發(fā)現(xiàn)利用感覺

19、神經(jīng)束植入的方法可以提高組織工程骨的成骨作用,而植入運動神經(jīng)束卻無此作用。這項研究為組織工程骨的神經(jīng)化重建奠定了一定的基礎。而其它組織工程化產(chǎn)品的神經(jīng)支配研究則未見報道。 近年來組織工程研究領域發(fā)展迅速，心肌組織工程研究也取得了很大的進展，國內(nèi)外有關心肌組織構(gòu)建物的報道日益增多，德國科學家Zimmermann 等人11（2002年）成功在體外構(gòu)建了組織工程心肌條帶，軍事醫(yī)學科學院趙云山博士等12（2004年）在Zimmermann研究基礎上，構(gòu)建出類似天然心肌的心肌條帶，并對細胞接種濃度及膠原凝膠含量與再造條件的關系進行了深入研究。上述體外培養(yǎng)的可供移植的環(huán)狀條帶給治療心臟疾患帶來了新的希望。但是，要保證工程化心肌組織在體內(nèi)移植后的存活，充分的血液供應和完善的神經(jīng)支配起著決定性因素。 隨著心肌組織工程研究深入，以及向臨床過渡的逐漸展開，一個主要的問題就是如何使構(gòu)建的工程化心肌組織在體內(nèi)存活并迅速發(fā)揮作用。帶有血管系統(tǒng)和神經(jīng)支配的復合工程化心肌組織符合仿生學觀點，是理想的解決方案。關于心肌組織血液供應的形式已有較廣泛的研究，比如, 國內(nèi)外一些實驗室應用混合細胞構(gòu)建工程化組織的技術方法，觀察不同細胞間的相互作用對血管形成的影響, 嘗試進行工程組織體外人工血管化，使移植后的組織盡快與宿主之間建