松果體、中樞核團(tuán)與淋巴細(xì)胞間信息傳遞的晝夜節(jié)律

1、    松果體、中樞核團(tuán)與淋巴細(xì)胞間信息傳遞的晝夜節(jié)律        摘要目的探討松果體、中樞核團(tuán)視交叉上核(SCN)和中縫背核(DR)與外周淋巴細(xì)胞之間晝夜節(jié)律的聯(lián)系和傳遞關(guān)系。方法在標(biāo)準(zhǔn)的光照條件下，測定中樞和外周第一信使褪黑素(MT)、第二信使cAMP和cGMP的晝夜節(jié)律。結(jié)果在小鼠松果體和血清中，MT含量的晝夜節(jié)律峰值位于黑暗中期，而各組織中cAMP/cGMP比值的節(jié)律峰值卻位于光照中期，呈現(xiàn)相互倒置的位相關(guān)系。各組織中cAMP/cGMP比值的晝夜節(jié)律的峰值分別為：松

2、果體，-155.82°(CT1023)；SCN，-166.30°(CT1054)；DR，-179.16°(CT1156)；血清，-186.66°(CT1227)；淋巴細(xì)胞，-188.00°(CT1232)。結(jié)論依據(jù)cAMP/cGMP峰值出現(xiàn)的晝夜時(shí)間先后，由中樞向外周淋巴細(xì)胞的信息傳遞按照松果體SCNDR血液淋巴細(xì)胞的順序進(jìn)行。關(guān)鍵詞松果體視交叉上核中縫背核淋巴細(xì)胞信息傳遞中號Q426 Circadian Rhythms of Signal Transduction between Pineal, Central Nuclei and Lymp

3、hocyteTong JianQin LiqiangZhu Jinhua(Department of Preventive Medicine, Suzhou Medical College, Suzhou 215007)ObjectiveTo explore the transductive relationship between pineal, central nuclei of suprachiasmatic nucleus (SCN) and dorsal raphe(DR), and peripheral lymphocyte in terms of circadian rhythm

4、. MethodsCircadian changes of melatonin (MT), cAMP and cGMP contents in the central nuclei and lymphocytes of mice were determined under the standard light-dark cycle. ResultsThe peak of MT rhythm in pineal and serum was found at middle of the dark phase, and that of the cAMP/cGMP ratio in each tiss

5、ue examed was presented at middle of the light phase, that is: pineal, -155.82°(CT1023);SCN, -166.30°(CT1054);DR,-179.16°(CT1156)；serum, -186.66°(CT1227)；and lymphocyte, -188.00°(CT1232),respectively. The peaks of MT and the cAMP/cGMP ratio showed an inverse phase relationsh

6、ip. ConclusionThe sequence of the signal transduction betweem the central nuclei and the peripheral lymphocytes could be traced from pineal to SCN, then to DR and serum, and finally to lymphocytes, according to the timepoints at which the peak phase of the cAMP/cGMP rhythms appeared in a circadian d

7、ay.Key wordspineal; central nuclei of suprachiasmatic nucleus; dorsal raphe; lymphocyte; signal transduction; circadian rhythm生物節(jié)律的產(chǎn)生和控制，已知與松果體和某些中樞核團(tuán)(視交叉上核、中縫背核等)密切相關(guān)。松果體合成和分泌的褪黑素(melatonin, MT)具有晝夜節(jié)律性，其變化與環(huán)境中光照信號的周期性變化是同步的。MT的主要功能曾被認(rèn)為是傳遞光照與黑暗的周期性信號，但近年來發(fā)現(xiàn)它對神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的功能具有明顯的調(diào)節(jié)作用1。90年代以來，對免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分

8、泌系統(tǒng)之間的關(guān)系有較多的研究，證實(shí)免疫系統(tǒng)不僅受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)控制，同時(shí)也具有反相調(diào)節(jié)作用。這方面的研究已經(jīng)發(fā)展成為一門新的邊緣學(xué)科，即神經(jīng)免疫內(nèi)分泌學(xué)2。目前在此領(lǐng)域內(nèi)的主要進(jìn)展之一，是中樞系統(tǒng)與外周免疫間的調(diào)節(jié)及其信號傳遞。為了了解在松果體(PN)、中樞核團(tuán)視交叉上核(SCN)和中縫背核(DR)與外周免疫細(xì)胞之間晝夜節(jié)律信息的聯(lián)系和傳遞關(guān)系，本研究以第一信使MT、第二信使環(huán)-磷酸腺苷(cyclic AMP, cAMP)和環(huán)-磷酸鳥苷(cyclic GMP, cGMP)為指標(biāo)，對小鼠中樞核團(tuán)和外周淋巴細(xì)胞信使的晝夜節(jié)律進(jìn)行了測定與分析。1材料和方法1.1主要試劑和材料MT(Sigma公司)和

9、GC-MS衍生化試劑PFPA(Aldrich公司)。其余大部分試劑購自上海試劑公司。昆明種小鼠由本院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。1.2實(shí)驗(yàn)動物分組雄性小鼠體重1822g，隨機(jī)分為12個(gè)組，每組10只。為了使環(huán)境信號對動物的影響標(biāo)準(zhǔn)化，正式實(shí)驗(yàn)開始之前，先使小鼠在穩(wěn)定的人工光照周期(600到1800光照，1800到600黑暗，光強(qiáng)度250350 Lx)和室溫(20±3)下喂養(yǎng)2周，自由活動進(jìn)食。1.3樣品采集與處理采樣在一天中的6個(gè)時(shí)點(diǎn)，即400、800、1200、1600、2000和2400時(shí)進(jìn)行，連續(xù)2天(d)。在每一個(gè)時(shí)點(diǎn)，分別對一組動物斷頭處死，于冰上迅速取出松果體，在0.2mol/L高

10、氯酸溶液中超聲粉碎，3000g離心10min，上清液經(jīng)二氯甲烷振蕩后6000g離心15min，將有機(jī)相以氮?dú)獯蹈伞Ｑ鍢悠诽幚硐嗨?，用于MT測定。為了測定cAMP和cGMP，將松果體、DR和SCN經(jīng)分區(qū)定位取出，置于4緩沖液內(nèi)，勻漿待測。同時(shí)取外周血1 mL，以密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，并通過尼龍纖維柱分離出T淋巴細(xì)胞3。用臺盼藍(lán)清除試驗(yàn)測定T淋巴細(xì)胞存活率(大于95%)，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞并將細(xì)胞數(shù)調(diào)整到1×107個(gè)/mL。1.4MT測定在經(jīng)處理過的樣品中分別加入50L乙酸乙酯和PFPA后振蕩10s，60反應(yīng)45min，冷卻并氮?dú)獯蹈?。MT測定采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)檢(GC-MS)分

11、析4。儀器為GC8000氣相色譜-質(zhì)譜儀(MD800 Masslab Finnigan, USA)。進(jìn)樣前樣品溶于20L的異辛烷，取3L以不分流進(jìn)樣，柱前壓50kPa，進(jìn)樣溫度240。載氣He的流速為50cm/s。1.5cAMP和cGMP測定采用放射免疫測定法5。所用cAMP和cGMP放免分析藥盒由上海中醫(yī)藥大學(xué)同位素室提供。cAMP和cGMP的提取和測定程序按藥盒說明書進(jìn)行。樣品經(jīng)FJ-2008自動免疫計(jì)數(shù)器(西安核儀器廠)測每分鐘計(jì)數(shù)值后，結(jié)果以每毫克核團(tuán)組織或1×106個(gè)淋巴細(xì)胞中cAMP和cGMP的pmol量表示。以上測定均持續(xù)進(jìn)行2個(gè)晝夜周期。1.6統(tǒng)計(jì)分析測定結(jié)果均以均數(shù)

12、±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。對于一組不同時(shí)點(diǎn)的測定值，通過振幅檢驗(yàn)(F檢驗(yàn))確定是否存在晝夜節(jié)律，并對節(jié)律用余弦方程進(jìn)行擬合6：F(t)=M+ACos(t+)式中M為中值，即漲落變化的中線；A為節(jié)律振蕩的振幅，表示上下波動的幅度；為角速度(360°/24 h)；為峰值相位，即振蕩到達(dá)頂峰的時(shí)刻。按照余弦方程可繪出相應(yīng)的余弦曲線。2結(jié)果2.1松果體和血清中MT含量的晝夜節(jié)律1示，小鼠松果體和血清中MT濃度一晝夜的變化規(guī)律。在黑暗中期(2400左右)，松果體和血清中MT濃度達(dá)到峰值，其中松果體峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(594.37±75.72) pg/mg，血清質(zhì)量濃度(峰值)為(117.8

13、5±52.37) ng/L。二者節(jié)律時(shí)相的變化基本一致。1小鼠松果體和血清中MT濃度晝夜變化Fig 1Circadian changes of MT in the pineal and serum of mice2.2松果體、DR和SCN細(xì)胞內(nèi)cAMP和cGMP含量的晝夜節(jié)律對晝夜測定結(jié)果經(jīng)余弦法分析處理后，得到下列節(jié)律參數(shù)(附表)。附表各核團(tuán)組織中cAMP和cGMP含量的晝夜節(jié)律參數(shù)TableParameters of circadian rhythms of cAMP and cGMP in nucleiMesorAmplitudeAcrophasePeak timecAMPPi

14、neal325.1269.57-188.661235SCN251.1643.28-209.341357DR200.4079.81-50.43322cGMPPineal176.4184.13-16.28154SCN54.916.56-101.36648DR123.4640.49-240.9016042.3淋巴細(xì)胞和血清中cAMP和cGMP含量的晝夜節(jié)律對晝夜測定結(jié)果經(jīng)余弦法分析處理后，得到下列擬合的余弦方程：Y(淋巴細(xì)胞，cAMP)=3.90+2.20Cos(t-185.20)Y(血清，cAMP)=2.09+0.27Cos(t-312.74)Y(淋巴細(xì)胞，cGMP)=1.25+0.53Cos(t

15、-18.30)Y(血清,cGMP)=1.62+0.43Cos(t-160.78)2.4中樞核團(tuán)與淋巴細(xì)胞中cAMP和cGMP比值的晝夜節(jié)律將晝夜各時(shí)點(diǎn)cAMP和cGMP的測定值相除，分別得到SCN、DR、松果體以及血清和淋巴細(xì)胞的cAMP/cGMP比值余弦曲線(2，3)。2SCN、DR和松果體cAMP/cGMP比值的晝夜節(jié)律Fig 2Circadian rhythms of cAMP/cGMP ratio in SCN, DR and pineal3淋巴細(xì)胞和血清cAMP/cGMP比值的晝夜節(jié)律Fig 3Circadian rhythms of cAMP/cGMP ratio in lymph

16、ocyte and serum3討論cAMP和cGMP是一對具有雙向調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞信使，曾有人以“陰陽學(xué)說”描述其相互拮抗和制約的生物調(diào)節(jié)作用7。在大多數(shù)組織細(xì)胞中，cAMP與cGMP的峰值和谷值相呈現(xiàn)相互倒置的關(guān)系，即cAMP的峰值相對應(yīng)于cGMP的谷值相，反之亦然。如BALB/c小鼠血漿中cAMP和cGMP的晝夜含量即表現(xiàn)為倒置位相8。由于cAMP和cGMP的功能和細(xì)胞中的濃度節(jié)律具有相反的位相關(guān)系，如果單獨(dú)比較不僅難以分析，而且無法觀察其雙向調(diào)節(jié)的凈效應(yīng)。為此，采用二者的比值，即cAMP/cGMP來描述其晝夜節(jié)律的變化更為合理。本次研究的測定結(jié)果顯示，各組織中cAMP/cGMP比值的晝夜

17、節(jié)律的峰值分別為：松果體，-155.82°(CT1023)；SCN，-166.30°(CT1054)；DR，-179.16°(CT1156)；血清，-186.66°(CT1227)；淋巴細(xì)胞，-188.00°(CT1232)。從峰值位相出現(xiàn)的時(shí)間順序的角度可以看出，由中樞向外周免疫細(xì)胞的晝夜信息傳遞是按松果體SCNDR血液淋巴細(xì)胞的次序進(jìn)行的。對此，還需其他的試驗(yàn)加以證實(shí)。與此相對應(yīng)，第一信使MT的信息傳遞方向也是從松果體血液。不同的是，其晝夜峰值位相在黑暗中期，谷值在光照中期，與cAMP/cGMP比值的節(jié)律位相正好相反。MT被認(rèn)為是主要的時(shí)間

18、生物學(xué)激素9，它可通過其淋巴細(xì)胞上的MT1受體，抑制G蛋白偶聯(lián)并下調(diào)腺苷酸環(huán)化酶，從而降低胞內(nèi)cAMP的濃度。另一方面，MT又可刺激外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生cGMP，因而總的結(jié)果是使cAMP/cGMP的比值下降。一般認(rèn)為，淋巴細(xì)胞內(nèi)cAMP/cGMP比值的變化反映了這一對環(huán)核苷酸的功能狀態(tài)。當(dāng)比值下降時(shí)，具有促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、增加抗體形成和細(xì)胞毒活性，從而上調(diào)免疫功能的作用。反之，在比值升高時(shí)，能抑制細(xì)胞分裂和相應(yīng)的免疫功能，因而對免疫反應(yīng)起負(fù)調(diào)節(jié)作用。近年來在對神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的研究中，已經(jīng)提出免疫神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)之間的重要橋梁物質(zhì)。然而，從細(xì)胞信使晝夜節(jié)律傳導(dǎo)的角度探討中樞核團(tuán)與免疫細(xì)

19、胞間聯(lián)系的研究，文獻(xiàn)中尚未查見。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的MT與cAMP/cGMP間的位相性關(guān)系，提示二者在介導(dǎo)中樞與外周免疫節(jié)律信息的傳遞過程中，可能起著重要的聯(lián)系作用。國家自然科學(xué)基金(39770246)資助作者單位：童建秦立強(qiáng)朱金華蘇州醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，蘇州 215007參考文獻(xiàn)1Morrey KM, McLachlan JA, Serkin CD, et al. Activation of human monocytes by the pineal melatonin. J Immunol, 1994, 153(6):2671-26802Wilder RL. Neuroendocrine-immune system interactions and autoimmunity. Annu Rev Immunol, 1995, 13:307-3383薛彬.免疫毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京：北京醫(yī)科大學(xué) 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1995.7-124Pang SF, Tsa