早老性癡呆疫苗的研究進(jìn)展

1、早老性癡呆疫苗的研究進(jìn)展     【關(guān)鍵詞】  早老性癡呆；疫苗早老性癡呆又稱阿爾茨海默氏?。ˋD)，是一種以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙、行為異常為特征的腦退行性疾病。目前為止，AD的發(fā)病機(jī)制不完全清楚，也沒有很好的藥物治療。大多數(shù)研究者認(rèn)為，淀粉樣蛋白（A）在腦內(nèi)的異常沉積是AD發(fā)病的關(guān)鍵，因此研究如何阻斷和延遲AD患者早期A的聚積以及如何消除已形成的A斑塊沉積成為治療AD的切入點(diǎn)。通過免疫學(xué)的方法減少和清除A可能是治療AD的重要途徑，以A作為免疫原制備疫苗來(lái)干預(yù)已成為治療AD的一個(gè)重要方向，本文介紹AD疫苗研究的最新進(jìn)展。1  疫苗

2、研制的理論基礎(chǔ)    疫苗研制的理論依據(jù)來(lái)源于人們對(duì)AD病因及發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。近年的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境或基因突變導(dǎo)致淀粉樣前體蛋白(APP)代謝異常，在神經(jīng)元細(xì)胞外淀粉樣蛋白沉積，形成早老性斑的中心，并造成神經(jīng)元損傷，大腦發(fā)生萎縮引起癡呆癥。    關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制，目前普遍認(rèn)為是A病因?qū)W說(shuō)。病理上AD表現(xiàn)為在神經(jīng)細(xì)胞之間出現(xiàn)大量的淀粉樣纖維沉積，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，伴有神經(jīng)細(xì)胞的死亡，神經(jīng)突觸和皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞膽堿能受體丟失。A是分泌酶和分泌酶分解APP形成的。A可聚集形成寡聚物以及A衍生的擴(kuò)散配體，它們能快速地、高親和性地與突觸

3、和細(xì)胞膜結(jié)合，引起鈣內(nèi)流和細(xì)胞凋亡1，2。A也誘導(dǎo)脂質(zhì)的過氧化，產(chǎn)生自由基和反應(yīng)氧族，自由基和反應(yīng)氧族可導(dǎo)致細(xì)胞骨架和線粒體的解體，從而引起細(xì)胞凋亡3。A致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用還與它引起的微管相關(guān)蛋白(Tau)蛋白過磷酸化和半胱氨酸蛋白酶(caspase3)的活化有關(guān)。神經(jīng)原纖維纏結(jié)是神經(jīng)元異常集聚形成的不溶性復(fù)合物，主要由過磷酸化的細(xì)胞骨架蛋白Tau蛋白組成。A誘導(dǎo)氧化應(yīng)激可激活一些激酶，這些激酶使微管蛋白磷酸化。由于Tau蛋白過磷酸化，影響Tau蛋白的結(jié)合和穩(wěn)定微管的能力，從而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡4，5。由此可見，A的生成并聚合成纖維沉積，繼而引起神經(jīng)細(xì)胞的損害是AD發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。從

4、理論上分析，如果能抑制A的沉積或促進(jìn)A的清除，有可能阻止AD的進(jìn)展甚至逆轉(zhuǎn)其病理過程，通過免疫學(xué)的方法減少和清除A在腦內(nèi)的沉積可能成為AD治療領(lǐng)域中的一條重要途徑6。2  疫苗的種類2.1  A42多肽疫苗  從老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)中分離出分子量4 200的淀粉樣肽表明它可能是一個(gè)重要的病因?qū)W因素7。105例59歲到109歲的衰老和癡呆癥病人的尸檢結(jié)果表明A與衰老和癡呆密切相關(guān)8。因此最先研制的疫苗是以A蛋白作為免疫原制備的疫苗（Amyloidbeta protein,A42疫苗）。這種疫苗是以合成全長(zhǎng)A142多肽為基礎(chǔ)，它可以刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，通過與A抗原發(fā)

5、生反應(yīng)，激活巨噬細(xì)胞等清除抗原抗體復(fù)合物，從而達(dá)到清除A沉積的目的。Schenk(1999)首次實(shí)驗(yàn)證明用A疫苗免疫轉(zhuǎn)基因AD模型鼠(PDAPP)后，可以阻止6 w齡鼠淀粉樣蛋白的沉積以及神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)不良，對(duì)11 w齡的老年鼠可以明顯縮小AD樣病變范圍和緩解其類似AD的病理過程9。Janus和Morgan等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，A42疫苗減少PDAPP鼠腦內(nèi)老年斑及淀粉樣沉積的同時(shí)，還逆轉(zhuǎn)了認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶障礙等行為上的改變10，11。2002年英國(guó)愛爾蘭公司研制了一種命名為AN1792AD疫苗，期臨床試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)明顯副反應(yīng)，但應(yīng)用于臨床期試驗(yàn)時(shí)，約6%的受試病人出現(xiàn)了腦膜腦炎而終止試驗(yàn)，經(jīng)病理學(xué)證實(shí)腦

6、血管周圍有CD4+或CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，提示與T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，而與病人血清中的抗體水平無(wú)關(guān)12，13。鑒于此，最近有報(bào)道通過阻斷T細(xì)胞應(yīng)答所需的信號(hào)途徑來(lái)降低A多肽疫苗引起的副作用14。     2.2  A短肽疫苗  由于上述A42多肽疫苗可引起T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)性腦膜腦炎，不少學(xué)者研究了A多肽疫苗的結(jié)構(gòu)與免疫原性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)A多肽疫苗具有T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，而引起A多肽疫苗副作用的主要是T細(xì)胞表位。為減輕A多肽疫苗引起的副作用，有學(xué)者通過預(yù)先設(shè)計(jì)抗原表位來(lái)減小細(xì)胞免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。如Kim等以腺病毒載體編碼A

7、16作為免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生了針對(duì)A蛋白的免疫反應(yīng)，與編碼粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子的腺病毒載體同時(shí)給予可產(chǎn)生滴度更高的IgG1抗體，是一種抗炎癥的Th2型反應(yīng)，免疫組化分析免疫小鼠腦內(nèi)無(wú)炎癥相關(guān)的病理改變；該抗體能與腦內(nèi)A老年斑發(fā)生反應(yīng)，證明其有抗體活性，結(jié)果表明這種腺病毒載體編碼的11個(gè)A16連接的肽段是一種更為安全的AD疫苗15。Maier和Lemere設(shè)計(jì)了一種只具有B細(xì)胞表位而無(wú)T細(xì)胞表位的A免疫原，該免疫原在野生鼠和轉(zhuǎn)基因鼠內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗A特異性抗體，但無(wú)A特異性細(xì)胞免疫16，17。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)者選用4種小分子肽免疫原(分別名為R2xA115、2x A15、T1R A115、T1

8、A115)，與突變大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素一起鼻內(nèi)免疫野生鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生了高滴度的抗體；然后用R2x A115或2x A115免疫家族性AD鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生了高滴度的非炎癥性Th2型反應(yīng)(IgG1和IgG2b)，明顯減少了老年斑內(nèi)A的負(fù)荷，降低了腦內(nèi) A的水平，經(jīng)水迷宮等行為實(shí)驗(yàn)證實(shí)2x A115免疫的DAPP鼠的記憶改善與抗A抗體的滴度有關(guān)，提示該免疫原是一種有希望的AD疫苗18。Chackerian 將A短肽免疫原與病毒樣顆粒連接制備的疫苗免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生了A抗體反應(yīng)而無(wú)明顯的T細(xì)胞反應(yīng)19。2007年美國(guó)聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司成功研制了一種位點(diǎn)特異性Th AD治療性疫苗（UBITh），該

9、疫苗選用AN末端114氨基酸短肽作為免疫原，與鋁佐劑和多聚CPG寡核苷酸聯(lián)合使用，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。該研究以健康豚鼠、人APP轉(zhuǎn)基因小鼠、成年雄性狒狒、成年雄性和雌性短尾猴為對(duì)象，體內(nèi)、體外試驗(yàn)多參數(shù)評(píng)價(jià)療效及其安全性。在人APP轉(zhuǎn)基因小鼠的試驗(yàn)中，該疫苗采用肌肉注射，16 w后檢測(cè)到相應(yīng)的抗體，該抗體具有中和A的毒性作用并有助于老年斑中A的清除，被免疫小鼠腦組織病理學(xué)觀察其神經(jīng)病變明顯減輕，未見明顯T細(xì)胞浸潤(rùn)和膠質(zhì)細(xì)胞的激活。另外，在18只猴身上進(jìn)行了急性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明各項(xiàng)生理指標(biāo)及行為正常；無(wú)變態(tài)反應(yīng)；常規(guī)組織學(xué)檢查未見各個(gè)臟器的病理改變；免疫組織化學(xué)檢查腦組織內(nèi)無(wú)CD

10、3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)和激活的膠質(zhì)細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞的增生。體外細(xì)胞免疫試驗(yàn)表明A114免疫原刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖反應(yīng)為陰性，而對(duì)照用A142免疫原為陽(yáng)性。這些研究表明UBITh AD疫苗用于預(yù)防和治療AD是安全有效的20。2.3  A口服疫苗  免疫原進(jìn)入機(jī)體的途徑可影響機(jī)體所產(chǎn)生免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。日本學(xué)者嘗試通過改變免疫途徑來(lái)降低A多肽疫苗的副作用。他們發(fā)現(xiàn)口服腺相關(guān)病毒載體重組疫苗和鼻部給予仙臺(tái)病毒重組的A143/IL10均能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞長(zhǎng)期表達(dá)并向黏膜免疫系統(tǒng)遞呈A蛋白，4 w后鼠血清中抗體水平明顯升高，并能抑制A的聚集，經(jīng)免疫組化分析鼠腦組織A負(fù)荷較對(duì)

11、照組鼠明顯減少，沒有發(fā)現(xiàn)任何器官的炎癥反應(yīng)21。Tabira22也用腺相關(guān)病毒重組A疫苗口服一次，可見抗體產(chǎn)生并維持高滴度達(dá)6個(gè)月之久，在PDAPP鼠和老年猴中顯示A負(fù)荷明顯減少，未觀察到任何副作用。Mouri等23構(gòu)建了重組腺相關(guān)病毒為載體的AcDNA口服疫苗，對(duì)有進(jìn)行性認(rèn)知缺失的Tg2576鼠進(jìn)行免疫，在其10月齡時(shí)一次性給予該疫苗，3個(gè)月后發(fā)現(xiàn)免疫小鼠的認(rèn)知缺失明顯減輕，腦組織內(nèi)A沉積、不溶性A、可溶性A寡聚體以及突觸變性的程度均減少。上述研究提示A疫苗經(jīng)黏膜免疫治療AD是有效的。     2.4  A DNA疫苗  在現(xiàn)代疫苗

12、的研制中，DNA疫苗具有免疫效果好，應(yīng)答持久，有預(yù)防和治療雙重作用，且制備方法簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)被受關(guān)注。近來(lái)有學(xué)者著手研制A DNA疫苗并獲得了明顯療效而沒有副作用24，25。如Qu及其同事采用基因槍將A42基因疫苗直接導(dǎo)入APPswe/PS1DeltaE9轉(zhuǎn)基因鼠，發(fā)現(xiàn)免疫鼠產(chǎn)生了針對(duì)A42的IgG1抗體反應(yīng)，與對(duì)照鼠比，腦內(nèi)A的含量減少了41%，血漿中A增加了43%，在大腦皮質(zhì)和海馬回由A形成的老年斑分別減少了51%和52%，且免疫小鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)明顯低于對(duì)照鼠。用同樣的方法免疫恒河猴也產(chǎn)生了抗A42的抗體。這些結(jié)果提示基因槍介導(dǎo)的A42基因免疫可有效誘導(dǎo)Th2的免疫反應(yīng)，并能減少腦

13、內(nèi)A的水平。與傳統(tǒng)的直接注射A蛋白疫苗相比，ADNA疫苗誘導(dǎo)抗體所需時(shí)間更長(zhǎng)，療效相對(duì)緩和，更為持久26。為了減少A多肽疫苗的副作用，在用A多肽免疫原制備DNA疫苗的基礎(chǔ)上，Movsesyan從A多肽基因中篩選出表達(dá)11個(gè)氨基酸組成的短肽基因，該基因產(chǎn)物具有B細(xì)胞表位特征，將其與一種巨噬細(xì)胞來(lái)源的趨化因子（作為免疫原的分子佐劑）基因融合制備的疫苗，經(jīng)免疫34月齡的3XTgAD鼠，發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的A抗體。該抗體能抑制老年鼠A在腦內(nèi)的沉積，并可減輕神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而防止行為異常，未增加腦微血管出血現(xiàn)象，說(shuō)明此疫苗有一定的安全性和有效性，可進(jìn)一步擴(kuò)大研究對(duì)象深入研究27。ADNA疫苗的

14、研制為AD的疫苗治療開辟了新的途徑。    AD治療的關(guān)鍵是降低A的同時(shí)能達(dá)到安全治療目的，降低腦內(nèi)A沉積從而延緩疾病的進(jìn)展，上述針對(duì)A病因?qū)W說(shuō)而研制的各種A疫苗在這一領(lǐng)域取得了一定進(jìn)展，為治療AD帶來(lái)了希望。但是這種預(yù)防和治療AD的方法需要精心選擇抗原和抗體，以最大限度地提高療效而降低其副作用。目前已有的研究證實(shí)通過免疫學(xué)方法清除A來(lái)預(yù)防和治療AD是可行的，要獲得理想的AD疫苗還需要深入研究A的清除機(jī)制?！娟P(guān)鍵詞】  早老性癡呆；疫苗早老性癡呆又稱阿爾茨海默氏?。ˋD)，是一種以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙、行為異常為特征的腦退行性疾病。目前為止，AD的發(fā)

15、病機(jī)制不完全清楚，也沒有很好的藥物治療。大多數(shù)研究者認(rèn)為，淀粉樣蛋白（A）在腦內(nèi)的異常沉積是AD發(fā)病的關(guān)鍵，因此研究如何阻斷和延遲AD患者早期A的聚積以及如何消除已形成的A斑塊沉積成為治療AD的切入點(diǎn)。通過免疫學(xué)的方法減少和清除A可能是治療AD的重要途徑，以A作為免疫原制備疫苗來(lái)干預(yù)已成為治療AD的一個(gè)重要方向，本文介紹AD疫苗研究的最新進(jìn)展。1  疫苗研制的理論基礎(chǔ)    疫苗研制的理論依據(jù)來(lái)源于人們對(duì)AD病因及發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。近年的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境或基因突變導(dǎo)致淀粉樣前體蛋白(APP)代謝異常，在神經(jīng)元細(xì)胞外淀粉樣蛋白沉積，形成早老性斑的中心，并造成神經(jīng)

16、元損傷，大腦發(fā)生萎縮引起癡呆癥。    關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制，目前普遍認(rèn)為是A病因?qū)W說(shuō)。病理上AD表現(xiàn)為在神經(jīng)細(xì)胞之間出現(xiàn)大量的淀粉樣纖維沉積，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，伴有神經(jīng)細(xì)胞的死亡，神經(jīng)突觸和皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞膽堿能受體丟失。A是分泌酶和分泌酶分解APP形成的。A可聚集形成寡聚物以及A衍生的擴(kuò)散配體，它們能快速地、高親和性地與突觸和細(xì)胞膜結(jié)合，引起鈣內(nèi)流和細(xì)胞凋亡1，2。A也誘導(dǎo)脂質(zhì)的過氧化，產(chǎn)生自由基和反應(yīng)氧族，自由基和反應(yīng)氧族可導(dǎo)致細(xì)胞骨架和線粒體的解體，從而引起細(xì)胞凋亡3。A致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用還與它引起的微管相關(guān)蛋白(Tau)蛋白過磷酸化和半胱氨酸蛋白

17、酶(caspase3)的活化有關(guān)。神經(jīng)原纖維纏結(jié)是神經(jīng)元異常集聚形成的不溶性復(fù)合物，主要由過磷酸化的細(xì)胞骨架蛋白Tau蛋白組成。A誘導(dǎo)氧化應(yīng)激可激活一些激酶，這些激酶使微管蛋白磷酸化。由于Tau蛋白過磷酸化，影響Tau蛋白的結(jié)合和穩(wěn)定微管的能力，從而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡4，5。由此可見，A的生成并聚合成纖維沉積，繼而引起神經(jīng)細(xì)胞的損害是AD發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。從理論上分析，如果能抑制A的沉積或促進(jìn)A的清除，有可能阻止AD的進(jìn)展甚至逆轉(zhuǎn)其病理過程，通過免疫學(xué)的方法減少和清除A在腦內(nèi)的沉積可能成為AD治療領(lǐng)域中的一條重要途徑6。     2  疫

18、苗的種類2.1  A42多肽疫苗  從老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)中分離出分子量4 200的淀粉樣肽表明它可能是一個(gè)重要的病因?qū)W因素7。105例59歲到109歲的衰老和癡呆癥病人的尸檢結(jié)果表明A與衰老和癡呆密切相關(guān)8。因此最先研制的疫苗是以A蛋白作為免疫原制備的疫苗（Amyloidbeta protein,A42疫苗）。這種疫苗是以合成全長(zhǎng)A142多肽為基礎(chǔ)，它可以刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，通過與A抗原發(fā)生反應(yīng)，激活巨噬細(xì)胞等清除抗原抗體復(fù)合物，從而達(dá)到清除A沉積的目的。Schenk(1999)首次實(shí)驗(yàn)證明用A疫苗免疫轉(zhuǎn)基因AD模型鼠(PDAPP)后，可以阻止6 w齡鼠淀粉樣蛋白的沉積

19、以及神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)不良，對(duì)11 w齡的老年鼠可以明顯縮小AD樣病變范圍和緩解其類似AD的病理過程9。Janus和Morgan等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，A42疫苗減少PDAPP鼠腦內(nèi)老年斑及淀粉樣沉積的同時(shí)，還逆轉(zhuǎn)了認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶障礙等行為上的改變10，11。2002年英國(guó)愛爾蘭公司研制了一種命名為AN1792AD疫苗，期臨床試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)明顯副反應(yīng)，但應(yīng)用于臨床期試驗(yàn)時(shí)，約6%的受試病人出現(xiàn)了腦膜腦炎而終止試驗(yàn)，經(jīng)病理學(xué)證實(shí)腦血管周圍有CD4+或CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，提示與T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，而與病人血清中的抗體水平無(wú)關(guān)12，13。鑒于此，最近有報(bào)道通過阻斷T細(xì)胞應(yīng)答所需的信號(hào)途徑來(lái)降低A多肽疫苗引

20、起的副作用14。2.2  A短肽疫苗  由于上述A42多肽疫苗可引起T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)性腦膜腦炎，不少學(xué)者研究了A多肽疫苗的結(jié)構(gòu)與免疫原性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)A多肽疫苗具有T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，而引起A多肽疫苗副作用的主要是T細(xì)胞表位。為減輕A多肽疫苗引起的副作用，有學(xué)者通過預(yù)先設(shè)計(jì)抗原表位來(lái)減小細(xì)胞免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。如Kim等以腺病毒載體編碼A16作為免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生了針對(duì)A蛋白的免疫反應(yīng)，與編碼粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子的腺病毒載體同時(shí)給予可產(chǎn)生滴度更高的IgG1抗體，是一種抗炎癥的Th2型反應(yīng)，免疫組化分析免疫小鼠腦內(nèi)無(wú)炎癥相關(guān)的病理改變；該抗體能與腦內(nèi)A老年斑發(fā)生反應(yīng)，證明其有抗體活性，結(jié)果表明這種腺病毒載體編碼的11個(gè)A16連接的肽段是一種更為安全的AD疫苗15。Maier和Lemere設(shè)計(jì)了一種只具有B細(xì)胞表位而無(wú)T細(xì)胞表位的A免疫原，該免疫原在野生鼠和轉(zhuǎn)基因鼠內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗A特異性抗體，但無(wú)A特異性細(xì)胞免疫16，17。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)者選用4種小分子肽免疫原(分別名為R2xA115、2x A15、T1R A115、T1 A115)，與突變大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素一起鼻內(nèi)免疫野生鼠，