擬apoE對(duì)小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦血管痙攣的治療作用

1、擬apoE對(duì)小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦血管痙攣的治療作用                 【摘要】 目的： 探討新合成的擬載脂蛋白E（apoE）對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）的治療作用及機(jī)制. 方法： 55只C57BL6/JL小鼠隨機(jī)分為： 假手術(shù)組，SAH組，低劑量（SAHapoE1410， 0.6 mg/Kg）組和高劑量（SAHapoE1410， 1.2 mg/Kg）組. 顯微操作戳破右側(cè)大腦中動(dòng)脈(MCA)和大腦前動(dòng)脈(ACA)分叉處造成

2、SAH模型. 術(shù)后30 min開(kāi)始經(jīng)尾靜脈給藥，每12 h一次，連用3 d. 每日檢測(cè)小鼠的一般精神狀態(tài)、神經(jīng)功能評(píng)分、綜合運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分. 術(shù)后第3日測(cè)量MCA直徑. 結(jié)果： 術(shù)后SAH組小鼠精神萎靡，食欲下降，有的難進(jìn)食水，體質(zhì)量下降，死亡率為42.8. 高、低劑量組與SAH組比較，一般癥狀明顯減輕，死亡率分別為14.2和18.8，與SAH組比較，顯著降低（P<0.05）. MCA直徑在假手術(shù)組為（111.3±7.4）m，與SAH 組（55.2±17.8） m比較，平均縮小了59%（P<0.05）；低、高劑量組MCA分別為（91.4±16.4）m和（

3、83.5±13.6）m，與SAH組（55.2±17.8）m比較，MCA痙攣程度下降（P<0.05）. 神經(jīng)功能評(píng)分在SAH組（6.7±1.8）明顯低于假手術(shù)組（21.0±0.0, P<0.05）；高劑量組（10.6±4.8）、低劑量組（10.9±2.6）的神經(jīng)功能評(píng)分分別明顯高于單純SAH組（6.7±1.8, P<0.05）；但在兩個(gè)劑量組間未見(jiàn)差別（P>0.05）. 綜合運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分在SAH組（58.8±25.7）明顯低于假手術(shù)組（272.2±25.7, P<0.05）；高

4、劑量組（95.5±13.2）,低劑量組（95.6±18.5）的綜合運(yùn)動(dòng)能力分別明顯高于單純SAH組（58.8±20.9, P<0.05）. 結(jié)論： 外源性擬apoE對(duì)SAH及腦血管痙攣有一定的治療作用， 其機(jī)制與降低神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)損傷的炎性反應(yīng)有關(guān)，擬apoE有可能? 歡迎您訪問(wèn)擬apoE對(duì)小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦血管痙攣的治療作用 晌瘟芐AH的新措施. 【關(guān)鍵詞】 蛛網(wǎng)膜下腔出血；擬apoE；apoE基因；腦血管痙攣載脂蛋白E（apoliopoprotein E， apoE）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理、病理作用越來(lái)越受到重視. 完整的apoE分子量大，正常狀態(tài)下不能通

5、過(guò)血腦屏障，限制了其作為外源性藥物的治療性應(yīng)用1. 內(nèi)源性apoE或腦室內(nèi)注射apoE全蛋白通過(guò)下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激、抗興奮性氨基酸毒性、直接增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用2擬apoE（133149）是體外重組來(lái)自apoE受體結(jié)合區(qū)的一個(gè)17肽，外源性給藥能透過(guò)血腦屏障，同時(shí)保留了apoE全蛋白的許多特性3-4. 但有關(guān)體外重組apoE片斷用于SAH的治療性研究，目前國(guó)內(nèi)外還少見(jiàn)報(bào)道. 蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）患者腦脊液apoE水平下降，提示apoE與SAH的病理機(jī)制有關(guān)5-6. 本研究采用靜脈給藥，旨在探討擬apoE14

6、10對(duì)實(shí)驗(yàn)性SAH及腦血管痙攣是否具有治療作用.1材料和方法1.1材料擬apoE1410的合成：擬apoE1410， cetylASAibLRKLAibKRLLamide，12肽，分子量：1410D. 由北卡羅來(lái)納州立大學(xué)肽合成實(shí)驗(yàn)室合成. Leica手術(shù)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；顯微手術(shù)用器械，包括彎頭手術(shù)鑷，手術(shù)剪刀，阻血夾及其持器等（瑞士）. 小動(dòng)物呼吸機(jī)，麻醉機(jī)，血?dú)夥治鰞x（美國(guó)Harvard公司）；轉(zhuǎn)棒儀（意大利Ugo Basile公司）；圖像采集及圖像分析系統(tǒng)(加拿大圖像研究公司，型號(hào)MCIDM5)；腦血管灌注裝置，灌注膠（杜克大學(xué)多學(xué)科神經(jīng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)室）.C57BL6/J L雄

7、性小鼠55只，1214 wk. 隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（4只）；SAH（SAH+鹽水）組（21只）；低劑量（SAHapoE1410 ，0.6 mg/kg）組（14只）和 高劑量（SAHapoE1410，1.2 mg/kg）組（16只）. 將小鼠氣管插管，連接呼吸機(jī)，監(jiān)測(cè)血壓、血?dú)夂腕w溫，控制在生理狀態(tài)，顯微手術(shù)戳破大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery，MCA)和大腦前動(dòng)脈(anterior cerebral artery，ACA)分叉處造成SAH模型. 擬apoE1410溶于PBS，經(jīng)尾靜脈注射，SAH術(shù)后30 min開(kāi)始第一次，每12 h 一次，共用3 d，其它兩組只注射

8、生理鹽水.參考文獻(xiàn)7的方法進(jìn)行. 神經(jīng)行為學(xué)主要檢測(cè)動(dòng)物的面、頸部觸覺(jué)，足掌痛覺(jué)，自由活動(dòng)，雙前肢對(duì)稱(chēng)性，攀爬能力，平衡運(yùn)動(dòng)能力等. 檢測(cè)總分為321分. 其中運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)012分，感覺(jué)功能檢測(cè)39分.轉(zhuǎn)棒儀檢測(cè)小鼠左右肢體的協(xié)調(diào)能力、平衡能力、體力與耐力等綜合運(yùn)動(dòng)能力. 該儀器由一根直徑為3 cm的轉(zhuǎn)棒和齒輪傳送系統(tǒng)以及數(shù)顯系統(tǒng)構(gòu)成，在電力推動(dòng)下進(jìn)行加速度轉(zhuǎn)動(dòng)，最高轉(zhuǎn)數(shù)為300轉(zhuǎn)/分. 在手術(shù)前一天上午（分組之前），對(duì)所有小鼠進(jìn)行訓(xùn)練. 將小鼠放置在靜止的轉(zhuǎn)棒上，開(kāi)動(dòng)機(jī)器，開(kāi)始加速度轉(zhuǎn)動(dòng)，小鼠可能會(huì)掉落，重新放回轉(zhuǎn)棒，共重新放回轉(zhuǎn)棒3次. 休息10 min之后，進(jìn)行第2次訓(xùn)練，同樣的訓(xùn)練共進(jìn)

9、行3次. 獲取基數(shù)值：在上午接受3次訓(xùn)練之后，下午取每1只鼠的基數(shù)值. 在轉(zhuǎn)棒靜止?fàn)顟B(tài)，將小鼠輕輕放在轉(zhuǎn)棒上，開(kāi)動(dòng)機(jī)器，開(kāi)始加速度轉(zhuǎn)動(dòng)，記錄小鼠掉落的時(shí)間，或者記錄當(dāng)小鼠四肢抱住轉(zhuǎn)棒，不能走動(dòng)達(dá)到2圈，即360度時(shí)的時(shí)間，單位為秒（s），共測(cè)定3次，每次之間至少間隔10 min，取其均值為手術(shù)前的基數(shù). 訓(xùn)練的目的是讓所有實(shí)驗(yàn)組的小鼠均接受同樣的學(xué)習(xí)訓(xùn)練，每只鼠的基數(shù)雖有微小差別，但可以視為相同. 術(shù)后第2日開(kāi)始，每日進(jìn)行1次，共3 d. 具體? ,擬apoE對(duì)小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦血管痙攣的治療作用(2) 齜肴沒(méi)幣恢?術(shù)后72 h行腦血管灌注，測(cè)量傷側(cè)MCA距與ACA分叉處1.00 mm處的

10、直徑.參考文獻(xiàn)7的方法進(jìn)行. SAH術(shù)后72 h，判定出血等級(jí). 將腦血管鑄型的標(biāo)本放置于生理鹽水中，手術(shù)顯微鏡下放大6倍，進(jìn)行出血等級(jí)的判定. 以出血塊的面積和出血塊的密度為依據(jù)將出血量分為3個(gè)等級(jí). 出血塊面積在距離MCAACA分叉處<1.0 mm為1級(jí)；>1.0 mm 為2級(jí)；>1.0 mm,同時(shí)出血面積超過(guò)了ICA為3級(jí). 出血密度：透過(guò)血塊能觀察到腦實(shí)質(zhì)為1級(jí)；透過(guò)血塊看不到腦實(shí)質(zhì)為2級(jí)；根本無(wú)出血塊者為0級(jí). 綜合出血面積和密度，出血等級(jí)為25級(jí).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示. 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用重復(fù)測(cè)量的

11、方差分析，兩組間比較用Scheffe檢驗(yàn). MCA和神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用KruskalWallis 檢驗(yàn). 出血等級(jí)資料，屬非參數(shù)統(tǒng)計(jì)，用秩和檢驗(yàn). 死亡率用2檢驗(yàn). P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1神經(jīng)功能學(xué)評(píng)價(jià)術(shù)后SAH組小鼠的局部感覺(jué)障礙，表現(xiàn)為患側(cè)對(duì)側(cè)的面部、胡須的觸覺(jué)和耳后皮膚的觸覺(jué)的受損. 患側(cè)對(duì)側(cè)的前肢肌力下降，呈現(xiàn)雙前肢伸直不對(duì)稱(chēng)，用手提起尾巴令其前行時(shí)，向左側(cè)傾斜，甚至向左側(cè)原地轉(zhuǎn)圈. 同時(shí)攀爬能力、平衡能力和本體感覺(jué)等均下降，體力與耐力受損，精神狀態(tài)不佳，食欲下降，難進(jìn)食水，體質(zhì)量減輕等. 神經(jīng)功能評(píng)分SAH組小鼠明顯低于假手術(shù)組（P<0.05

12、）；高、低劑量組明顯高于SAH組（P<0.05，表1）. 綜合運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分SAH組小鼠明顯低于假手術(shù)組（P<0.05）；高、低劑量組明顯高于SAH組（P<0.05）；但在兩個(gè)劑量組間未見(jiàn)差別（P>0.05，表2).表1神經(jīng)功能評(píng)分各組間比較(略)表2綜合運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分各組間比較(略)2.2出血等級(jí)SAH術(shù)后，無(wú)論SAH組還是高、低劑量組小鼠，顱底均有出血，主要圍繞MCA和ACA分叉分布，有的波及到整個(gè)顱底. SAH組（在出血等級(jí)2, 3, 4級(jí)者，分別有2, 4, 6只）與低劑量組（在出血等級(jí)2, 3, 4級(jí)者，分別有2, 4, 6只）和高劑量組（在出血等級(jí)3, 4級(jí)者，

13、分別有6, 7只）三組之間，出血等級(jí)無(wú)差異（秩和檢驗(yàn)，2=0.511, P=0.775）. 出血等級(jí)的判定，可以規(guī)范實(shí)驗(yàn)各組小鼠的出血損傷程度，在各組間出血等級(jí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的前提下，方可進(jìn)行其他數(shù)據(jù)的比較.2.3MCA直徑測(cè)量結(jié)      果高、低劑量組分別與SAH組比較，MCA 直徑均顯著縮小（P<0.05,表3). 表3MCA直徑各組間比較(略)3討論新的擬apoE1410能減輕SAH引起的腦血管痙攣程度，改善SAH的預(yù)后,對(duì)SAH有治療作用. 有研究報(bào)道，連續(xù)腦室內(nèi)注入生理劑量來(lái)自人血漿的apoE或人類(lèi)重組apoE，可部分逆轉(zhuǎn)APOE基因缺陷

14、鼠大范圍的神經(jīng)損傷 8，說(shuō)明外源性腦室內(nèi)注射apoE對(duì)急性腦損傷也有一定的保護(hù)作用. Lynch等 5用重組apoE片斷（133149）經(jīng)鼠尾靜脈注射后5 min，腦內(nèi)apoE含量升高，與給藥濃度呈正相關(guān)，提示重組apoE片斷可以通過(guò)血腦屏障. 同時(shí)發(fā)現(xiàn)apoE（133149）是通過(guò)apoE全蛋白同樣的受體起作用，降低神經(jīng)炎性反應(yīng)，阻斷NMDA造成的細(xì)胞毒性，抗氧化損傷等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用9. 本實(shí)驗(yàn)采用新的體外重組的擬apoE1410短肽，經(jīng)靜脈給藥，發(fā)現(xiàn)高、低劑量組的MCA痙攣程度與SAH組比較有顯著改善，從精神狀態(tài)、神經(jīng)功能評(píng)分和死亡率等綜合效果來(lái)看，apoE1410確實(shí)對(duì)SAH起到了一定

15、的治療作用. apoE1410有可能成為比apoE（133149）療效更好的神經(jīng)保護(hù)藥物. 抗炎癥作用是apoE1410對(duì)SAH的治療作用機(jī)制之一. 內(nèi)源性apoE蛋白的生理機(jī)能之一是降低神經(jīng)膠質(zhì)對(duì)炎癥的反應(yīng) 10，來(lái)自apoE受體結(jié)合區(qū)的擬apoE 17肽（133149）在體外和體內(nèi)均發(fā)揮了抗炎作用 5. 我們推測(cè)擬apoE1410肽對(duì)SAH后腦血管痙攣的緩解和神經(jīng)功能狀態(tài)的改善的作用機(jī)制可能與其抗炎癥作用有關(guān)，進(jìn)而減輕腦血管痙攣，降低了延遲性腦缺血程度，減輕了繼發(fā)性損害. 這些與在臨床上已被證實(shí)的apoE對(duì)其它疾病的預(yù)后有積極作用的報(bào)道相一致 11-12. 當(dāng)然，apoE的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制

16、還有其他許多可能，例如創(chuàng)傷后apoE基因缺失鼠腦抗氧化水平嚴(yán)重降低等11. 有關(guān)apoE的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能是多方面的，尚待深入探討.【參考文獻(xiàn)】1Niskakangas T, Ohman J, Niemela M, et al. Association of apolipoprotein E polymorphism with outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a preliminary studyJ. Stroke, 2001, 32(5):1181-1184.2Aono M, Bennett ER, Kim KS, et

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