異博定增加化療中卵巢癌細胞凋亡的研究

1、    異博定增加化療中卵巢癌細胞凋亡的研究        摘要目的探討異博定對促進化療藥物誘使卵巢癌細胞增加凋亡因子表達的作用。方法從48例首次手術(shù)及17例復(fù)發(fā)卵巢癌患者腹水中提取富含癌細胞的懸液，應(yīng)用三種熒光單克隆抗體P170、CD95及Apo2.7標記，經(jīng)流式細胞儀檢測。結(jié)果應(yīng)用異博定化療后癌細胞CD95及Apo2.7表達含量均高于對照組；異博定對癌細胞P170表達含量無明顯影響；復(fù)發(fā)組癌細胞P170表達含量顯著高于初發(fā)手術(shù)組；化療可使外周血淋巴細胞CD95及Apo2.

2、7表達含量增加。結(jié)論本研究提示異博定具有加強化療藥物增加卵巢癌細胞凋亡的作用，特別是對耐藥性患者具有重要的臨床應(yīng)用價值。關(guān)鍵詞卵巢腫瘤；異博定；凋亡；化學(xué)療法中分類號R737.31；R730.53文獻標識碼B文章編號1005-8664(2000)05-23-03 Study on the synergetic effect of isoptin on induced cellular apoptosis of ovarian carcinoma by chemotherapyYUAN Wei,YIN Ge-ping,CHEN Song-fen,et al.(Jinan Military Gen

3、eral hospital,Jinan 250031.)AbstractObjectiveTo explore the role of calcium antagonist-isoptin on the cellular Mdrl product(P170) and apoptosis of ovarian carcinoma in chemotherapy.MethodsThe ascites cancer cells(ACC)were collected in 48 primary and 17 recurred ovarian cancers,immunologically marked

4、 by three kinds of fluorescent monoantibodies-P170,CD95 and Apo2.7 and then determined by flow cytometry.Resultsisoptin did not affect the P170 expression contents in ACC;The CD95 and Apo2.7 expression contents on ACC were statistically improved in isoptin group than in non-isoptin one(P<0.05);Th

5、e P170 contents were statistically improved in recurred group than that in primary one(P<0.05);The CD95 and Apo2.7 contents of peripheral lymphocyte were also improved in isoptin group.ConclusionsThe calcium antagonist-isoptin obviously improves the apoptotic rate of ACC in ovarian carcinoma in c

6、hemotherapy and has important clinical significance.Key wordsovarian tumor;apoptosis;Chemotherapy;isoptin近年來以順鉑(Pt)為主的聯(lián)合化療已使卵巢癌患者的生存時間明顯延長，但5年生存率卻改變不大，其主要原因就是隨著化療時間的延長，癌細胞對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性1。而某些鈣通道阻滯劑(CPB)例如異博定，為耐藥調(diào)變劑(Adjustor of resistance)，可部分逆轉(zhuǎn)這種耐藥性，增加癌細胞對化療藥物的敏感性2，3。本研究通過對化療前后卵巢癌腹水癌細胞及外周血淋巴細胞(PBL)多藥耐藥

7、基因(Multidrug resistance gene.MDR1)表達產(chǎn)物P糖蛋白(Pgp、P170)和凋亡因子Fas抗原(CD95)及線粒體膜蛋白Apo2.7表達的定量對比研究，并結(jié)合臨床表現(xiàn)，探討異博定對化療藥物誘導(dǎo)癌細胞凋亡因子表達含量增加的作用以及對PBL的影響。材料及方法一、臨床資料：本組48例初發(fā)卵巢癌為我院1995年12月至1998年2月住院患者，有完整的臨床病理資料，應(yīng)用異博定者28例(CPB組)、未用者20例(No-CPB組)。手術(shù)前先行腹腔穿刺抽取腹水50ml(細胞學(xué)檢查均見癌細胞)，并行Pt腹腔灌注，同時抽外周靜脈血2ml(抗凝)，35天后在行減滅術(shù)時又抽腹水及外周靜脈

8、血標本。本組術(shù)后復(fù)發(fā)并出現(xiàn)腹水者17例，再予腹腔化療前及化療后35天抽腹水50ml,化療中應(yīng)用異博定者11例，未用者6例，并觀察1個月后腹水增長量?；熕幬锛爱惒┒ǖ膽?yīng)用主要是Pt(100mg/M體表面積)單獨腹腔灌注，每療程1次，或加用環(huán)磷酰胺靜脈滴注(5mg/kg體重)每日1次共5天和/或阿霉素(1.0mg/m體表面積)靜滴1次。異博定2040mg口服，每日3次。自化療前3日至化療后4日應(yīng)用，用藥期間注意血壓、脈搏及心電變化。研究方法一、特殊試劑：異硫氫酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人單克隆抗體P170和CD95、R-藻紅蛋白(PE)標記的Apo2.7及用于排除免疫標記誤差的羊抗鼠IgG1

9、(作為免疫標記陰性對照)，由法國國際免疫公司生產(chǎn)。淋巴細胞分離液由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所生產(chǎn)。二、外周血淋巴細胞(PBL)的提?。簩?ml抗凝靜脈血加入淋巴細胞分離液2ml，離心(1500r/min,5min)，提取其中淋巴細胞層，再以磷酸緩沖緩(PBS)2ml漂洗，同速離心2次，棄上清液備用4。三、由腹水富集卵巢癌細胞的懸液(ACC)：無菌抽腹水50ml，肝素抗凝，離心(1500r/m,10min)，棄去上清后加入淋巴細胞分離液2ml，同速離心，收取分離液表面細胞，以2ml PBS漂洗離心1次，棄上清后將細胞加于100%：65%的雙層淋巴細胞分離液表面、離心(2500r/m,20min)，

10、吸取65%分離液上界面的細胞即為ACC。取少量細胞涂片，瑞氏染色后光鏡下見異型細胞豐富，雜質(zhì)細胞少。四、單克隆抗體P170、CD95及Apo2.7免疫標記：取4支試管，各加樣品500ul，分別加入P170、CD95及Apo2.7及IgG1工作液20ul，避光室溫下20分鐘。離心(2000r/m,10min)，除上清液后加入PBS 1ml，同速離心1次，棄上清后再加PBS 500ul待檢。五、流式細胞儀檢測：FACScan型流式儀(美國BD公司產(chǎn))，上機收集1萬個細胞，在Macintosh 650型計算機上用Cellquest Plot軟件(BD公司生產(chǎn))分析數(shù)據(jù)，打印結(jié)果。統(tǒng)計方法用t檢驗，P

11、170、CD95及Apo2.7含量均以陽性細胞百分率表示5。結(jié)果表1腹腔化療前后PBL凋亡因子表達含量(±SD)分組例化療前含量化療后含量CD95(%)Apo2.7(%)CD95(%)Apo2.7(%)CPB組280.36±0.310.22±0.140.88±0.54*0.40±0.24非CPB組201.34±0.280.24±0.170.78±0.490.39±0.29注：?P<0.05(均與同種凋亡因子比較) 表2兩組化療前后腹水中P170凋亡因子表達含量(±SD).分組P170(%)

12、CD95(%)Apo2.7(%)化療前化療后化療前化療后化療前化療后CPB組3.57±2.173.74±2.142.18±0.778.74±3.26?1.46±0.569.77±3.14?非CPB組3.33±2.483.40±2.602.31±0.574.45±2.16?1.22±0.713.76±1.32?注：?P<0.05，?P<0.01(均與同種凋亡因子比較) 表3復(fù)發(fā)組化療前后腹水中P170凋亡因子表達含量(±SD).分組例P170(%)CD95

13、(%)Apo2.7(%)化療前化療后化療前化療后化療前化療后CPB組115.42±3.115.97±3.141.79±0.707.41±3.40?1.17±0.566.17±2.57?非CPB組66.34±3.166.88±3.501.86±0.603.27±2.16?0.93±0.411.91±1.32注：?P<0.05，?P<0.01(均與同種凋亡因子比較) 討論多藥抗藥性的癌細胞可以過度表達了位于細胞表面的P170糖蛋白，后者屬鈣通道性質(zhì)，它在鈣離子參與下能

14、加快化療藥物從細胞內(nèi)的外泄，是癌細胞自身保護的重要機制6。細胞凋亡(Apoptosis)是細胞程序性死亡，與腫瘤細胞的生長、發(fā)展密切相關(guān)，是研究抗癌藥物對腫瘤治療敏感性非常重要的一項指標7。細胞表面分子CD95(又稱Fas因子和Apo-1)屬腫瘤壞死因子家族8。Apo2.7抗原位于細胞線粒體膜上9。兩種抗原的出現(xiàn)均可以反映細胞凋亡。有實驗證實，多種抗癌藥物使癌細胞消退是通過細胞凋亡機制，如順鉑及阿霉素等10。故應(yīng)用抗癌藥物等有效手段誘導(dǎo)并促進癌細胞凋亡是腫瘤治療十分有價值的課題。目前的研究認為卵巢癌5年生存率改觀不大的主要障礙是在例行的化療過程中癌細胞逐漸產(chǎn)生了多藥抗藥性，故研究能夠促進化療療

15、效的措施意義重大。以往此類報告多見對癌細胞株的實驗研究。本文從卵巢癌腹水中提取出癌細胞探討在CPB參與下的化療對癌細胞凋亡程度的影響，有更直接的臨床意義。異博定主要通過阻滯鈣通道，使P170功能減退或失活，從而提高癌細胞內(nèi)抗癌藥物濃度，減弱了癌細胞對化療藥物抵抗性，增加了化療療效。從本文結(jié)果看，應(yīng)用異博定并未減少癌細胞之P170含量，但可顯著性加強化療藥物對癌細胞的凋亡作用。這可能是使P170的功能不能發(fā)揮，復(fù)發(fā)組癌細胞之P170含量比初發(fā)手術(shù)時明顯增加，提示復(fù)發(fā)組在數(shù)療程化療后，癌細胞多藥抗藥性的增加。此組未用異博定輔助化療者，僅見CD95含量增高，而應(yīng)用者，則見CD95及Apo2.7含量均

16、明顯增加，有顯著性意義。另外，從對復(fù)發(fā)組腹腔化療的近期療效看，異博定組對腹水增長的抑制程度也好于非-CPB組，提示在復(fù)發(fā)患者腹腔化療同時應(yīng)用異博定的作用較好。腹腔化療中，應(yīng)用異博定組外周血淋巴細胞CD95含量較未應(yīng)用組增加，雖無顯著性差異，但提示在應(yīng)用異博定過程中，應(yīng)注意保護機體免疫功能。作者簡介：袁瑋(1970-)，女，山東聊城人，學(xué)士，主治醫(yī)師，從事婦科腫瘤專業(yè)。陳誦芬(1942-)，女，北京人，碩士生導(dǎo)師，教授，從事婦科腫瘤專業(yè)。袁瑋(濟南軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科山東濟南 250031)尹格平(濟南軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科山東濟南 250031)陳誦芬(濟南軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科山東濟南 250031)孫曉明

17、(濟南軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科山東濟南 250031)陳銘(濟南軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科山東濟南 250031)參考文獻1Nooter K.Multidrug resistance (mdr) genes in human cancerJ.Br J Cancer,1991;63:663-669.2Yang LY,Trujillo JM,Siciliano MJ,et al.Distinct P-glycoprotein expression in the two subclones simultaneously selected from a human colon carcinoma cell line b

18、y cis-diaminodichloroplatium (II).J.Int J Cancer 1993;53:478-81.3梁正來，卞度宏.卵巢癌細胞對順鉑耐藥及其逆轉(zhuǎn)的實驗研究J.中華婦產(chǎn)科雜志，1996；3(2)：75-78.4尹格平，陳誦芬，孫曉明等.卵巢癌組織及外周血淋巴細胞多藥耐藥基因表達蛋白的定量研究J.中華婦產(chǎn)科雜志，1998；33(5)：287-289.5孫曉明，尹格平.實體瘤組織細胞粘附分子流式細胞研究方法的建立J.中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1997；20(1)：9-11.6Aros S,Suwa H,Mandai M,et al.Expression of multidrug resis