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1、RT-qPCR比較不同樣本中miR-21的相對(duì)表達(dá)差異一、試驗(yàn)?zāi)康?1、把握實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試驗(yàn)原理。2、把握實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量的分析方法。二、試驗(yàn)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 結(jié)合染料 SYBR Green 的非特異性方法和 Taqman 水解探針的特異性方法。本試驗(yàn)中接受非特異性 SYBR Green I 染料法 ,SYBR Gre
2、en I 是一種結(jié)合于全部 ds DNA 雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料,在游離狀態(tài)下會(huì)發(fā)出微弱的熒光,但一旦與雙鏈 DNA 結(jié)合后,熒光大大增加。因此, SYBR Green I 的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關(guān),可以依據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。三、試驗(yàn)儀器、材料和試劑 試驗(yàn)儀器:PCR儀、熒光定量PCR儀 試驗(yàn)材料:MCF7細(xì)胞 試驗(yàn)試劑:逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GREEN試劑盒四、 試驗(yàn)步驟 4.1 MCF7細(xì)胞RNA提取(RNAiso Plus)1) 將生長(zhǎng)至80%的MCF細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液,預(yù)備提取RNA;2) 9000g,2min離心
3、,棄掉培育基,加1 ml RNAiso Plus用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無(wú)明顯沉淀,室溫(15-30)靜置5分鐘;3) 加入氯仿(RNAiso Plus的1/5體積量),蓋緊離心管蓋,混合至溶液乳化呈乳白色,室溫靜置5min;4) 12,000 g 4離心15分鐘。從離心機(jī)中當(dāng)心取出離心管,此時(shí)勻漿液分為三層,即:無(wú)色的上清液(含RNA)、中間的白色蛋白層(大部分為DNA)及帶有顏色的下層有機(jī)相。5) 吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中(切勿吸出白色中間層)。6) 向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus體積的異丙醇,上下顛倒離心管充分混勻后,室溫下靜置10分鐘。7) 12,000g
4、4離心10分鐘。一般在離心后,試管底部會(huì)消滅RNA沉淀。 8) 棄上清,加入1ml DEPC水配制的75%乙醇,充分洗滌管蓋和管壁,并輕彈管底,讓沉淀浮起來(lái),并靜置3-5 min;9) 打開(kāi)離心管蓋,室溫干燥沉淀幾分鐘。沉淀干燥后,加入適量(可以依據(jù)沉淀的多少確定)的RNase-free 水溶解沉淀。 測(cè)濃度,記錄A260/280。4.2 1%瓊脂糖凝膠電泳(取少部分進(jìn)行跑電泳,留足夠的量做反轉(zhuǎn)錄)4.3 反轉(zhuǎn)錄試劑體積(10l )RNA500 ngGene specific primers(2M)RT primer1l5×ReverseTranscriptase M-MLV Buf
5、fer2ldNTP (10mM)0.5lReverse Transcriptase M-MLV0.5lInhibitor (40 U/l)0.5lRNase-Free WaterUp to 10l反應(yīng)條件:溫度:42,45min;70,15min.4.4 qPCR試劑體積(20l )2×SYBR Green10lFP (10l)0.5lRP(10l)0.5lcDNA Template1lRNase-free Water8l反應(yīng)程序:1) stage 1:預(yù)變性,95,3min;2) Stage 2:循環(huán)反應(yīng):40個(gè)循環(huán) 95,10s; 60,30s3)溶解曲線:95 ,15 s;60
6、,1 min;95 ,15 s.五試驗(yàn)結(jié)果及分析5.1 RNA的質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果ng/ul260/280260/230497.31.852.055.2 擴(kuò)增曲線:5.3 溶解曲線:如圖,為單一的峰,說(shuō)明無(wú)非特異性產(chǎn)物,定量精確。5.4 試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理PCR 反應(yīng)結(jié)束后,得到如下數(shù)據(jù):Sample NameTarget NameReporterC C Mean MCF7miR21SYBR16.9795360616.97576142MCF7miR21SYBR16.97027779MCF7miR21SYBR16.9774704MCF7miR-130bSYBR22.8020000522.7557907
7、1MCF7miR-130bSYBR22.7244873MCF7miR-130bSYBR22.74088478MCF7GAPDHSYBR13.841777813.65600618 MCF7GAPDHSYBR13.54553699MCF7GAPDHSYBR13.58070374注:平行樣的 Ct 值之間的差<0.5 時(shí)表示重復(fù)性較好計(jì)算如下:CT(miR21)= 3.319755236CT(miR130b)= 9.099784533CT= CT(miR21)- CT(miR130b) =-3.319755236-9.099784533=-5.7800292972CT=2-(-5.780029
8、297)= 0.0181985927miR21的表達(dá)量是miR130b的0.0181985927倍六問(wèn)題與思考1.設(shè)計(jì)本次試驗(yàn)miR-21和miR-130b的RT-qPCR引物?miR21: TAGCTTATCAGACTGATGTTGA莖環(huán)引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA F Primer: AGCGTAGCTTATCAGACTGATGTTG R Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATTC(通用引物)引物Blast 結(jié)果:miR130b:CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT莖環(huán)引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGCCCF Primer: CAGTGCAATGATGAAAGGGCAR Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATTC(通用引物)引物Blast 結(jié)果:2. 熒光定量PCR與一般PCR有什么異同點(diǎn)?原理不同:熒光定量PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與DNA結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光;一般PCR通過(guò)檢測(cè)插入DNA中核酸染料的量來(lái)測(cè)定PCR最終產(chǎn)物量,一般是紫外光。反應(yīng)要求不同:熒光定量對(duì)擴(kuò)增片段有較高的要求,一般為100-300bp;一般定量可以擴(kuò)增長(zhǎng)點(diǎn)
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