熒光定量實驗報告(作業(yè))

1、RT-qPCR比較不同樣本中miR-21的相對表達差異一、試驗目的 1、把握實時熒光定量PCR的試驗原理。2、把握實時熒光定量PCR相對定量的分析方法。二、試驗原理實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。熒光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 結(jié)合染料 SYBR Green 的非特異性方法和 Taqman 水解探針的特異性方法。本試驗中接受非特異性 SYBR Green I 染料法 ，SYBR Gre

2、en I 是一種結(jié)合于全部 ds DNA 雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料，在游離狀態(tài)下會發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈 DNA 結(jié)合后，熒光大大增加。因此， SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關，可以依據(jù)熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。三、試驗儀器、材料和試劑 試驗儀器：PCR儀、熒光定量PCR儀 試驗材料：MCF7細胞 試驗試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GREEN試劑盒四、 試驗步驟 4.1 MCF7細胞RNA提取（RNAiso Plus）1) 將生長至80%的MCF細胞消化為單細胞懸液，預備提取RNA；2) 9000g,2min離心

3、，棄掉培育基，加1 ml RNAiso Plus用移液槍反復吹吸直至裂解液中無明顯沉淀，室溫（15-30）靜置5分鐘；3) 加入氯仿（RNAiso Plus的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，混合至溶液乳化呈乳白色，室溫靜置5min；4) 12,000 g 4離心15分鐘。從離心機中當心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：無色的上清液（含RNA）、中間的白色蛋白層（大部分為DNA）及帶有顏色的下層有機相。5) 吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切勿吸出白色中間層）。6) 向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10分鐘。7) 12,000g

4、4離心10分鐘。一般在離心后，試管底部會消滅RNA沉淀。 8) 棄上清，加入1ml DEPC水配制的75%乙醇，充分洗滌管蓋和管壁，并輕彈管底，讓沉淀浮起來，并靜置3-5 min；9) 打開離心管蓋，室溫干燥沉淀幾分鐘。沉淀干燥后，加入適量(可以依據(jù)沉淀的多少確定）的RNase-free 水溶解沉淀。 測濃度，記錄A260/280。4.2 1%瓊脂糖凝膠電泳（取少部分進行跑電泳，留足夠的量做反轉(zhuǎn)錄）4.3 反轉(zhuǎn)錄試劑體積（10l ）RNA500 ngGene specific primers(2M）RT primer1l5×ReverseTranscriptase M-MLV Buf

5、fer2ldNTP (10mM)0.5lReverse Transcriptase M-MLV0.5lInhibitor (40 U/l)0.5lRNase-Free WaterUp to 10l反應條件：溫度：42，45min;70，15min.4.4 qPCR試劑體積（20l ）2×SYBR Green10lFP (10l)0.5lRP(10l)0.5lcDNA Template1lRNase-free Water8l反應程序：1） stage 1：預變性，95，3min;2） Stage 2:循環(huán)反應：40個循環(huán) 95，10s; 60，30s3）溶解曲線：95 ，15 s；60

6、，1 min；95 ，15 s.五試驗結(jié)果及分析5.1 RNA的質(zhì)量檢測結(jié)果ng/ul260/280260/230497.31.852.055.2 擴增曲線：5.3 溶解曲線：如圖，為單一的峰，說明無非特異性產(chǎn)物，定量精確。5.4 試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理PCR 反應結(jié)束后，得到如下數(shù)據(jù)：Sample NameTarget NameReporterC C Mean MCF7miR21SYBR16.9795360616.97576142MCF7miR21SYBR16.97027779MCF7miR21SYBR16.9774704MCF7miR-130bSYBR22.8020000522.7557907

7、1MCF7miR-130bSYBR22.7244873MCF7miR-130bSYBR22.74088478MCF7GAPDHSYBR13.841777813.65600618 MCF7GAPDHSYBR13.54553699MCF7GAPDHSYBR13.58070374注：平行樣的 Ct 值之間的差<0.5 時表示重復性較好計算如下：CT(miR21)= 3.319755236CT(miR130b)= 9.099784533CT= CT(miR21)- CT(miR130b) =-3.319755236-9.099784533=-5.7800292972CT=2-(-5.780029

8、297)= 0.0181985927miR21的表達量是miR130b的0.0181985927倍六問題與思考1.設計本次試驗miR-21和miR-130b的RT-qPCR引物？miR21: TAGCTTATCAGACTGATGTTGA莖環(huán)引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA F Primer: AGCGTAGCTTATCAGACTGATGTTG R Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATTC（通用引物）引物Blast 結(jié)果：miR130b：CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT莖環(huán)引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGCCCF Primer: CAGTGCAATGATGAAAGGGCAR Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATTC（通用引物）引物Blast 結(jié)果：2. 熒光定量PCR與一般PCR有什么異同點？原理不同：熒光定量PCR實時監(jiān)測與DNA結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光；一般PCR通過檢測插入DNA中核酸染料的量來測定PCR最終產(chǎn)物量，一般是紫外光。反應要求不同：熒光定量對擴增片段有較高的要求，一般為100-300bp；一般定量可以擴增長點