影響豬卵母細胞體外成熟的相關因素

1、影響豬卵母細胞體外成熟的相關因素張 莉，馮書堂（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，基因與細胞工程研究室，北京 100094）摘要：卵母細胞是胚胎工程和發(fā)育生物學的重要組成部分，它是體外受精、性別控制、克隆及轉(zhuǎn)基因等技術(shù)成功與否的前提和關鍵。影響豬卵母細胞體外成熟的因素很多，本文將從物理因素和化學因素兩方面作簡要綜述。關鍵詞：豬；卵母細胞；體外成熟；物理因素；化學因素Factors with in vitro Maturation of Porcine OocytesZHANG Li，F(xiàn)ENG Shu-tang（Department of Gene and Animal Cell Enginee

2、ring, Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094）Abstract: Oocyte in vitro maturation plays an important role in embryonic engineering such as in vitro fertilization, nuclear transfer, sex control, cloning and gene transfer. The in vitro maturation of porcin

3、e oocytes is the crucial step and precondition in embryo production. It is affected by various factors. In this study, physical and chemical factors in vitro maturation of porcine oocytes are discussed. Key words: Porcine; Oocyte; in vitro maturation; Physical factors; Chemical factors豬胚胎工程已極大地推進了畜牧

4、業(yè)和醫(yī)學的進程，通過它可以改良品種、培育抗病豬種、提高肉質(zhì)、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬或基因組修飾豬、制備人類疾病模型、進行器官移植、生產(chǎn)藥物蛋白、研究發(fā)育機理等。卵母細胞體外成熟是胚胎工程和發(fā)育生物學的重要組成部分，是胚胎體外生產(chǎn)的上游環(huán)節(jié)，其質(zhì)量的優(yōu)劣和成熟率很大程度上決定了后期的結(jié)果。體外卵母細胞無論是成熟還是受精后支持發(fā)育的能力都比體內(nèi)差，這說明體外成熟培養(yǎng)環(huán)境還遠未達到體內(nèi)的生理水 平1。影響豬卵母細胞體外成熟的因素很多，本文擬通過綜述物理因素和化學因素，以期和同行們共同探討，摸索豬卵母細胞體外成熟的最佳培養(yǎng)體系和條件，為豬胚胎工程提供技術(shù)。1 物理因素1.1 卵巢來源豬的品種、年齡及健康狀況豬的

5、品種、年齡及健康狀況不同，其卵母細胞的質(zhì)量和體外成熟培養(yǎng)的效果亦不同。一般來講，不同國家和地區(qū)，豬種之間都會存在因遺傳背景、特定的氣候條件、飼養(yǎng)環(huán)境及方式和營養(yǎng)水平的不同而造成品種品質(zhì)上的差異，從而導致卵母細胞質(zhì)量的差異2。而從同一品種豬抽取不同豬的卵泡卵母細胞，其培養(yǎng)效果也會因為各個豬的年齡、健康狀況、卵巢形態(tài)的不同而不同。比如，處在育齡盛期的健康成年母豬，其卵巢體積大，有黃體，顏色也較深，卵巢表面卵泡多而且直徑在36 mm的卵泡所占比例相對較高，抽得的卵母細胞形態(tài)完好，裸卵少，體外成熟培養(yǎng)效果也好。反之，取自仔豬、青年豬、老母豬及老弱病殘豬的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)效果較差。1.2 卵巢離體時

6、間通常情況下，卵巢離體時間越短越好，也就是盡可能及早地將卵母細胞抽出進行培養(yǎng)，目前比較公認的卵巢離體時間應在34 h之內(nèi)。但實際上，因為各種主觀和客觀因素的限制，卵巢離體時間往往超過3 h以上，這就使卵母細胞的生存環(huán)境受到一定的應激，從而影響其進一步發(fā)育。文國藝等報道3，母豬卵巢離體時間的長短直接影響卵母細胞的體外成熟及卵裂率，卵裂率將隨著卵巢離體時間的增加呈降低的趨勢。 1.3 卵巢回收溫度不同于其它哺乳動物，豬卵子對溫度特別敏感，如果送回實驗室的卵巢溫度過高或過低，都會影響卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)效果，一般比較適宜的卵巢送達溫度范圍是3235。夏季室內(nèi)外溫度都較高，因此溫度相對容易控制；但冬

7、季的晝夜溫差大，室內(nèi)外溫度也較低，因此，卵巢溫度的控制就顯得尤為重要。文國藝研究了卵巢保存溫度對豬體外受精的影響3，發(fā)現(xiàn)當卵巢回收溫度低于25，豬的卵母細胞將受到低溫應激；溫度還將通過影響豬卵母細胞的體外成熟繼而影響到體外受精，當卵巢回收溫度為3639、2528、1417時，豬體外受精的卵裂率分別為52.3%、49.8%、28.8%。1.4 卵巢的質(zhì)量及卵泡的大小采自不同或相同卵巢上卵泡的大小都不一樣，目前將卵巢卵泡按直徑大小分成3類：3 mm以下、36 mm和6 mm以上。幾乎所有的試驗都表明來自直徑36 mm的卵泡中卵母細胞的形態(tài)最好，培養(yǎng)效果也最好。1.5 豬卵母細胞體外培養(yǎng)體系 體外培

8、養(yǎng)條件 不同動物卵母細胞體外成熟所需的最適濕度、溫度和氣相都不盡相同。目前，豬卵母細胞體外培養(yǎng)條件大多采用3839，5% CO2，飽和濕度。當然，也可根據(jù)不同的試驗設計來調(diào)整某些指標。 卵母細胞的選擇 形態(tài)良好的卵母細胞被顆粒細胞完整包被，其成熟率隨顆粒細胞包被層數(shù)的增加而增加。因此，卵丘細胞的完整性對卵母細胞體外成熟具有重大意義。絕大多數(shù)實驗室在進行豬卵母細胞體外成熟試驗時，除非從卵母細胞的形態(tài)方面做對比，一般都選擇卵母細胞胞質(zhì)均勻、卵丘致密的卵母細胞，因為卵母細胞胞質(zhì)不均勻和卵丘細胞少的卵母細胞在培養(yǎng)后退化很嚴重。佐騰英明4認為，擴展的卵丘細胞能調(diào)節(jié)物質(zhì)的通透性，誘捕卵母細胞排出的有害物質(zhì)

9、，從而有效地抑制卵母細胞的死亡和退化。研究表明，卵泡直徑>6 mm的卵泡和卵泡直徑在36 mm的卵泡中的卵母細胞更易于成熟和排出第一極體，但在卵泡直徑>8 mm的卵泡中有些卵母細胞有嚴重退化的現(xiàn)象5。此外，在牛的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中，Sirard6得出卵泡直徑>6 mm的卵泡卵母細胞的成熟率低于卵泡直徑在36 mm的卵泡卵母細胞的成熟率。因此，在進行豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的試驗中，一般都選用卵泡直徑在36 mm的卵泡卵母細胞，這也是目前眾多學者一致認同的。 成熟培養(yǎng)時間 不同動物卵母細胞體外成熟培養(yǎng)所需的時間也不同，多數(shù)哺乳動物的卵母細胞體外成熟的培養(yǎng)時間通常在2224 h

10、，而豬卵母細胞比較特殊，通常需要48 h左右才能達到核成熟，在24 h的核成熟率幾乎為零。Yoshida7認為豬卵母細胞體外培養(yǎng)時間不能低于30 h，30 h之前成熟率隨培養(yǎng)時間增加而迅速上升，30 h后成熟率隨培養(yǎng)時間增加而緩慢上升，豬卵母細胞培養(yǎng)36 h和42 h的成熟率無顯著差異，但顯著低于46 h的成熟率。Sosnowki等8研究了不同培養(yǎng)時間對豬卵母細胞體外成熟的影響，發(fā)現(xiàn)4048 h培養(yǎng)與3036 h培養(yǎng)成熟率差異顯著（92.2% vs 61%），但是通過染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的增加，染色體異常率有所增加，這是一個不可避免的矛盾。此外，體外培養(yǎng)4872 h雖可獲得較高的成

11、熟率，但大部分成熟卵母細胞已處于退化階段。因此，在保證一定核成熟率的前提下，有必要縮短豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)時間。世界首例轉(zhuǎn)基因克隆豬的成熟培養(yǎng)時間選擇4446 h（Lai Liangxue et al，2002）。本實驗室采用4244 h作為豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的適宜時間。 2 化學因素2.1 激素激素是哺乳動物卵母細胞成熟的重要物質(zhì)，它們在體內(nèi)調(diào)節(jié)卵母細胞成熟的作用機理研究得比較多。目前，大多數(shù)實驗室在豬的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中，都添加促性腺激素或類固醇激素或兩者的混合物，在體外成熟培養(yǎng)過程中，不同階段可能有不同的激素需要。 促性腺激素的影響 卵母細胞的成熟往往伴隨卵泡的成熟，卵子的成

12、熟要受到促性腺激素和性腺激素的影響，但卵子在體外可以不受內(nèi)分泌的影響而達到成熟。促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）是參與卵泡發(fā)生的最主要的蛋白質(zhì)激素，它們與顆粒細胞、內(nèi)膜細胞上的受體結(jié)合并激活cAMP（環(huán)腺苷酸）系統(tǒng)，提高細胞中參與類固醇合成的一系列酶的活性，導致類固醇激素尤其是雌二醇（E2）的合成及其在血液與卵泡液中濃度的增加，從而促進卵泡卵母細胞的生長和發(fā)育。在以往的試驗中，科研工作者通過在培養(yǎng)液中添加促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）來促進卵母細胞的成熟，后來又用PMSG和hCG代替，都得出了它們能提高卵母細胞成熟率的結(jié)果。FSH或LH或兩者的混合物能促進卵母細胞體外成熟。Brack

13、ett等在1988年首次提出在卵母細胞培養(yǎng)基中加入LH能促進卵母細胞體外成熟并能促進其以后的體外受精及胚胎的體外發(fā)育，同年Zhang9也得到了相同的結(jié)果。國內(nèi)旭日干10研究表明，添加LH或hCG，受精率和卵裂率明顯高于未添加者，但無顯著差異。Funahashi、孟慶剛、蔡令波等研究表明，含有PMSG的成熟培養(yǎng)液可同時誘導豬卵母細胞的核成熟和卵丘細胞的擴散1113。許多試驗還表明在培養(yǎng)液中添加激素可以提高卵母細胞核成熟，排出第一極體。 類固醇激素的影響 在體外成熟培養(yǎng)中，雌二醇對卵母細胞的影響結(jié)果不盡相同,能否對卵母細胞的成熟具有促進作用仍有爭議。雌二醇有利于人卵母細胞的胞質(zhì)成熟14，但在許多其

14、它動物的研究結(jié)果并非如此，在FSH存在的情況下，E2的添加并不能促進牛卵母細胞的成熟15。江金益16也認為雌二醇對卵母細胞體外成熟的作用優(yōu)于促性腺激素。在豬卵母細胞的體外培養(yǎng)中，在前24 h添加促性腺激素和雌二醇，后24 h去除激素，不但能提高卵母細胞的成熟率，而且有利于卵母細胞的受精和發(fā)育17,18。 生長因子 研究表明，發(fā)育卵泡中存在多種促生長因子及其受體，它們同時影響卵膜細胞和顆粒細胞的增殖和分化，并參與調(diào)節(jié)卵母細胞的成熟。顆粒細胞一旦開始增殖分化，就分泌大量的細胞因子, 如表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、酸性成纖維細胞生長因子（aFGF）、胰島素樣生長因子（

15、IGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、白細胞介素（IL）、神經(jīng)生長因子（NGF）、干擾素-r（LFN-r）、抑制素和活化素等19，這些因子對卵母細胞的生長起決定作用。在豬的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中，使用較為廣泛的是表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等。EGF廣泛存在于人和動物的尿液、乳汁和血漿中。它是具有多功能效應的一個很強的促細胞分裂因子，可刺激多種細胞在體內(nèi)和體外的增殖作用，在刺激靜止細胞進入S期的同時，伴隨著糖的運輸、陽離子的流動、氨基酸的轉(zhuǎn)移增加等多種生物學效應。現(xiàn)已證實，EGF能誘導豬卵母細胞卵丘膨脹和促進核成熟20。Abeydeera

16、21的研究試驗表明，EGF能促進卵母細胞成熟過程中蛋白質(zhì)的合成，提高卵母細胞質(zhì)的質(zhì)量，添加EGF培養(yǎng)成熟的卵母細胞受精后的發(fā)育能力更強。TGF-在結(jié)構(gòu)和功能上與EGF相似，它也可以和EGF受體結(jié)合，可以誘導豬卵丘細胞擴散，促進卵母細胞核成熟22。IGF對細胞具有促分裂、分化、促代謝和抗凋亡等生物學功能。IGF-1是一個獨特的既能刺激生長又能促進分化的多肽，是具有多種生理功能的生長因子，它同樣能促進豬卵母細胞的體外成熟，而且能增加所得胚胎的發(fā)育能力23。胰島素在高濃度時可以結(jié)合IGF-1的受體，也可以增加豬體外成熟卵母細胞的受精率和卵裂率。NGF是一種能促進某些神經(jīng)細胞存活的可溶性多肽，在正常神

17、經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化及維持神經(jīng)原特殊功能中具有重要作用，它能使感覺神經(jīng)節(jié)及交感神經(jīng)節(jié)數(shù)目增加，體積增大，能促進觸突延伸，誘導產(chǎn)生細胞分化表型。NGF也是卵母細胞成熟過程中的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，它對卵母細胞核、質(zhì)成熟的促進作用目前還未證實，但它能影響豬卵母細胞成熟的動力學，加快進入M期的速度。此外，PDGF也是一種較強的促有絲分裂因子。已被證實，大多數(shù)二倍體細胞在增殖過程中需要PDGF，特別是在靜止細胞被刺激進入增殖的過程中。PDGF與EGF在卵母細胞體外成熟能明顯提高卵泡的形成，能提高卵裂率和桑椹胚的形成。VEGF是一種特殊的細胞分裂劑和潛在的血管分化因子，可以促進內(nèi)皮細胞的增生、促進細胞的遷徙以及

18、抑制細胞凋亡并提高血管的通透性和微血管對大分子物質(zhì)的通透性。VEGF能顯著提高卵丘細胞的擴展，影響卵母細胞的核和質(zhì)成熟，促進卵母細胞的體外成熟，并由此導致體外受精率和促進胚胎的發(fā)育。2.2 抑制或促進卵母細胞成熟的兩種因子 卵母細胞成熟抑制因子（OMI） OMI是指卵泡液中能夠抑制卵母細胞成熟的物質(zhì)。卵泡液中的OMI可能包括一些低分子量的熱穩(wěn)定多肽、環(huán)腺苷酸或卵巢固醇類物質(zhì)24?，F(xiàn)已證實它是由顆粒細胞釋放到卵泡液中發(fā)揮作用的。目前有兩種重要的成熟抑制因子：環(huán)核苷酸和嘌呤。在體外，通過抑制磷酸二酯酶活性阻止細胞內(nèi)cAMP降解或是通過激活腺苷酸環(huán)化酶升高細胞內(nèi)cAMP的試劑，都可以抑制卵母細胞的成

19、熟28。因此，卵母細胞中的cAMP是控制減數(shù)分裂阻滯的重要分子，同時它也能抑制GVBD的發(fā)生。Tsafriri等在1975年就發(fā)現(xiàn)豬卵泡液中有抑制GVBD發(fā)生的物質(zhì)，后來證實這種物質(zhì)就是次黃嘌呤（HX）。在培養(yǎng)液中加入一定濃度的次黃嘌呤和腺苷就能抑制多種動物卵母細胞自然成熟，這兩種物質(zhì)對維持減數(shù)分裂阻滯有協(xié)同作用25，并與卵母細胞內(nèi)cAMP水平直接相關。 卵母細胞促成熟因子（MPF） 從正在進行減數(shù)分裂的卵母細胞中可以提取一種引發(fā)GVBD的物質(zhì)，稱它為成熟促進因子（MPF）或M期促進因子。MPF是由Cyclin B 和p34cdc2兩種蛋白組成的復合體，它以非激活的前體物質(zhì)存在于成熟前的卵母細

20、胞中。向未成熟的卵母細胞中顯微注射MPF可引起GVBD。Cyclin B隨著細胞周期的變化周期性的產(chǎn)生，在分裂間期這種周期蛋白不斷積蓄，超過激活MPF的臨界值，在分裂后期這種蛋白降解造成MPF復合體的失 活26。MPF前體轉(zhuǎn)化為MPF需p34cdc2去磷酸化。而Cyclin B不僅是MPF的調(diào)節(jié)亞基，而且還可以直接激活與MPF激活有關的cdc25酪氨酸磷酸酶。MPF活性對于啟動卵母細胞減數(shù)分裂，維持減數(shù)分裂中期的靜止，以及促使M向M的轉(zhuǎn)變具有促進作用，此外，MPF復合體還參與卵母細胞減數(shù)分裂過程中核膜的破碎27。2.3 血清血清是一種非常復雜的混合物，它的大部分組分已為人所知，但還有一部分尚不

21、清楚。越來越多的研究證實，血清能夠促進原始卵泡卵母細胞生長啟動，并提供生長所需的一種或幾種因子，培養(yǎng)液中添加動物血清可促進卵母細胞成熟。在豬的卵母細胞培養(yǎng)中，應用得最廣泛的是牛血清。近年來，許多研究者又在豬的卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加一定比例的豬血清，其中包括：新生仔豬血清，母豬發(fā)情的血清等。Sanbaissho 28指出，添加發(fā)情母牛血清或犢牛血清，卵母細胞的成熟效果好于添加牛血清白蛋白。Leibfried29指出，培養(yǎng)液中犢牛血清的最適宜添加量是10%，這與其后江金益的 30研究結(jié)果一致。現(xiàn)在大多數(shù)實驗室也都是采用在豬的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中添加10%的胎牛血清。Nakanishi 31發(fā)

22、現(xiàn)，添加新生仔豬血清豬卵母細胞的成熟效果最好，成熟率最高達80%；胎牛血清次之，成熟率為53.9%；去勢公豬血清最差，成熟率僅為50%。2.4 卵泡液(PFF)的作用卵泡液是卵母細胞體內(nèi)發(fā)育的介質(zhì)，它由血漿滲出液和卵泡細胞分泌物組成，含有大量來自血清的生化因子和卵母細胞及卵泡細胞的分泌因子。卵泡液作為卵母細胞發(fā)育的微環(huán)境對其成熟具有重要的調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)在提高卵母細胞質(zhì)成熟的質(zhì)量，增加胚胎的發(fā)育能力32?，F(xiàn)在研究者已先后從豬、牛、鼠卵泡液中分離出了卵母細胞減數(shù)分裂抑制劑，即 OMI 。Naito 33、Meinecke34 、Tsafriri35 、Sato36都證明豬卵泡液中含有

23、抑制卵母細胞成熟的物質(zhì)。但也有一些研究者認為卵泡液對卵母細胞的體外成熟沒有抑制作用37。Naito 33報道：在體外，豬卵泡液可促進豬卵母細胞胞質(zhì)成熟，從而顯著提高卵母細胞受精后的原核形成率，但這種作用不能被促性腺激素和類固醇激素所代替。因此，在卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)中，都要添加一定比例的卵泡液，以促進卵母細胞胞質(zhì)成熟。2.5 Ca2+及鈣調(diào)素細胞內(nèi)游離Ca2+可以作為一種內(nèi)在的第二信使信號參與調(diào)節(jié)哺乳動物卵母細胞的減數(shù)分裂成熟。研究表明，在卵母細胞成熟分裂過程中細胞內(nèi)游離鈣離子濃度有自發(fā)的波動38，這些波動與卵母細胞的胞質(zhì)成熟有密切的聯(lián)系。Ca2+濃度的升高是減數(shù)分裂中一個不可缺少的中間過程

24、，一定濃度的Ca2+-CaM復合體抑制劑能抑制GVBD39。 2.6 巰基物質(zhì)有研究表明，含巰基的物質(zhì)如半胱氨酸、谷胱甘肽、谷氨酰胺、巰基乙醇等對豬的卵母細胞的胞質(zhì)成熟有明顯的促進作用40。這些物質(zhì)不但可以清除卵母細胞內(nèi)的氧自由基，而且在細胞分裂時作為二硫鍵斷裂的供氫體。卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加較多的是半胱氨酸，有試驗表明，M199成熟培養(yǎng)液中添加半胱氨酸可以顯著提高卵母細胞發(fā)育后期的卵裂率，其卵裂率分別為添加前15.7%，添加后30.6%41 。由此可見，卵母細胞體外成熟受到眾多因素的調(diào)控，其調(diào)控機制也十分復雜。作為一項非常有發(fā)展前途的生物技術(shù)和畜牧業(yè)實用技術(shù)，研究重點仍需放在如何通過改進影

25、響卵母細胞體外成熟的各種影響因子來提高其成熟率及后期的胚胎發(fā)育質(zhì)量，尤其是近期中國農(nóng)業(yè)大學也成功得到中國第1頭、世界第7頭體細胞克隆豬后42，更讓同行們看到了卵母細胞體外成熟這一技術(shù)在胚胎工程中的重要性，同時也說明了注重和改進卵母細胞成熟影響因素的可行性和必要性。References1 Sun Q Y, Nagai T. Molecular mechanisms underlying pig oocyte maturation and fertilization. Reproduction Development, 2003, 49: 347-359.2 文國藝, 楊素芳, 陳自洪, 韋精衛(wèi),

26、 石德順. 影響豬卵母細胞體外成熟的相關物理性因素. 動物科學與動物醫(yī)學, 2003, 20 (12): 32-33Wen G Y, Yang S F, Chen Z H, Wei J W, Shi D S. Physical factors correlation with in vitro maturation of porcine oocytes. Animal Science and Veterinary Medicine, 2003, 20 (12):32-33.(in Chinese)3 文國藝. 卵巢保存溫度對豬體外受精的影響. 廣西農(nóng)學報, 2000，(1): 22-24.We

27、n G Y. The effect of stored temperature f ovary on in vitro fertilization of porcine. Journal of Guangxi Agriculture, 2000, (1): 22-24. (in Chinese)4 佐騰英明. 屠宰家畜卵子的利用. 畜產(chǎn)的研究, 1987, (3):9-15.Sato H. The utilization of slaughtered livestock oocytes. Studies on Livestock Industry, 1987, (3): 9-15. (in C

28、hinese)5 劉紅林, 范必勤. 哺乳動物卵母細胞的體外成熟. 畜牧與獸醫(yī), 1996, 28(4):180-182.Liu H L, Fan B Q. In vitro maturation of mammal oocytes. Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 1996, 28(4):180-182. (in Chinese)6 Sirard M A, Blondin P. Oocyte maturation and IVF in cattle. Animal Reproduction Science, 1996, 42: 417-42

29、6. 7 Yoshida M, Ishizaki Y, Kawagishi H, Bamba K, Kojima Y. Effects of pig follicular fluid on maturation of pig oocytes in vitro and on their subsequent fertilizing and developmental capacity in vitro. Journal of Reproduction and Fertility, 1992, 95: 481-488.8 Sosnowski J, Waroczyk M, Switonski M.

30、Chromosomal abnormalities in secondary pig oocytes matured in vitro. Theriogenology, 2003, 60: 571-581. 9 Zheng Y S, Sirard M A. The effect of sera, bovine serm albumin and follicular cells on in vitro maturation and fertiliztion of porcine oocytes. Theriogenology, 1992, 37: 779-790.10 旭日干, 張鎖鏈, 薛曉先

31、, 海青蘭, 廛洪武. 屠宰母牛的卵巢卵母細胞體外受精與發(fā)育的研究. 畜牧獸醫(yī)學報, 1989, 20(3):193-198.Xu R G, Zhang S L, Xue X X, Hai Q L, Chan H W. In vitro fertilization and development of slaughtered bovine oocytes matured in vitro. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 1989, 20(3):193-198. (in Chinese)11 Funahashi H, Can

32、tley T, Day B N. Different hormonal requirement of pig oocyte-cumulus complexes during maturation in vitro. Journal of Reproduction and Fertility, 1994, 101:159-165.12 孟慶剛, 張成林, 張永忠, 李光鵬, 譚景和. 豬小腔卵泡卵母細胞體外成熟研究. 畜牧獸醫(yī)學報, 2001, 32(3): 213-219.Meng Q G, Zhang C L, Zhang Y Z, Li G P, Tan J H. Studies on i

33、n vitro maturation of porcine oocytes from small antral follicles. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 2001, 32(3): 213-219. (in Chinese)13 蔡令波, 王 峰, 顧熟琴, 杭蘇琴, 牛樹理. PMSG和 HCG對豬卵母細胞體外成熟的影響. 畜牧與獸醫(yī), 2002, 34(12):1-3.Cai L B, Wang F, Gu S Q, Hang S Q, Niu S L. Effects of PMSG and HCG on I

34、VM of oocytes in porcine. Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2002, 34(12):1-3. (in Chinese)14 Tesaric J, Mendoza C. Nongenomic effect of 17-estradiol on maturing human oocytes: Relationship to oocyte development potential. Journal of Clinic Endocrinology Metabolism, 1995, 80:1438-1443.15 Beke

35、r A R C L, Zeinstra E, Colenbrander B. Effect of addition of 17-estradiol during IVM on bovine oocyte nuclear maturation and subsequent blastocyst formation. Theriogenology, 2001, 55: 462.16 江金益, 熊慧卿, 范必勤. 水牛體外受精研究. 江蘇農(nóng)業(yè)學報, 1990, 6(3): 25-30.Jiang J Y, Xiong H Q, Fan B Q. Studies on in vitro fertili

36、zation in buffalo. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 1990, 6(3): 25-30. (in Chinese)17 Reyes M D, Lapierre L, Saenz L. Effect of the length of the hormonal supple mentation on in vitro maturation of porcine oocytes. Theriogenology, 2001, 55: 468. 18 Funahashi H, Cantley T, Day B N. Different

37、 hormonal requirement of pig oocyte-cumulus complexes during maturation in vitro. Journal of Reproduction and Fertility, 1994, 101: 159-165.19 芮 榮. 山羊腔前卵泡卵母細胞體外發(fā)育與體外成熟的研究.畜牧獸醫(yī)學報, 2000, 6: 2-7.Rui R. IVD and IVM of oocytes from perantral follicular oocytes in goat. Chinese Journal of Animal and Veter

38、inary Sciences. 2000, 6: 2-7.(in Chinese) 20 Wang W, Niwa K. Synergetic effects of EGF factor and gonadotropins on the cytoplas mic maturation of pig oocytes in a serum-free medium. Zygot, 1995, 3: 345-350.21 Abeydeera L R, Wang W H, Cantley T C, Rieke A, Murphy C N, Prather R S, Day B N. Developmen

39、t and viability of pig oocytes matured in a protein-free medium containing epidermal growth factor. Theriogenology, 2000, 54: 787-797.22 Coskun S, Lin Y C. Mechanism of action of epidermal growth factor-induced porcine oocyte maturation. Molecular Reproduction and Development, 1994, 42: 311-317.23 X

40、ia P, Tekpetey F R, Armstrong D T. Effect of IGF-1 on the pig oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development in vitro, and on granulose and cumulus cell biosynthetic activity. Molecular Reproduction and Development, 1994, 38: 373-379.24 Eppig J J, Downs S M. Chemical signals that

41、regulate manmalian oocyte maturation. Biology of Reproduction, 1984, 30: 1-11.25 Sanbuissho A, Threlfall W R. The effects of estrous cow serum on the maturation and fertilization of the bovine follicular oocyte in vitro. Theriogenology, 1985, 23(1): 226.26 Andrew W M, Solomon M J, Kirschner M W. The

42、 role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature, 1989, 339: 280-286.27 Bermseok O, Ales H, John J E, Davor S, Barbara B K. SPIN, a substrate in the MAP kinase pathway in mouse oocytes. Molecular Reproduction and Development, 1998, 50: 240-249.

43、28 Sanbuissho A，Threlfall W R. The influence of serum and gonadotropins on in vitro maturation and fertilization of bovine oocytes. Theriogenology, 1990, 32: 341-348.29 Leibfried-Rutledge M L, Kuehholzer B, Rutleedge J J. Prodution of porcine nuclear transfer embryos using oocytes shipped during ear

44、ly or late period of maturation. Theriogenology, 2001, (55): 481.30 江金益, 鐘 聲, 范必勤. 奶牛體外受精研究. 江蘇農(nóng)業(yè)學報, 1989, 5(4): 1-8.Jiang J Y, Zhong S, Fan B Q. Study on in vitro fertilization in dairy cattle. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 1989, 5(4):1-8. (in Chinese)31 Nakanishi Y, Uto Y, Goto K, Ogaw

45、a K. The effect of different media and serum supplements upon porcine oocyte maturation. Theriogenology, 1990, 33: 291.32 Khatir H, Lonergan P, Carolan C, Mermillod P. Prepubertal bovine oocyte: A negative model for studying oocyte developmental competence. Molecular Reproduction and Development, 19

46、96, 45(2): 231-239.33 Naito. Effects of porcine follicular fluid on male pronuclear formation in porcine oocytes matured in vitro. Gamete Research, 1988, 21: 289-295.34 Meinecke C C. The fine structure of the compound eye of the African armyworm moth, Spodoptera exempta walk. (Lepidoptera, Noctuidae

47、). Cell and Tissue Research, 1981, 216(2): 333-347.35 Tsafriri A, Dekel N, Bar-Ami S. The role of oocyte maturation inhibition in follicular regulation of oocyte maturation. Journal of Reproduction and Fertility, 1982, 64: 541-551.36 Sato R. The impact of technical change on the holotheticity of production functions. Review of Economic Studies, 1980, 47: 767-776.37