發(fā)酵工業(yè)中噬菌體的防治

1、發(fā)酵工業(yè)中噬菌體的防治發(fā)酵工業(yè)中噬菌體的防治 噬菌體簡(jiǎn)介 染菌后（噬菌體，下同）癥狀 染菌的原因 應(yīng)急的挽救措施 噬菌體的預(yù)防 抗噬菌體菌株的選育噬菌體 噬菌體是原核生物病毒。非常微小，其直徑為0.1m；不具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)；只含有單一核酸。它的感染能力非常強(qiáng)，極易感染用于發(fā)酵的細(xì)菌和放線菌。傳播蔓延的速度非常快，且很難防治，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生有巨大的威脅。它可以通過(guò)環(huán)境污染、設(shè)備的滲漏或死角、空氣系統(tǒng)、培養(yǎng)基滅菌過(guò)程、補(bǔ)料、取樣及其他操作過(guò)程進(jìn)入到發(fā)酵系統(tǒng)中。 噬菌體在侵染宿主細(xì)胞時(shí)，首先是吸附在宿主細(xì)胞表面，然后將核酸注入到細(xì)胞內(nèi)部，衣殼則留在外面。核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞以后，就利用宿主細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，復(fù)制

2、出子代噬菌體的核酸，并合成構(gòu)成子代噬菌體衣殼的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞的一定部位，這些蛋白質(zhì)和核酸裝配成子一代噬菌體。裝配完成的噬菌體，在細(xì)胞裂解以后，一齊被釋放出來(lái)，釋放量通常在102103個(gè)左右。還有一種溫和噬菌體，進(jìn)入宿主細(xì)胞后其基因組能與宿主菌基因組整合，并隨細(xì)菌分裂傳至子代細(xì)菌的基因組中，不引起細(xì)菌裂解。整合在細(xì)菌基因組中的噬菌體基因組稱為前噬菌體，帶有前噬菌體基因組的細(xì)菌稱為溶原性細(xì)菌。前噬菌體偶爾可自發(fā)地或在某些理化和生物因素的誘導(dǎo)下脫離宿主菌基因組而進(jìn)入溶菌周期，產(chǎn)生成熟噬菌體，導(dǎo)致細(xì)菌裂解。溫和噬菌體的這種產(chǎn)生成熟噬菌體和溶解宿主菌的潛在能力，稱為溶原性。溫和噬菌體可有三種存在狀態(tài)：游

3、離的具有感染性的噬菌體；宿主菌胞質(zhì)內(nèi)類似質(zhì)粒形式的噬菌體核酸；前噬菌體。發(fā)酵工業(yè)中所涉及的噬菌體主要屬于細(xì)菌和放線菌噬菌體。細(xì)菌噬菌體所涉及的發(fā)酵工業(yè)較多，如氨基酸、酶制劑、以及酸乳制品等生產(chǎn) 而放線菌嗟菌體主要出現(xiàn)在抗生索發(fā)酵工業(yè)中。菌體感染了噬菌體導(dǎo)致發(fā)酵不正常進(jìn)行，甚至倒灌。其主要癥狀有： 菌體生長(zhǎng)受到影響，發(fā)酵液（OD值）光密度不上升或回降 pH逐漸上升 氨利用停止 糖耗、溫升緩慢或停止 產(chǎn)生大量泡沫，是發(fā)酵液呈黏膠狀 鏡檢時(shí)菌體數(shù)量顯著減少，甚至找不到完整的菌體 發(fā)酵周期延長(zhǎng)、產(chǎn)物生成量減少或停止染菌癥狀 環(huán)境污染噬菌體是造成噬菌體感染的主要根源。 設(shè)備滲漏或死角，管道的彎曲和焊接處

4、滅菌不徹底。 在發(fā)酵工程中操作不當(dāng)使得噬菌體進(jìn)入發(fā)酵系統(tǒng)。染菌的原因上海味精廠噬菌體污染因素的分析在發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)了噬菌體污染時(shí)，首先必須取樣檢查，并根據(jù)各種異?，F(xiàn)象作出正確判斷，及可能快采取相應(yīng)的挽救措施。常用的應(yīng)急方法有一下幾種： （1） 加入螯合劑如草酸及檸檬酸或抗生素（適用于耐藥的生產(chǎn)菌） （2）適量補(bǔ)入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基或生長(zhǎng)因子（玉米漿、酵母膏） （3）大量補(bǔ)接種子液或重新接種抗性菌種培養(yǎng)液，以便繼續(xù)發(fā)酵至終點(diǎn)，以防止倒灌。在補(bǔ)種之前也可對(duì)已感染了噬菌體的發(fā)酵液低溫滅菌。應(yīng)急的挽救措施例：谷氨酸發(fā)酵中期污染噬菌體的挽救措施例：谷氨酸發(fā)酵中期污染噬菌體的挽救措施（沈陽(yáng)味精廠）谷氨酸發(fā)酵

5、時(shí)若中期染噬菌體，如果返消，則得不償失;如果實(shí)罐滅菌重新接種，雖然殺死了噬菌體，但是，發(fā)酵液pH很高，既使用酸中和下來(lái)，也會(huì)由于鹽類物質(zhì)積累過(guò)多，造成菌體不適，不利發(fā)酵。另一方面由于實(shí)消后，接進(jìn)去的是幼齡菌種不是產(chǎn)酸型菌體，因此，未能使菌體增殖，底物就趨于耗盡，致使產(chǎn)物積累的不多。 針對(duì)上述問(wèn)題，我們查閱了有關(guān)資料，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，采取了“對(duì)流”的措施。經(jīng)過(guò)多次實(shí)踐，收到了較理想的效果。其做法是將發(fā)酵中期染噬菌體的罐(無(wú)雜菌)與另一正常發(fā)酵后期罐用管路接通，利用風(fēng)壓將二者對(duì)流混合，然后繼續(xù)發(fā)酵。1.噬菌體吸附寄主細(xì)胞的能力不是均勻的。細(xì)菌同其它生物一樣，對(duì)外來(lái)“異物”具有一定的抵抗能力。當(dāng)然，這

6、種能力隨菌齡不同.就谷氨酸發(fā)酵菌株而言一般認(rèn)為，幼齡細(xì)胞抵抗能力較弱，壯齡、老齡細(xì)胞抵抗能力較強(qiáng)?！皩?duì)流”的實(shí)踐正是在這種觀點(diǎn)的啟發(fā)下進(jìn)行的。2. . “對(duì)流對(duì)流”起到的交換作用起到的交換作用“對(duì)流”可以使染菌罐內(nèi)相對(duì)過(guò)剩的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(葡萄糖、生物素、無(wú)機(jī)鹽等)補(bǔ)充到營(yíng)養(yǎng)物趨于耗盡的正常后期內(nèi);同時(shí)將正常罐內(nèi)的大量產(chǎn)酸型菌體補(bǔ)充到染菌罐內(nèi)。3. 3.“對(duì)流對(duì)流”可緩解染菌罐可緩解染菌罐pHpH過(guò)高問(wèn)題過(guò)高問(wèn)題污染噬菌體，發(fā)酵液pH值升高，在對(duì)流前選擇正常后期罐的同時(shí)盡量選擇pH低的發(fā)酵罐，從而達(dá)到中和的目的，達(dá)到發(fā)酵所需的要求。關(guān)于“對(duì)流”的理論根據(jù)討論優(yōu)點(diǎn)： 1，不需重新滅菌或消毒過(guò)程。但必須

7、對(duì)有關(guān)的管道進(jìn)行嚴(yán)密的消毒，防止“對(duì)流”過(guò)程的污染。可相對(duì)節(jié)省水和蒸汽。 2.不需額外添加任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可相對(duì)節(jié)省原料。 3.它不是發(fā)酵的重新開(kāi)始，而是在原有基礎(chǔ)上的繼續(xù)。因此，所消耗的時(shí)間比任何一種處理方法都短。 4.方法簡(jiǎn)便易行，成功率高。缺點(diǎn)： 采用“對(duì)流”方法的有不足之處是它擴(kuò)大了污染面積，因此，必須做好后處理工作，防止噬菌體的擴(kuò)散?！皩?duì)流”的優(yōu)缺點(diǎn) (1) 合理使用抗性菌株 選育抗性菌株的標(biāo)準(zhǔn)： 對(duì)以前出現(xiàn)過(guò)的噬菌體都有抗性 不是溶原性菌株 具有與原菌株相當(dāng)或更高的生產(chǎn)能力 不易發(fā)生回復(fù)突變噬菌體的防治 (2) 采取以環(huán)境凈化為中心的綜合防治措施 定期檢查噬菌體 嚴(yán)禁活菌體任意排放

8、殺滅環(huán)境中噬菌體 殺滅壓縮空氣中噬菌體 避免噬菌體侵襲菌種 避免噬菌體侵入設(shè)備噬菌體的防治 (3) 污染后的挽救措施并罐法菌種輪換或使用抗性菌株放罐重消法罐內(nèi)滅噬菌體法如果污染嚴(yán)重，上述方法無(wú)法解決，應(yīng)調(diào)換菌種或停產(chǎn)全面消毒。噬菌體的防治 關(guān)于噬菌體的防治，最主要的還是以預(yù)防為主，生產(chǎn)上使用的菌種不讓它在車間環(huán)境中長(zhǎng)期蔓延，噬菌體就沒(méi)有可寄生的活菌，也就沒(méi)有噬菌體的滋長(zhǎng)場(chǎng)地和繁殖條件。 我們可以通過(guò)抗噬菌體菌株的選育來(lái)達(dá)到預(yù)防的效果?？故删w菌株的選育 烈性噬菌體短期內(nèi)能連續(xù)完成對(duì)宿主的吸附、侵入、增殖、成熟和裂解而實(shí)現(xiàn)繁殖和裂解寄主。 噬菌斑烈性噬菌體侵蝕宿主細(xì)胞并在宿主內(nèi)大量繁殖，釋放出多

9、子代噬菌體，進(jìn)而感染四周細(xì)胞，使其裂解死亡，形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的空斑。一半情況下每種噬菌體所形成的噬菌斑的形態(tài)是相對(duì)穩(wěn)定的，可以最為鑒定指標(biāo)，亦可利用其進(jìn)行純種分離和計(jì)數(shù)。 效價(jià)每毫升試樣中所含有的侵染性噬菌體粒子數(shù)稱為效價(jià)。抗噬菌體菌株的選育 重層瓊脂法該法是檢查、分離噬菌體常用的方法。具體方法：分別配置瓊脂為該法是檢查、分離噬菌體常用的方法。具體方法：分別配置瓊脂為1%1%和和2%2%的宿主的宿主培養(yǎng)基，倒入平皿，制成底層，凝固后待用；在取含噬菌體待測(cè)樣品培養(yǎng)基，倒入平皿，制成底層，凝固后待用；在取含噬菌體待測(cè)樣品0.1mL0.1mL和和宿宿主的培養(yǎng)液混合，制成一定稀釋度，吸取其中主的培養(yǎng)液

10、混合，制成一定稀釋度，吸取其中0.1mL0.1mL加加入到盛有入到盛有3-4mL13-4mL1% %瓊脂培養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的試管中，充分混勻，立即倒入平皿底層的培養(yǎng)基上，制成重層平板，然后置基的試管中，充分混勻，立即倒入平皿底層的培養(yǎng)基上，制成重層平板，然后置于宿主適宜的溫度下培養(yǎng)于宿主適宜的溫度下培養(yǎng)16-20h.16-20h.如有噬菌體時(shí)，在重層瓊脂的上層形成透明的如有噬菌體時(shí)，在重層瓊脂的上層形成透明的噬菌斑。噬菌斑。噬菌體的檢測(cè)方法重重層瓊脂法層瓊脂法 單層平板法單層平板法 有時(shí)為了大概了解樣品中是否存在噬菌體而并不要求計(jì)數(shù)，可以把重層法簡(jiǎn)化為單層法，即把待測(cè)樣品、敏感菌與上層培養(yǎng)基混合，

11、直接倒入平皿制成平板，培養(yǎng)后觀察。 快速測(cè)定法快速測(cè)定法 將噬菌體和對(duì)數(shù)期宿主細(xì)胞懸浮液與含有0.50.8瓊脂培養(yǎng)基混合，加到無(wú)菌載玻片上攤平凝固，經(jīng)數(shù)小時(shí)培養(yǎng)后在顯微鏡、解剖鏡或擴(kuò)大鏡下以觀察噬菌斑并計(jì)數(shù)。這種方法可以達(dá)到早期檢查的目的，尤其適合于工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中檢查噬菌體侵蝕情況。 斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)法斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)法 將宿主細(xì)胞制成菌懸液，涂布與培養(yǎng)基平板上，45左右倒置培養(yǎng)與恒溫箱中至平板表面不留有水膜為止。將不同稀釋度的待測(cè)試樣依次用接種環(huán)點(diǎn)于平板上，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)之后，根據(jù)噬菌斑形成與否可初步判斷試樣中噬菌體的效價(jià)。噬菌體的檢測(cè)方法從育種角度，優(yōu)良的抗性菌株應(yīng)同時(shí)具備有抗性和高產(chǎn)量的特性。噬菌體對(duì)宿主具

12、有嚴(yán)格的專一性，選育一個(gè)抗性菌株，只有相應(yīng)的噬菌體才有效。由于噬菌體本身在傳代中會(huì)發(fā)生突變，使原來(lái)的抗性菌株對(duì)噬菌體的新變種變成敏感菌。所以選育一個(gè)菌株不是一勞永逸，一成不變，而是要不斷收集工廠周圍環(huán)境中各種不同的噬菌體，然后針對(duì)這些噬菌體選育相應(yīng)抗性菌株，才能保證生產(chǎn)正常穩(wěn)定地進(jìn)行?？故删w的選育程序：抗噬菌體的選育程序?qū)Ｒ恍允删w專一性噬菌體獲得和純化獲得和純化高效價(jià)噬菌體高效價(jià)噬菌體原液制備原液制備菌株誘發(fā)突變菌株誘發(fā)突變分離在含有噬分離在含有噬菌體的平皿上菌體的平皿上挑取抗性菌落挑取抗性菌落和搖瓶篩選（和搖瓶篩選（+噬菌體）噬菌體）分離到含噬菌分離到含噬菌體的平皿上體的平皿上挑取抗性菌

13、落挑取抗性菌落抗性菌株的特抗性菌株的特性試驗(yàn)性試驗(yàn)1.專一性噬菌體獲得和純化需要相應(yīng)專一性噬菌體作為選擇因子去選育抗噬菌體菌株。具體做法：（1）挑取培養(yǎng)皿上的噬菌斑，移接到含有1蛋白胨培養(yǎng)液（pH=7.0）中培養(yǎng)（2）用重層法連續(xù)多次進(jìn)行分離，一直到出現(xiàn)噬菌斑形狀、大小基本一致。（說(shuō)明對(duì)宿主專一性的噬菌體得到純化）抗噬菌體的選育程序的具體操作2.高效價(jià)噬菌體原液的制備高效價(jià)噬菌體原液的制備操操作步驟：作步驟：已純化的噬菌已純化的噬菌體體培養(yǎng)培養(yǎng)78h處處于對(duì)數(shù)期于對(duì)數(shù)期敏感菌培養(yǎng)液敏感菌培養(yǎng)液含噬菌體的上清含噬菌體的上清液液處于對(duì)數(shù)期的宿處于對(duì)數(shù)期的宿主菌懸液主菌懸液高效價(jià)噬菌體原液高效價(jià)噬菌

14、體原液培養(yǎng)培養(yǎng)10h離心離心適適溫培養(yǎng)至釋放溫培養(yǎng)至釋放細(xì)細(xì)菌菌濾濾器器過(guò)過(guò)濾濾3.噬菌體原液效價(jià)測(cè)定方法：用含有1蛋白胨溶液作為稀釋劑，按常規(guī)發(fā)稀釋到10-710-8，采用重層瓊脂法進(jìn)行定量測(cè)定，重復(fù)35個(gè)平皿。 噬菌體原液的效價(jià)要求達(dá)到噬菌體原液的效價(jià)要求達(dá)到10101011U/mL效效價(jià)價(jià)=平均每平皿噬菌斑數(shù)平均每平皿噬菌斑數(shù)*稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)/取樣量取樣量（mL）4.菌株誘發(fā)突變和分離與常規(guī)誘變育種相同。用理化因子處理宿主菌，以提高抗性突變體的頻率。然后把懸浮液分離在含有噬菌體的平皿上，經(jīng)培養(yǎng)后，如果出現(xiàn)菌落，注意挑選些生長(zhǎng)速度與正常菌落相差無(wú)幾的菌落移接到斜面培養(yǎng)，這些菌落可能具有不

15、程度的抗性。進(jìn)一步復(fù)證抗噬菌體的能力。此后在噬菌體存在條件下還要通過(guò)液體培養(yǎng)，觀察菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物積累情況。5.液液體搖瓶振蕩培體搖瓶振蕩培養(yǎng)養(yǎng)從平皿上經(jīng)過(guò)初步篩選的抗性菌株，進(jìn)一步在搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在一定溫度下，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期(若絲狀菌，孢子萌發(fā)后長(zhǎng)成菌絲體)，加入一定量高效(1010一1011Um1)噬菌體原液。繼續(xù)培養(yǎng)、觀察菌體消失，而后又重新再生。此時(shí)，將再生菌體移入到新的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，加入高效價(jià)噬菌體原液再培養(yǎng)。如此反復(fù)34次，然后分離在含有噬菌體的平皿上，挑取生長(zhǎng)速度快單菌落移入斜面，并在斜面上滴加噬菌體原液，經(jīng)培養(yǎng)后，觀察滴加原液處菌苔生長(zhǎng)情況。選取生長(zhǎng)正常的菌苔，再進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。經(jīng)觀察和測(cè)定，選取生長(zhǎng)正常酶活力或產(chǎn)物產(chǎn)量高的菌株，保存，供特性試驗(yàn)