食品生物技術(shù)精品課程

1、第三章第三章 蛋白質(zhì)改造的分子途徑及其蛋蛋白質(zhì)改造的分子途徑及其蛋白質(zhì)的異源表達(dá)白質(zhì)的異源表達(dá) 第二節(jié) 蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑基因突變技術(shù)是通過(guò)在基因水平上對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，在其表達(dá)后用來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種方法。根據(jù)其特點(diǎn)，可將基因突變分為兩大類(lèi)：位點(diǎn)特異性突變和隨機(jī)突變。位點(diǎn)特異性突變又可大體分為三種類(lèi)型：一類(lèi)是通過(guò)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變；第二類(lèi)是盒式突變或片段取代突變；第三類(lèi)是利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以雙鏈DNA為模板進(jìn)行的基因突變。PCR技術(shù)的出現(xiàn)為基因的突變，基因的剪接開(kāi)辟了一條極其有效、極其快捷的道路。當(dāng)然無(wú)論哪種方法都可以在為蛋白質(zhì)編碼的基因序列上產(chǎn)生插入

2、、缺失、取代等突變。 1寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性突變 這類(lèi)突變都是在含有突變序列的寡核苷引物介導(dǎo)下進(jìn)行的，也稱為專(zhuān)一性位點(diǎn)突變。這種突變的方法從問(wèn)世至今不斷更新，特別是PCR技術(shù)出現(xiàn)后變得更高效。 (1) 寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素 (2) 幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法 (1)寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變中的各種因素關(guān)于DNA模板的制備寡核苷酸突變引物的設(shè)計(jì)和選擇 寡核苷酸突變引物與DNA模板的退火和引物延伸條件DNA聚合酶的選擇存在于dNTP中的dUTP對(duì)離體DNA合成反應(yīng)的影響受體細(xì)胞對(duì)突變體產(chǎn)率的影響關(guān)于DNA模板的制備雙鏈DNA模板：質(zhì)粒單鏈DNA模板：M13噬菌體載體，足夠純凈(

3、避免RNA污染) 寡核苷酸突變引物的設(shè)計(jì)和選擇引物特征：具有和模板DNA的互補(bǔ)區(qū)；足夠長(zhǎng)，能與目標(biāo)DNA序列退火；突變引物應(yīng)盡可能避免形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的回文序列、重復(fù)序列或自身互補(bǔ)序列；突變引物不能與目標(biāo)DNA的其它區(qū)域和載體DNA形成穩(wěn)定的雜交體。引物設(shè)計(jì)取決于所要產(chǎn)生的突變類(lèi)型：用于單個(gè)核苷酸改變的引物，一般長(zhǎng)度為1719個(gè)核苷酸；多處改變核苷酸或改變2個(gè)以上，一般長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸以上。寡核苷酸突變引物與模板DNA的退火和引物延伸條件退火條件：突變引物與模板突變引物與模板DNA的摩爾比為的摩爾比為1050；退火通常將二者混合物加；退火通常將二者混合物加熱到熱到Tm值以上值以上20度，然后

4、再緩慢冷卻到室溫；對(duì)于度，然后再緩慢冷卻到室溫；對(duì)于AT含量高含量高的引物，為保證退火安全，加熱后可冷卻到較低溫度，以穩(wěn)定模的引物，為保證退火安全，加熱后可冷卻到較低溫度，以穩(wěn)定模板和引物復(fù)合體。板和引物復(fù)合體。引物延伸條件：退火完成后加入4種脫氧核苷三磷酸，DNA聚合酶、DNA連接酶等，進(jìn)行2-15小時(shí)的延伸反應(yīng)。DNA聚合酶的選擇目前一般選擇目前一般選擇T4DNA聚合酶和聚合酶和T7DNA聚合酶聚合酶 存在于dNTP中的dUTP對(duì)離體DNA合成反應(yīng)的影響 dCTP氧化脫氨可產(chǎn)生微量氧化脫氨可產(chǎn)生微量dUTP， dUTP滲入到新生滲入到新生DNA鏈中后，受體菌中的尿嘧啶鏈中后，受體菌中的尿嘧

5、啶-N-糖基化酶可在糖基化酶可在U的位置切斷的位置切斷DNA鏈，降低突變體的產(chǎn)率。鏈，降低突變體的產(chǎn)率。 利用經(jīng)利用經(jīng)HPLC純化的高質(zhì)量的純化的高質(zhì)量的dNTP可以降低可以降低U堿基的錯(cuò)堿基的錯(cuò)誤攙入，提高突變產(chǎn)生的比率。誤攙入，提高突變產(chǎn)生的比率。 受體細(xì)胞對(duì)突變體產(chǎn)率的影響受體菌中的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)將產(chǎn)生的突變?nèi)コ?；受體菌中的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)將產(chǎn)生的突變?nèi)コ划?dāng)用當(dāng)用M13作為克隆載體時(shí)，由于作為克隆載體時(shí)，由于M13 DNA可能出可能出現(xiàn)不對(duì)稱復(fù)制，如果突變鏈的復(fù)制效率較低，則最現(xiàn)不對(duì)稱復(fù)制，如果突變鏈的復(fù)制效率較低，則最終將降低突變體的產(chǎn)率。終將降低突變體的產(chǎn)率。為了提高突變體的回收率，即提

6、高突變效率，利用點(diǎn)為了提高突變體的回收率，即提高突變效率，利用點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)缺失的菌株為受體菌可使突變產(chǎn)率提高近錯(cuò)配修復(fù)缺失的菌株為受體菌可使突變產(chǎn)率提高近10倍。倍。 (2) 幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法 Kunkel 突變法 基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法 基于去除特定限制酶切位點(diǎn)的突變 利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點(diǎn)突變 Kunkel 突變法 基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法 基于去除特定限制酶切位點(diǎn)的突變PCR flash 利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生定點(diǎn)突變 2區(qū)域性定向突變 基因工程技術(shù)不但可使基因產(chǎn)生特異性位點(diǎn)突變，也可基因工程技術(shù)不但可使基因產(chǎn)生特異性位點(diǎn)突變，也可以產(chǎn)生

7、區(qū)域性的突變。以產(chǎn)生區(qū)域性的突變。常用的方法如盒式突變法常用的方法如盒式突變法(cassette mutagenesis)，又稱片段取代法，又稱片段取代法(DNA fragment replacement)。盒式突變的具體操作是利用目標(biāo)基因中所具有的適當(dāng)?shù)南拗坪惺酵蛔兊木唧w操作是利用目標(biāo)基因中所具有的適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，用具有任何長(zhǎng)度、任何序列性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用具有任何長(zhǎng)度、任何序列(或任何混合序列或任何混合序列)的的DNA片段來(lái)置換或取代目標(biāo)基因上的一段片段來(lái)置換或取代目標(biāo)基因上的一段DNA序列。序列。盒式突變的兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：1.目標(biāo)基因中要有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。對(duì)于天然蛋白對(duì)于天

8、然蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，其所含可供利用的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)很少，質(zhì)來(lái)說(shuō)，其所含可供利用的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)很少，可利用遺傳密碼的簡(jiǎn)并性在不改變氨基酸序列的前提下，可利用遺傳密碼的簡(jiǎn)并性在不改變氨基酸序列的前提下，通過(guò)改變某些核苷酸的序列，產(chǎn)生合適的限制性內(nèi)切酶位通過(guò)改變某些核苷酸的序列，產(chǎn)生合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，便于盒式突變的操作。點(diǎn)，便于盒式突變的操作。2.用于取代目標(biāo)基因中特定DNA片段的突變DNA片段的獲得。目目前利用前利用PCR技術(shù)可產(chǎn)生具有特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的、具有各種技術(shù)可產(chǎn)生具有特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的、具有各種突變位點(diǎn)的盒式突變突變位點(diǎn)的盒式突變DNA片段的技術(shù)已經(jīng)很成熟。片段的技

9、術(shù)已經(jīng)很成熟。如今，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行區(qū)域性定向突變，除了上述的盒式突變外，如今，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行區(qū)域性定向突變，除了上述的盒式突變外，也完全可以通過(guò)也完全可以通過(guò)PCR方法對(duì)給定基因序列進(jìn)行融合和剪接，方法對(duì)給定基因序列進(jìn)行融合和剪接，這種基因改造方法不受特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的存在與否的這種基因改造方法不受特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的存在與否的限制。限制。第三節(jié) 重組蛋白質(zhì)的表達(dá) 一表達(dá)系統(tǒng)：一表達(dá)系統(tǒng)： 基因工程中用來(lái)獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的基因工程中用來(lái)獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達(dá)載體及受體細(xì)胞。體系，包括克隆載體，表達(dá)載體及受體細(xì)胞。 根據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：根據(jù)受體細(xì)胞的不

10、同可分為：1原核表達(dá)系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌大腸桿菌)： 將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因產(chǎn)物的體系。產(chǎn)物的體系。2真核表達(dá)系統(tǒng)（哺乳動(dòng)物細(xì)胞）：真核表達(dá)系統(tǒng)（哺乳動(dòng)物細(xì)胞）： 使使外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的體系。外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的體系。二原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)二原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)1.原核生物染色體原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形是裸露的環(huán)形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進(jìn)行。進(jìn)行。 2. 原核生物形成多順?lè)醋釉松镄纬啥囗?/p>

11、反子mRNA：mRNA在合成過(guò)程中和多個(gè)核糖體結(jié)在合成過(guò)程中和多個(gè)核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。合，翻譯形成多條肽鏈。 3、一般不含內(nèi)含子（、一般不含內(nèi)含子（intron），沒(méi)有轉(zhuǎn)），沒(méi)有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)錄及翻譯后加工系統(tǒng) 4、原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。形成操縱子。操縱子（操縱子（operon）：是一組功能上相關(guān)，）：是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個(gè)遺受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個(gè)遺傳單位傳單位 原核生物基因表達(dá)的基本單位（即一原核生物基因表達(dá)的基本單位（即一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位）。個(gè)轉(zhuǎn)錄單位）。共同協(xié)調(diào)作用，完成某一多肽

12、的表達(dá)調(diào)共同協(xié)調(diào)作用，完成某一多肽的表達(dá)調(diào)控?？亍０ǎ赫{(diào)控區(qū)包括：調(diào)控區(qū)(調(diào)節(jié)基因，啟動(dòng)基因，調(diào)節(jié)基因，啟動(dòng)基因， 操縱基因操縱基因)、 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因操縱子特點(diǎn)：操縱子特點(diǎn)：5、原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：、原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：?jiǎn)?dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子 啟動(dòng)子啟動(dòng)子(promoter, P)是指能被是指能被RNA聚合酶聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。序列。 一般長(zhǎng)一般長(zhǎng)40-60bp，富含，富含A-T堿基對(duì)堿基對(duì) 具有保守序列：具有保守序列： -10區(qū)（區(qū)（pribnow box）：）：TATAAT -35區(qū)：區(qū)： RNA聚合酶識(shí)

13、別并結(jié)合啟動(dòng)子，但并不開(kāi)始轉(zhuǎn)錄聚合酶識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子，但并不開(kāi)始轉(zhuǎn)錄 各種啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄能力不同。各種啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄能力不同。 啟動(dòng)子強(qiáng)弱取決于啟動(dòng)子強(qiáng)弱取決于-35區(qū)和區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔區(qū)的堿基組成及其間隔序列序列 終止子（終止子（terminatorterminator，T T）: :位于基因位于基因33端端, ,給予給予RNARNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNADNA序列序列 6、與轉(zhuǎn)譯有關(guān)的原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)：、與轉(zhuǎn)譯有關(guān)的原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)：核糖核糖體結(jié)合位點(diǎn)體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)譯起始密碼子轉(zhuǎn)譯起始密碼子AUG 或或GUGSD順序（順序（shine-dalgarno）：）：A

14、UG上游上游3-11 bp長(zhǎng)約長(zhǎng)約3-9bpmRNA與與16s核糖體亞基間的識(shí)別與結(jié)核糖體亞基間的識(shí)別與結(jié)合序列合序列 三外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的三外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的必要條件必要條件：1.刪除內(nèi)含子和刪除內(nèi)含子和5非編碼區(qū)非編碼區(qū)2.外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子和外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子和SD順序控制順序控制下下3.維持正確開(kāi)放閱讀框架（維持正確開(kāi)放閱讀框架（ORF）4.mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解質(zhì)不被降解 四影響外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)四影響外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素效率的因素：1、啟動(dòng)子：建立表達(dá)載體時(shí)，選擇強(qiáng)啟、啟動(dòng)子：建立表

15、達(dá)載體時(shí)，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子。動(dòng)子。 常見(jiàn)原核強(qiáng)啟動(dòng)子：常見(jiàn)原核強(qiáng)啟動(dòng)子： Plac：受：受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)，受阻遏蛋白負(fù)調(diào)，受IPTG的誘的誘導(dǎo)導(dǎo) Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac :Lac啟動(dòng)子和啟動(dòng)子和Trp啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子。 PL和和PR啟動(dòng)子：噬菌體早期左啟動(dòng)子：噬菌體早期左/右向啟動(dòng)子，右向啟動(dòng)子，受受噬菌體噬菌體CI基因負(fù)調(diào)控。溫度誘導(dǎo)?；蜇?fù)調(diào)控。溫度誘導(dǎo)。 2、基因劑量：、基因劑量：3、核糖體結(jié)合位點(diǎn)：、核糖體結(jié)合位點(diǎn)：SD順序與順序與16srRNA3末端互補(bǔ)程度。末端互補(bǔ)程度。AUGSD間距離。間距離。AUG后的核苷

16、酸后的核苷酸 五原核表達(dá)載體：五原核表達(dá)載體： 適用于在原核細(xì)胞中表適用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。達(dá)外源基因的載體。主要元件：強(qiáng)啟動(dòng)子主要元件：強(qiáng)啟動(dòng)子 SD順序順序 篩選標(biāo)志篩選標(biāo)志 其它調(diào)控基因其它調(diào)控基因 類(lèi)型：類(lèi)型：融合型表達(dá)載體：融合型表達(dá)載體：-融合蛋白融合蛋白非融合型表達(dá)載體：非融合型表達(dá)載體：-天然完整蛋白天然完整蛋白分泌型表達(dá)載體：分泌型表達(dá)載體：-產(chǎn)物可跨膜分泌至產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙胞周間隙 （一）融合型表達(dá)載體（一）融合型表達(dá)載體 PSDForeign DNA融合型表達(dá)載體融合型表達(dá)載體融合基因融合基因技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因插入原核序列技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因插入原核序

17、列33端端而維持正確閱讀框架而維持正確閱讀框架。 選擇合適酶切位點(diǎn)選擇合適酶切位點(diǎn)加入人工合成的加入人工合成的DNA接頭接頭 構(gòu)建位相載體構(gòu)建位相載體優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)效率高表達(dá)效率高產(chǎn)物穩(wěn)定產(chǎn)物穩(wěn)定 易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性易純化：利用融合原核多肽的特性Ptac：IPTG誘導(dǎo)誘導(dǎo)GST融合蛋白融合蛋白直接純化直接純化產(chǎn)物切割方便：產(chǎn)物切割方便： pGEX-1 T凝血酶凝血酶 pGEX-2T-凝血酶凝血酶 pGEX-3T-X因子因子位相載體位相載體融合型載體融合型載體-pGEX系列系列（二）非融合型表達(dá)載體（二）非融合

18、型表達(dá)載體 PSDForeign DNA非融合型表達(dá)載體非融合型表達(dá)載體非融合基因非融合基因主要元件：強(qiáng)啟動(dòng)子主要元件：強(qiáng)啟動(dòng)子 SD： ATG：第一個(gè)密碼子：第一個(gè)密碼子非融合型表達(dá)載體非融合型表達(dá)載體-pPL-LamdaPL啟動(dòng)子啟動(dòng)子-溫度誘溫度誘導(dǎo)導(dǎo)插入位點(diǎn)插入位點(diǎn)-HpaI（三）分泌型表達(dá)載體：（三）分泌型表達(dá)載體：1、主要元件：、主要元件：?jiǎn)?dòng)子和啟動(dòng)子和SD序列序列信號(hào)肽序列信號(hào)肽序列 ：SD下游，編碼信號(hào)肽，下游，編碼信號(hào)肽， 可引導(dǎo)蛋白跨膜可引導(dǎo)蛋白跨膜2、優(yōu)點(diǎn)：分泌表達(dá)，避免降解。、優(yōu)點(diǎn)：分泌表達(dá)，避免降解。 分泌型表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體-pINIII-ompA1分泌型融合

19、表達(dá)載體分泌型融合表達(dá)載體-pEZZ18六提高表達(dá)水平的手段六提高表達(dá)水平的手段1、選擇合適載體，提高翻譯水平、選擇合適載體，提高翻譯水平 強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子-提高轉(zhuǎn)錄水平提高轉(zhuǎn)錄水平 核糖體結(jié)合位點(diǎn)（核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ATG-SD） 避免產(chǎn)物降解避免產(chǎn)物降解 ：分泌：分泌/融合表達(dá)融合表達(dá) 細(xì)菌蛋白酶抑制劑細(xì)菌蛋白酶抑制劑2、選擇合適宿主、選擇合適宿主 Lac 啟動(dòng)子啟動(dòng)子-LacI菌菌PL/PR - CI857 溶源菌溶源菌 3、誘導(dǎo)表達(dá)、誘導(dǎo)表達(dá) 溫度誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)-PLPR /IPTG的化學(xué)誘導(dǎo)的化學(xué)誘導(dǎo)-Plac、Ptac 4、提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止被宿主、提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止被

20、宿主降解降解七表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：七表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)： 1、特異性鑒定：、特異性鑒定：熒光抗體法熒光抗體法免疫沉淀法免疫沉淀法免疫印跡法免疫印跡法ELISA2、生物學(xué)活性鑒定、生物學(xué)活性鑒定 八、原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)八、原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)1、沒(méi)有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識(shí)別、沒(méi)有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識(shí)別、剪除內(nèi)含子剪除內(nèi)含子 2、缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對(duì)翻譯的、缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對(duì)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)一步修飾加工蛋白質(zhì)進(jìn)一步修飾加工 真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢(shì)真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢(shì)1. 具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)2. 具翻譯后修飾系統(tǒng)具翻譯后修飾系統(tǒng)3. 可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá)可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表

21、達(dá)4.基因治療基因治療真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點(diǎn) （一）真核基因組的復(fù)雜性（一）真核基因組的復(fù)雜性 真核基因組龐大，具大量非編碼序列真核基因組龐大，具大量非編碼序列 -mRNA豐度不同豐度不同 結(jié)構(gòu)復(fù)雜：染色質(zhì)、核膜、線粒體結(jié)構(gòu)復(fù)雜：染色質(zhì)、核膜、線粒體-表達(dá)表達(dá)調(diào)控多樣調(diào)控多樣 不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子 沒(méi)有操縱子結(jié)構(gòu)沒(méi)有操縱子結(jié)構(gòu) (二）真核表達(dá)系統(tǒng)二）真核表達(dá)系統(tǒng)組成：真核表達(dá)載體組成：真核表達(dá)載體 受體細(xì)胞受體細(xì)胞 基因轉(zhuǎn)移方式基因轉(zhuǎn)移方式據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為3種：種： 酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)

22、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（三）轉(zhuǎn)化（三）轉(zhuǎn)化1、原生質(zhì)體法：去除厚壁、原生質(zhì)體法：去除厚壁2、電穿孔法：效率較高、電穿孔法：效率較高（四）外源基因的表達(dá)（四）外源基因的表達(dá)1、胞內(nèi)表達(dá)、胞內(nèi)表達(dá)2、分泌表達(dá)：在、分泌表達(dá)：在MCS前加入信號(hào)肽序前加入信號(hào)肽序列列大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌(E.coli)表達(dá)體系是目前應(yīng)用最廣的一個(gè)外源基因表達(dá)體系，是外源基因表達(dá)的首選體系。利用大腸桿菌作為表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵；外源基因經(jīng)?？梢赃_(dá)到高效表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)體系的應(yīng)用 當(dāng)外源蛋白質(zhì)的分子量小于70kD,不存

23、在半胱氨酸或分子內(nèi)的二硫鍵少于34個(gè)，以及不需要翻譯后修飾而能保持其生物活性的蛋白質(zhì)，大多可以利用大腸桿菌系統(tǒng)得到滿意的結(jié)果。1表達(dá)載體的一般特點(diǎn)(1) 復(fù)制起始點(diǎn)(2) 選擇性基因 (3) 強(qiáng)的、可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(4) 強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列 (5) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)(6) 合適的多克隆位點(diǎn)2與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素(1) 有效的轉(zhuǎn)錄起始(2) 有效的翻譯(3) 蛋白質(zhì)水解作用(4) 蛋白質(zhì)的外泌 3改善表達(dá)水平的方法 誘導(dǎo)條件外源基因的編碼序列用蛋白酶缺失的宿主菌4. 改善外源蛋白溶解性的方法 外源蛋白的分泌表達(dá) 細(xì)菌生長(zhǎng)溫度 外源蛋白與分子伴侶和折疊酶共表達(dá) 外源蛋白與相關(guān)蛋白或蛋白標(biāo)簽融合大腸桿菌表達(dá)體系的缺點(diǎn)大腸桿菌系統(tǒng)最大的不足之處是不能進(jìn)行典型真核細(xì)胞所具有的復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化、烷基化、磷酸化、特異性的蛋白水解加工等；而廣泛二硫鍵的形成以及外源蛋白質(zhì)組裝成多亞基復(fù)合體的能力也受到限制。大腸桿菌體系的另一個(gè)不足之處是外源基因產(chǎn)物在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)易形成不溶性的包涵體；而當(dāng)真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，作為起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白質(zhì)的N末端。最后，