環(huán)境工程微生物學實驗講義

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上環(huán)境工程微生物學實驗講義實驗一 光學顯微鏡的使用一、 目的要求1、 熟悉普通光學顯微鏡的構造及其使用方法。2、 了解油鏡的原理，并掌握其使用方法。3、學習生物圖的繪制方法二、 實驗內容學習普通光學顯微鏡的使用方法，學會判斷是否需要使用油鏡，學習理解，學習怎樣使用和利用光圈，反光鏡，調整反差，使視野達到最好的觀察效果。學習使用油鏡觀察微生物標本示范片。觀察的示范片有，細菌三型涂片、葡萄球菌涂片、枯草芽孢桿菌涂片、褐球固氮菌涂片、八疊球菌涂片、豬鏈球菌涂片，青霉、曲霉示范片等。三、 實驗器材顯微鏡、各種示范片、香柏油、二甲苯、擦鏡紙等。四、 方法步驟1 用低倍鏡對（調）光

2、，使視野明亮。2 選擇要觀察的標本片，首先在低倍鏡觀察（尋找觀察目標）。3 高倍鏡觀察（選取理想的觀察目標）。4 油鏡觀察：高倍鏡觀察后上升鏡筒（或者是下調載物臺）油鏡轉至正下方，在載玻片上加一小滴香柏油小心地下降鏡筒使鏡頭浸在油里用粗螺旋將鏡筒（載物臺）緩慢上升，尋找目標（物象）用細螺旋調節(jié)，使物象清晰觀察記錄。5 觀察完畢。上升鏡筒（或者是下調載物臺），轉動物鏡轉換器，使油鏡物鏡偏位。用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上的油跡，再取一張擦鏡紙醮上二甲苯擦去鏡頭上殘留的香柏油，最后再用一張干凈的擦鏡紙擦去殘留在鏡頭上的二甲苯。6 將顯微鏡各部分還原至進實驗室時模樣。五 結果與思考 1 繪圖記錄觀察結果（以

3、細菌三型為例）細菌三型涂片觀察放大倍數(shù) 目×10物×100_細菌三型涂片觀察放大倍數(shù)目×10 物×1002 油鏡完畢后，鏡頭應如何處理?六、講解時的注意事項：1、本次實驗為學生第一次進入微生物實驗室，因此在開始實驗時必須向學生交代實驗室的一些規(guī)章制度及注意事項。2、對顯微鏡的介紹從原理到各部件到使用都務必詳細，包括使用過程中應該注意的事項，盡量減少學生用壞儀器的幾率。3、一定要詳細講解觀察時視野內的反差調節(jié)，提高學生的實驗效率。4、要提醒學生要掌握正確的觀察方法，左眼觀測，右眼用于畫圖或記錄。養(yǎng)成良好的觀察習慣。5、要要求學生實驗報告繪圖時必須采用鉛筆。

4、6、 要強調油鏡護理的重要性。實驗二 藻類、原生動物及微型后生動物個體形態(tài)的觀察（水處理中常見微生物的觀察或活性污泥的觀察）一、 目的要求1 進一步熟悉和掌握普通光學顯微鏡的使用方法。2 掌握生物圖的繪制方法。3 學習壓滴法制作標本片。二 實驗內容用顯微鏡觀察活性污泥。三 實驗器材1、 實驗室提供的水樣：活性污泥混合液、生物濾池水樣、SBR反應器水樣、生物接觸氧化池水樣2、 學生自取水樣（讓學生來實驗室之前自選地點取樣，記錄采樣地點）3、 顯微鏡、吸水紙、擦鏡紙。四 方法步驟1、 用壓滴法制作藻類、原生動物和微型后生動物的標本片。2 、低倍鏡觀察（尋找觀察目標）。3 、高倍鏡觀察（選取理想的觀

5、察目標）。4 、繪制藻類、原生動物和微型后生動物的形態(tài)圖。五 結果與思考 1 繪圖記錄觀察結果藻類觀察放大倍數(shù)原生動物觀察 微型后生動物觀察放大倍數(shù)放大倍數(shù) 2 你觀察到幾種微生物？來自不同水樣觀察到的結果是否不同六、講解時的注意事項：1、要再一次強調顯微鏡的正確使用方法。2、再一次強調反差的作用。3、示范壓滴法制作生物標本片的過程4、結合課堂內容，讓學生明白使用顯微鏡觀測活性污泥的意義，鼓勵學生多做示范片，多認識幾種原生動物等。5、再一次強調正確的觀察方法。6、再次提醒學生注意使用鉛筆繪圖。7、提及PFU生物監(jiān)測法，告訴學生此為開放實驗，有興趣的學生可以選擇在實驗結束選做。實驗三、四 微生物

6、細胞計數(shù)和大小的測量一 目的要求1 學習掌握血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。2 學習掌握用測微尺測量微生物細胞大小的方法。二 實驗內容1 用血球計數(shù)板計算酵母菌懸液中，每毫升原液的菌數(shù)。2 用測微尺測量生物示范片中微生物的大小。三 實驗器材1 菌種：釀酒酵母。2 儀器及其它：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、血球計數(shù)板、載玻片、蓋玻片、滴管、吸水紙、各種生物示范片。四 方法步驟（一）微生物顯微鏡直接計數(shù)法1 制備酵母菌的菌懸液。2 取血球計數(shù)板一塊，先用眼睛觀察其結構，然后在低倍鏡下觀察計數(shù)室的網格結構。3 將蓋玻片放在計數(shù)器的網格上方使之架起。4 用滴管吸取少許搖勻的酵母菌懸液，從蓋玻片的一端

7、注入，使酵母菌懸液滲入兩玻片之間（應無氣泡，蓋玻片不頂?。?。5 將計數(shù)板水平靜置5分鐘使菌液分布均勻后計數(shù)，。6 用低倍鏡尋找計數(shù)器的網格，然后在高倍鏡下按下述原則對上下兩個計數(shù)室內的酵母菌進行計數(shù)。即：采用五點取樣法（25×16）或四點計樣法（16×25）各計上不計下、計左下計右的原則計數(shù)五個或四個中格中的酵母菌數(shù)。7 計算原菌液中含酵母菌數(shù)每ml原液中含酵母菌數(shù)=兩次計數(shù)總酵母菌數(shù)/(2×80)×400×104×稀釋倍數(shù)每ml原液中含酵母菌數(shù)=兩次計數(shù)總酵母菌數(shù)/(2×100)×400×104

8、5;稀釋倍數(shù)（二）微生物大小測定1 目鏡測微尺的校正（1）目鏡測微尺裝入目鏡的隔板上，刻度朝下，將鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。（或將帶有目鏡測微尺的目鏡頭換上）（2）從目鏡中觀察“目尺”的結構后，用低倍鏡尋找鏡臺測微尺（先找黑圈，再稍加移動）。（3）移動臺尺和轉動目鏡，使兩尺平行，并把兩測微尺一端的第一條線完全重疊，然后尋找另一端的一條完全重疊的線。（4）記下兩重疊線之間的格數(shù)，并依下列公式求出校正值。校正值（微米）=兩重疊線間鏡臺測微尺的格數(shù)/兩重疊線間目鏡測微尺的格數(shù)×10微米（5）用同樣的方法 ，求出高倍鏡下目鏡微尺的校正值。2 測量細菌的大小（6）取下臺尺，換上生物示范

9、片。（7）在油鏡下測量每種細菌的3個細胞的大小。五 結果與思考1 填表：表一 微生物的顯微計數(shù)（25×16）12345小計總數(shù)細胞數(shù)/mL1室2室表二 不同物鏡倍數(shù)的校正值物鏡鏡頭鏡臺測微尺（格數(shù)）目鏡測微尺（格數(shù)）校正值低倍鏡高倍鏡油鏡表三 油鏡下細菌細胞大小的測定測量次數(shù)細菌名稱測量參數(shù)目鏡測微尺（格數(shù)）細胞實際大小1球菌直徑桿菌長寬螺旋菌長寬2球菌直徑桿菌長寬螺旋菌長寬3球菌直徑桿菌長寬螺旋菌長寬2 為什么用兩種不同規(guī)格的計數(shù)板測同一樣品時，其結果一樣？3 目鏡測微尺在用前為什么要校正？六、講解時的注意事項1、實驗講解務必詳盡，不僅要跟學生講實驗原理，還要講每一步操作的注意事項

10、，比如在利用血球計數(shù)板計數(shù)時，如何找到計數(shù)室所在，利用測微尺校正時如和快速在油鏡下找到鏡臺測微尺。這樣使學生的實驗效率提高，可以提高學生實驗興趣。2、示范利用血球計數(shù)板計數(shù)時，菌液如何添加。3、強調測量大小時校正的原則：邊對齊，整數(shù)格（不能出現(xiàn)小數(shù)），找最遠的重合線。計數(shù)要防止重復計數(shù)注意的原則：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。實驗五 微生物染色法一 目的要求1 學習掌握單染色的操作技術和無菌操作技術。2 了解革蘭氏染色機理，并掌握其操作技術。二 實驗內容1 分別以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus.aureus）、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌（E.coli）為材料進行革蘭氏染色，并通過顯微鏡觀察

11、，判斷其反應類型。同時說明單染色的操作技術和無菌操作技術。2 學習掌握細菌芽孢染色方法。三 實驗器材1 菌種：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。2 顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、酒精燈、接種環(huán)、吸水紙、蓋玻片、試管、水浴鍋。3 草酸銨結晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番紅色液、蒸餾水、雙料瓶（香柏油和二甲苯）、5%孔雀綠溶液。四 方法步驟（一）單染色步驟1 涂片：用1%鹽酸清潔玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸餾水，再用無菌操作的方法挑菌少許于玻片的水中，并充分混勻涂成薄膜。2 干燥：將涂片置火焰高處微熱烘干或自然干燥。3 固定：涂面朝上，通過微火2-3次。4 染色：待玻片泠卻后加結晶

12、紫1-2滴于涂片上，覆蓋涂面染色1-2分鐘。5 水洗：傾去染色液，用水自玻片一端輕輕沖洗至流下的水變無色為止（注：勿沖去菌體）。6 干燥：自然干燥，或用吸水紙吸干。7 鏡檢：油鏡觀察并繪圖。（二）革蘭氏染色步驟1 涂片：取清潔玻片一塊，并滴一滴蒸餾水，將菌種涂布在蒸餾水中。2 干燥與固定：方法同（一）中2，3步驟。3 染色：結晶紫染色1-2分鐘-水洗-碘液媒染1-2分鐘-水洗-酒精脫色15-20秒-水洗-番紅復染色2-3分鐘-水洗-干燥-鏡檢記錄。（三）細菌的芽孢染色1 制備菌液：加1-2滴蒸餾水于試管中，從斜面挑取2-3環(huán)的菌苔于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。2 加染色液：加5%孔雀綠2

13、-3滴于試管中用接種環(huán)攪拌，使其充分混合。3 加熱：將此試管浸于沸水浴中，加熱15-20分鐘。4 涂片：從試管底部挑菌液于潔凈的玻片上，涂成薄膜，晾干。5 固定：將涂片通過微火3次。6 脫色：水洗，直到流出的水中無綠色為止。7 復染：加番紅染色2-3分鐘后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸去余水，于酒精燈火焰上烘干。8 鏡檢：用油鏡觀察繪圖。五、結果與思考1 繪圖記錄觀察結果（只要求記錄革蘭氏染色結果）革蘭氏染色放大倍數(shù)_×_菌種_顏色_屬性_ 革蘭氏染色 放大倍數(shù)_×_菌種_顏色_屬性_革蘭氏染色 放大倍數(shù)_×_菌種_顏色_屬性_2 在制作涂片中，為什么要進

14、行固定這一步？3 革蘭氏染色中哪一步關鍵，為什么？六、講解時的注意事項1、要強調無菌操作的重要性。2、示范無菌操作。3、強調挑菌、涂片過程應注意事項，挑菌不宜太多。否則涂片太厚4、示范革蘭氏染色全過程5、強調酒精脫色的重要性6、強調涂片必須干燥后才能置于油鏡下觀察實驗六 細菌淀粉酶和過氧化氫的定性測定一 實驗目的通過對淀粉酶和過氧化氫的定性測定，加深對酶和酶促反應的感性認識。二 實驗器材1 藥品及試劑：肉膏胨、淀粉瓊脂培養(yǎng)基1瓶（約50mL）；0.2淀粉溶液1滴瓶、革氏碘液1滴瓶、310過氧化氫1滴瓶；2 菌種 枯草桿菌和大腸桿菌 其他來源的細菌 如土壤懸液3 儀器及其它試管4支、試管架1個、

15、培養(yǎng)皿2套、接種環(huán)三 實驗內容1 枯草桿菌培養(yǎng)液中淀粉酶的測定2 細菌淀粉酶在固體培養(yǎng)基中的擴散實驗3 過氧化氫酶的定性測定四 方法步驟（一）枯草桿菌培養(yǎng)液中淀粉酶的測定1 取4支干凈的試管，按1、2、3對照編號。放在試管架上備用。2 在1、2、3號試管中分別加入5、10、15mL的枯草桿菌培養(yǎng)液，再在1、2號試管內分別加入10、5mL蒸餾水。在對照管內加入15mL蒸餾水。3 1、2、3號試管中分別加入0.2淀粉溶液若干滴，迅速搖勻并記下反應的初始時間。4 在以上4個試管內分別滴加若干滴碘液，迅速搖勻，這時各管均呈藍色。5 觀察結果。注意各管的變化，記下各管藍色完全消失的時間，并對結果進行分析

16、。（二）細菌淀粉酶在固體培養(yǎng)基中的擴散實驗1 將肉膏胨淀粉瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待冷至45左右倒入無菌培養(yǎng)皿內（每皿約10mL），共倒5個，靜置待冷凝即成平板。2 在無菌操作條件下，所有的平板在培養(yǎng)皿底部貼好標簽后，用接種環(huán)分別挑取枯草桿菌和大腸桿菌分別在2個平板上點5個點。再打開一個平板，在空氣中放置30分鐘，蓋上培養(yǎng)皿蓋，剩余的兩個平板處理如下：一個接種土壤懸液，另一個讓學生用手在平板里氨手印，或取硬幣在平板里按一下，或打開培養(yǎng)皿蓋，搖搖頭等，所有平板倒置于37恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24-48小時。3 觀察結果，取出平板，分別在2個平板內菌落周圍滴加碘液，觀察菌落周圍顏色的變化。并記錄結果。（三）

17、過氧化氫酶的定性測定1 將配備的枯草桿菌和大腸桿菌斜面各1支放在試管架上。2 用滴管吸取過氧化氫滴加入兩管菌種斜面上。3 分析結果，把所觀察到的現(xiàn)象記錄下來，進行分析。五 結果與思考表一 枯草桿菌培養(yǎng)液中淀粉酶的測定結果記錄與分析試管藍色消失時間結果分析對照管1號2號3號表二 細菌淀粉酶在固體培養(yǎng)基中的擴散實驗結果記錄與分析培養(yǎng)皿菌種淀粉酶產生情況結果分析1號2號注：產生記為陽性“+”，不產生記為陰性“”。表三 過氧化氫酶的定性測定結果記錄與分析試管菌種過氧化氫酶有無結果分析1號2號注：有記為陽性“+”，無記為陰性“”。講解注意事項：1、 對實驗結果的講解要與理論相結合，要告訴學生為什么會有這

18、種現(xiàn)象發(fā)生。2、 讓學生對酶的理解進一步加深。啟發(fā)學生思考淀粉酶是胞內酶還是胞外酶，理解不是所有的細菌都能利用淀粉。注意對實驗現(xiàn)象的引申。3、 關于過氧化氫酶，要讓學生思考并理解為什么兩個菌都是過氧化氫酶陽性。實驗七 培養(yǎng)基的配制和滅菌一 實驗目的1 熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準備工作。2 掌握培養(yǎng)基和無菌水的制備方法。3 掌握高壓蒸汽滅菌技術。二 實驗器材1 藥品及試劑：可溶性淀粉 KNO3 K2HPO4·3H2O MgSO4·7H2O FeSO4·7H2O 1mol/L NaOH 瓊脂2 儀器及其它試管 三角瓶 燒杯 量筒 玻棒 天平 藥匙 高壓蒸汽滅菌鍋

19、pH試紙(5.5-9.0) 棉花 牛皮紙 記號筆 麻繩 紗布 干燥箱 培養(yǎng)皿 涂布棒 吸管（1ml） 玻璃珠三 實驗內容1 分組配制高氏一號培養(yǎng)基300ml。配方：可溶性淀粉 20g NaCL 0.5g KNO3 1g K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4*7H2O 0.5g FeSO4*7H2O 0.01g 瓊脂 15-25g 水 1000ml pH 7.4-7.62 每組制備玻璃珠無菌水(50ml)三角瓶2個。3 每組制備無菌水試管(4.5ml/管)10支。4 每組包9cm培養(yǎng)皿24付，6付一包。5 每組包裝1ml吸管5支，玻璃刮鏟4個。四 方法步驟（一）培養(yǎng)基的制備與分

20、裝1 稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取藥品?？扇苄缘矸巯扔蒙倭繜崴芑笤偌尤肫渌煞?，補足所需水分，混勻后加入瓊脂。2 熔化：在沸水浴鍋中加熱熔化。3 調pH：用1N NaOH調pH至7.4-7.6。4 過濾：趁熱用多層紗布過濾（本實驗勿需過濾）5 分裝：將溶化的固體培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上，裝試管時，裝量不超過試管的1/4，注意管口不要沾上培養(yǎng)基。6 加棉塞：試管應先捆成一捆，然后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上標簽，注明培養(yǎng)基名稱、日期、組別。（二）無菌水的制備7 用量筒量取50ml自來水于帶玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。8 用5ml吸管取4.5ml水于試管中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。（

21、三）器皿的準備9 培養(yǎng)皿的包裝 每6套一包，用舊報紙包扎（或放在特制鐵皮圓筒里加蓋扣嚴）。10 吸管的包裝 首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用長紙條包扎、打結。11 玻璃涂布棒的包裝方法同吸管的包裝。（四）培養(yǎng)基、無菌水、器皿的滅菌12 將培養(yǎng)基、無菌水放入高壓蒸汽滅菌鍋內，濕熱滅菌。13 滅菌完畢，將試管培養(yǎng)基擱成斜面。14 器皿放入干熱滅菌箱內，加熱滅菌。五 思考題1 培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)菌是無菌的？2 加壓蒸汽滅菌的原理是什么？是否只要壓力表上的指針指到所需的壓力時就能達到所需滅菌溫度？為什么？3 干熱滅菌應該注意哪些事項？4 管口、瓶口為什么要用棉塞？

22、能否用木塞或棉皮塞代替？為什么？六、講解注意事項1、提問學生什么是培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌告訴學生如何檢查滅菌后的培養(yǎng)菌是無菌的。2、講解滅菌的機理以及適應干熱滅菌和適宜濕熱滅菌的物品3、強調滅菌時的注意事項實驗八 細菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術一 實驗目的1 掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分離培養(yǎng)細菌的方法，從而獲得若干種細菌純種培養(yǎng)技能。2 掌握幾種接種技術。二 實驗器材1 無菌培養(yǎng)皿10套、無菌移液管1mL2支、10mL1支2 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1瓶、土壤10克、湖水1瓶、無菌稀釋水90mL、9mL的5管三 實驗內容（一）細菌純種分離的操作方法1 稀釋平板分

23、離法2 平板劃線分離法（二）幾種接種操作技術1 斜面接種技術2 穿刺接種技術3 稀釋平板涂布法四 方法步驟（一）細菌純種分離的操作方法1 稀釋平板分離法1）取樣用無菌錐形瓶到現(xiàn)場取一定量的土壤、湖水迅速帶回實驗室。2）稀釋水樣用無菌移液管取好梯度稀釋水樣。3）平板的制作用無菌移液管將各稀釋水樣加入各融化的培養(yǎng)基內，制成稀釋平板。2 平板劃線分離法1）平板的制作將融化的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內，使凝固成平板。2）操作只取一次樣，按不同方法進行劃線。（二）幾種接種操作技術1 斜面接種技術將長在斜面培養(yǎng)基（或平板培養(yǎng)基）上的微生物接到另一支斜面培養(yǎng)基上。2 穿刺接種技術將斜面菌種接種到半固體深層培養(yǎng)基

24、。3 稀釋平板涂布法把聚集在一起的群體分散成能在培養(yǎng)基上長成單個菌落。五 思考題1 用一根無菌移液管接種幾種濃度的水樣時，應從哪個濃度開始？為什么？六、講解時的注意事項1、讓學生明白為什么在菌種分離時要做稀釋。2、讓學生明白理解并掌握什么是倒平板，什么是稀釋平板分離法，什么是平板畫線分離法，什么是稀釋平板涂布法等經典的微生物分離的方法。3、理論聯(lián)系實際，啟發(fā)學生用所學的分離細菌的方法設計一個分離具有某種功能的細菌。讓學生理解選擇性壓力法分離細菌的作用，富集培養(yǎng)基的應用等。實驗九 純培養(yǎng)菌種的菌體、菌落形態(tài)的觀察一 實驗目的觀察上一實驗分離出來的幾種細菌的個體形態(tài)及與其相應的菌落形態(tài)特征。通過觀察比較細菌、放線菌、酵母菌及霉菌的菌落特征，達到初步鑒別上述微生物的能力。二 實驗器材1 顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈2 上一實驗培養(yǎng)出的各種細菌，實驗室配給放線菌、酵母