細胞工程習題-第九章

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第九章復(fù)習題一、從培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)設(shè)備上比較分析植物細胞培養(yǎng)與微生物細胞培養(yǎng)的異同。1、植物細胞與微生物細胞對比： 細菌、真菌、植物細胞都有細胞壁。 細菌無成形的細胞核，真菌、植物細胞有成形的細胞核。 細菌只有核糖體一種細胞器。 植物細胞比微生物細胞大（10200微米，30-100倍）。 植物細胞很少以單一細胞形式懸浮生長，通常以一定細胞數(shù)的非均相細胞團 方式存在。 植物細胞具有纖維素細胞壁和大的液泡，很容易被剪切力損傷。 植物細胞生長速度慢，操作周期長（2-3周甚至2-3個月）。 植物細胞培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜，適合微生物生長，因此防止污染更困難。 植物細胞培養(yǎng)

2、一般需要光照。2、培養(yǎng)基對比： 植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要由碳源、氮源、無機鹽、維生素、植物生長激素、有機酸和一些復(fù)合物質(zhì)組成。目前應(yīng)用廣泛的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有：MS、B5、N6等無機鹽：大量元素N/S/P/K/Ca/Mg等、微量元素有機物：糖類、氨基酸、維生素等調(diào)節(jié)物質(zhì)：激素 與微生物培養(yǎng)基相比：需要大量無機鹽，多種維生素和激素，一般采用無機氮源，一般以蔗糖為碳源。3、培養(yǎng)方法對比：植物細胞：經(jīng)酶解法或愈傷組織法得單細胞再進行培養(yǎng)；方法有看護培養(yǎng)、飼養(yǎng) 層培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、細胞懸液培養(yǎng)微生物細胞：固體斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)4、培養(yǎng)設(shè)備：植物細胞：細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，一般都有三部分組成：反應(yīng)罐、控制系統(tǒng)、檢

3、 測分析系統(tǒng)。微生物細胞：傳統(tǒng)微生物發(fā)酵罐二、請分析限制植物細胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)有價值次級代謝產(chǎn)物的影響因素。 次級代謝產(chǎn)物（Secondary metabolites） 是通過次級代謝合成的產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。影響因素：1、生物因素細胞株：穩(wěn)定、高產(chǎn)、生長速度快的細胞株是細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的前提。在進行植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有價值的代謝產(chǎn)物時必須弄清楚產(chǎn)物的合成部位，也就是應(yīng)該考慮到不同部位來源細胞的特性。細胞凋亡：是植物細胞培養(yǎng)過程中不可避免的現(xiàn)象，保證充足的營養(yǎng)供給以及避免有害代謝產(chǎn)物的積累，可以減少細胞凋亡。細胞團：細胞團的形成

4、影響穩(wěn)定的懸浮體系的維持，同時造成了培養(yǎng)物的顯著異質(zhì)性，細胞團表面與內(nèi)部的細胞存在營養(yǎng)吸收和代謝產(chǎn)物分泌的差異。此外，細胞團容易受剪切力影響而破碎，引起培養(yǎng)液粘度增加，致使氣體交換與傳遞受到影響。要保持反應(yīng)器良好的混合效果。適當大小的細胞團有利于代謝產(chǎn)物積累。生物合成機制：次級代謝產(chǎn)物的生物合成不同于蛋白質(zhì)合成，涉及多基因參與（基因簇），機制非常復(fù)雜，影響因素非常多。結(jié)合目標產(chǎn)物進行生物合成機制研究，揭示代謝途徑及誘導(dǎo)合成機制是細胞培養(yǎng)的重要生物學(xué)問題，有利于指導(dǎo)建立優(yōu)化的培養(yǎng)工藝與技術(shù)。2、化學(xué)因素：營養(yǎng)鹽：一方面是保證植物細胞生物量的增長；另外一方面是要保證細胞能合成和積累次級代謝產(chǎn)物。前

5、體（precursor ）：缺乏某一種前體時細胞就不能合成某一種代謝物。如果在培養(yǎng)基中加入外源前體將會有助于合成該代謝產(chǎn)物或使其產(chǎn)量增加。誘導(dǎo)子：狹義誘導(dǎo)子：是指那些能夠與細胞發(fā)生相互作用，通過細胞內(nèi)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，作用于與細胞次生代謝相關(guān)的基因表達，進而改變細胞次生代謝相關(guān)酶的活力，最終使細胞次生代謝水平發(fā)生改變的物質(zhì)。廣義誘導(dǎo)子：是指所有能夠提高細胞次生代謝相關(guān)酶活力，進而提高細胞次生代謝水平的外界因素。溫度、光照、紫外線、紅外線等都是廣義誘導(dǎo)子。反饋抑制：植物次級代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)系統(tǒng)的積累有時會對目標產(chǎn)物的合成具有反饋抑制?？梢圆捎昧骷?半連續(xù)培養(yǎng)、兩相培養(yǎng)等工藝技術(shù)克服。3、物理因

6、素：光照：光對細胞代謝產(chǎn)物的合成有很重要的影響。光照時間長短、光質(zhì)、光強等都會對代謝產(chǎn)物合成和積聚產(chǎn)生作用。光對許多酶有誘導(dǎo)或抑制作用。溫度：溫度會影響酶的活性。細胞的生長速率與培養(yǎng)溫度緊密相關(guān)。植物細胞培養(yǎng)一般在25左右進行。pH：會影響培養(yǎng)液的滲透壓、酸堿度，酶的活性，從而影響細胞代謝。植物細胞液體培養(yǎng)的pH 變化范圍在56 之間，最佳的起始pH在5.55.8 之間。4、工程技術(shù)問題培養(yǎng)液的流變特性：由于植物細胞培養(yǎng)過程中容易結(jié)團，同時，不少細胞在培養(yǎng)過程中容易分泌粘多糖等物質(zhì)，從而使傳氧速率降低，影響細胞生長。粘度變化可以由細胞本身或其分泌物等引起。前者包括細胞濃度、年齡、大小、結(jié)團情況

7、等。氣體傳遞：與微生物不同，植物細胞培養(yǎng)一般需要光照，通過光合作用合成有機物，因此氧氣和CO2的含量與傳遞對培養(yǎng)過程影響較大。氧的傳遞與通氣速率、培養(yǎng)液混合程度、培養(yǎng)液流變特性、氣液界面面積等因素有關(guān)；而氧的吸收與反應(yīng)器類型、細胞生長速率、溫度、pH、營養(yǎng)組成、細胞濃度等相關(guān)。攪拌與剪切力：為了加強氣液固之間的傳質(zhì)，細胞懸浮培養(yǎng)時需要混合攪動。植物細胞雖然有較硬的細胞壁，但是細胞壁很脆弱，對攪拌的剪切力很敏感。由于剪切力比較大，細胞會自溶，次級代謝產(chǎn)物合成會降低。泡沫與器壁表面粘附性：與微生物細胞培養(yǎng)相比，植物細胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氣泡更大，而且由于培養(yǎng)液含有蛋白質(zhì)或粘多糖，粘度大，細胞很容易被

8、包埋在泡沫里，造成非均相培養(yǎng)，也可從營養(yǎng)液中帶出來，造成損失或污染。因此，必須對泡沫進行消除。消泡劑、機械去除。5、提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑：培養(yǎng)設(shè)備：選擇或設(shè)計合適的生物反應(yīng)器。培養(yǎng)工藝：誘導(dǎo)子添加、前體喂養(yǎng)、添加競爭途徑代謝產(chǎn)物抑制劑、培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、環(huán)境條件）優(yōu)化與控制、流加培養(yǎng)。培養(yǎng)技術(shù)：固定化培養(yǎng)技術(shù)、兩相培養(yǎng)技術(shù)、兩步法培養(yǎng)（第1步細胞生長；第2步產(chǎn)物積累）。三、查閱文獻，通過一個例子詳細說明通過植物細胞或組織培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的應(yīng)用。毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究進展長春花毛狀根培養(yǎng)及抗癌生物堿產(chǎn)生的研究 植物作為天然藥物、香料、色素、以及農(nóng)藥和工業(yè)原料等重要來源，是工業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的資源。利用生物技術(shù)生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物主要有兩種方法，即植物細胞培養(yǎng)和植物器官培養(yǎng)。由于毛狀根具有激素自養(yǎng)、生長迅速、生長周期短等特點，同時由于它是分化程度很高的器官培養(yǎng)物，代謝通路能夠比較完整地表達，尤其是一些特殊的次生代謝產(chǎn)物的高效合成較為穩(wěn)定，為大量生產(chǎn)提供了有用的手段。 為建立長春花毛狀根轉(zhuǎn)化體系，從毛狀根中獲得生物堿，用發(fā)根農(nóng)桿菌A4和R1000菌株分別感染長春花的不同外植體獲得毛狀根，并對毛狀根的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。 采用A4感染葉片，分別預(yù)、共培養(yǎng)2d及添加100mg/