堿性磷酸酶的分離純化與性質(zhì)研究新

1、堿性磷酸酶的分離純化與性質(zhì)研究生物技術(shù)1101班 其曼古麗麥麥提 201131301028 摘要：經(jīng)過(guò)勻漿，正丁醇處理，凝膠過(guò)濾等步驟，從豬肝中部分純化了堿性磷酸酶。以磷酸苯二鈉為底物，測(cè)得該酶的最適 pH為10， 最適溫度為37， Km = 1.6565。KH2PO4對(duì)酶的活性有不同程度的抑制作用。 關(guān)鍵詞：豬肝，堿性磷酸酶，分離純化，性質(zhì)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,簡(jiǎn)稱AKP) 是一種底物專一性較低的磷酸單酯酶，廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物與微生物中，在生物體內(nèi)直接參與了磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝過(guò)程【1】。它在脊椎動(dòng)物的骨化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用【1】。海洋中的甲殼動(dòng)物鋸

2、緣青蟹體內(nèi)的堿性磷酸酶是其賴以生長(zhǎng)、生存的重要酶類之一，它對(duì)海水中鈣質(zhì)的吸收、磷酸鈣的形成、甲殼素的形成與分泌都具有重要作用【2】。提純的堿性磷酸酶可用于核酸研究、毒物學(xué)研究及醫(yī)學(xué)研究【3】。由于有益于皮膚細(xì)胞的再生和新陳代謝，該酶還可添加到藥用化妝品中【4】。為了滿足生產(chǎn)實(shí)踐上的需要，僅國(guó)內(nèi)以豬肝為材料來(lái)分離純化堿性磷酸酶并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行分析的研究工作即已有若干。 1.1 材料與方法1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新鮮的豬肝臟。1.1.2試驗(yàn)儀器玻璃勻漿器，離心機(jī)，加樣搶，恒溫水浴鍋。1.1.3試驗(yàn)試劑 0.5mol/L醋酸鎂溶液；2，0.1mol/L醋酸鈉；3，0.01mol醋酸鎂-0.01mol/L

3、醋酸鈉溶液；4，Tris-HCl PH8.8緩沖液；5，正丁醇；6，丙醇；7，95%乙醇；8，0.04mol/L作用物底物；9，0.1mol/L碳酸鹽緩沖液（PH 10.0）；10，堿性磷酸酶液；11，0.5mol/L NaOH溶液；12，0.3%-氨基安替比林；13，0.5mol/L鐵氰化鉀；14，基質(zhì)液，15，0.2m甘氨酸；16，0.2NaOH； 1.1.4 試劑配制0.5mol/L醋酸鎂溶液：107.25g醋酸鎂溶于蒸餾水中，定容至1000ml。0.1mol醋酸鈉溶液：8.2g醋酸鈉溶于蒸餾水中，定容至1000ml。0.01mol/L醋酸鎂-0.01mol/L醋酸鈉溶液：準(zhǔn)確吸取20m

4、l0.5mol/L醋酸鎂溶液及100ml0.14mol/L醋酸鈉溶液，混合后定容至1000。Tris-HCl PH8.8緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷12.1g用蒸餾水溶解后定容至1000ml，即為0.1mol/LTris溶液。取100ml0.1mol/LTris溶液，加蒸餾水約780ml，再加0.1mol/L醋酸鎂溶液，混合后用1%冰醋酸調(diào)PH為8.8，用蒸餾水定容至1000ml。0.04mol/L作用物液：稱取10.16磷酸二甲苯二鈉，用煮沸后冷卻的蒸餾水溶解并稀釋至1000ml，加4ml氯仿防腐，存于棕色瓶?jī)?nèi)，放于冰箱內(nèi)保存。0.1mol/L碳酸鹽緩沖液:取無(wú)水碳酸鈉6.36及碳酸氫鈉3.

5、36，溶解于蒸餾水中，并稀釋至1000ml。堿性磷酸酶液：取純化的堿性磷酸酶5mg，用PH緩沖液配制成100ml，放置冰箱內(nèi)保存。0.3%4-氨基安替比林：稱取3g4氨基安替比林及碳酸氫鈉42g，用蒸餾水溶解至1000ml。0.5%鐵氰化鉀：稱取10g鐵氰化鉀及30g硼酸各溶于800ml蒸餾水中溶解后兩液混合加水至2000ml?；|(zhì)液：稱取磷酸苯二鈉.2H2O 6g，4-氨基安替比林3g，分別溶于煮沸冷卻的蒸餾水中，兩液混合并稀釋至1000ml， 加4ml氯仿防腐。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 堿性磷酸酶的分離純化取新鮮豬肝20g剪成組織糜，加入0.1mol/L醋酸鎂0.1mol/L醋酸鈉60m

6、l，在電動(dòng)勻漿器上勻漿。取32.5ml肝勻漿液與10ml的正丁醇混合，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?5分鐘后室溫放置30分鐘，然后用四層紗布過(guò)濾。在23.5ml的濾液中加入等量的冷丙酮（-10保存）混勻后3000轉(zhuǎn)冰凍離心5分鐘，離心后棄去上清液取沉淀，然后加入0.5mol/L醋酸鎂20ml混勻，用量筒量取29.5ml懸液，加入96%乙醇12.9ml至30%， 3000轉(zhuǎn)離心5分鐘。離心后棄沉淀取上清液33.5ml，加96%乙醇27.9ml至65%， 3000轉(zhuǎn)離心5分鐘。將上清液棄去，在沉淀中加入0.1mol/L醋酸鎂0.1mol/L醋酸鈉20ml溶解，再加入96%乙醇9.75ml至30%， 3000轉(zhuǎn)

7、離心5分鐘，此次離心后棄沉淀取上清液29.5ml，加入96%乙醇24.5ml至60%， 3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，離心后取沉淀，加入0.5mol/L醋酸鎂15ml溶解，使溶液總體積為17.5ml，加入99.5%丙酮8.2ml至33%， 3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液加入99.5%丙酮7.65ml至50%，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，得到沉淀后加入pH8.8Tris緩沖液10ml溶解，溶液即為部分純化的堿性磷酸酶，將其分裝成1ml/瓶，置-20冰箱保存。1.2.2 堿性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)鑒定-Km測(cè)定取大試管7支，按下表操作：加入酶液，混勻之后立即記時(shí)，各管在37水浴中準(zhǔn)確保溫15分鐘后，加入0,5molN

8、aoh液1.0ml以終止反應(yīng)。顯色：各管加入0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%鐵氰化鉀2.0ml，充分混勻，放置10分鐘，以0管為對(duì)照在波長(zhǎng)510nm下比色，記錄各管的吸光度。作圖：所測(cè)各管的吸光度代表各管中的反應(yīng)速度v，以之為縱軸，以作物濃度s為橫軸，在坐標(biāo)紙上鏈接個(gè)點(diǎn)作圖，觀察曲線的形狀。以各吸光度值得倒數(shù)為縱軸，以作物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，作圖求出km值。1.2.3 堿性磷酸酶的最適PH及酸性穩(wěn)定性試驗(yàn) PH-活性曲線的制作取6支試管，按下表操作管號(hào) 1 2 3 4 5 0反應(yīng)PH 8 9 10 11 12 10相應(yīng)PH緩沖液 各加0.5ml酶液 各加0.1ml（0號(hào)管酶液在鐵氰化

9、鉀之后加） 37預(yù)熱5分鐘預(yù)熱的基質(zhì)液 各加3.0ml 37精確保溫15min各加1.0ml堿性溶液終止反應(yīng)0.5%的鐵氰化鉀 各加2.0ml 靜置10minA510測(cè)試各管的A510值，以反應(yīng)Ph值為橫坐標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)繪制PH活性曲線，求出堿性磷酸酶在本實(shí)驗(yàn)下的最適PH。 酸堿穩(wěn)定范圍的測(cè)定取6支試管，按1至5管編號(hào)，空白管為0號(hào)，按下表操作管號(hào) 1 2 3 4 5 0處理PH 8 9 10 11 12 10相應(yīng)PH緩沖液 各加0.1ml酶液 各加0.1ml 37處理1小時(shí)0.1MPH10的碳酸鹽緩沖液 各加0.5ml預(yù)熱的基質(zhì)液 各加3.0ml（0號(hào)管基質(zhì)液在鐵氰化鉀之后加） 37精

10、確保溫15min各加1.0ml堿性溶液終止反應(yīng)0.5%的鐵氰化鉀 各加2.0ml 靜置10minA510測(cè)得各管A510值，以PH為橫坐標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)，繪制酸堿穩(wěn)定曲線，并分析堿性磷酸酶的酸堿穩(wěn)定范圍。1.2.4 堿性磷酸酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。溫度-活性曲線的制作取4支試管，按下表操作管號(hào) 1 2 3 0 反應(yīng)溫度（） 25 37 80 37 稀釋酶液 各加0.1ml（0號(hào)管酶液在鐵氰化鉀之后加）預(yù)熱的復(fù)合基質(zhì)液 各加3.0ml 分別在不同溫度下精確反應(yīng)15min，各加1.0ml堿性溶液終止反應(yīng) 各加0.5%的鐵氰化鉀2.0ml 靜置10minA510測(cè)各管的A510,以反應(yīng)溫度為

11、橫坐標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)，繪制溫度-活性曲線圖，求出堿性磷酸酶在本實(shí)驗(yàn)條件下的最適溫度。 熱穩(wěn)定性取4支試管，按下表操作管號(hào) 1 2 3 0 熱處理溫度（） 25 37 80 25熱處理時(shí)間（分） 15 15 15 15酶液 （ml） 各加0.1ml（0號(hào)管酶液在鐵氰化鉀之后加）在上述相應(yīng)溫度的恒溫水浴內(nèi)放置相應(yīng)時(shí)間后取出，立即以流動(dòng)水冷卻并置于37恒溫水浴鍋中預(yù)熱2分鐘預(yù)熱的復(fù)合基質(zhì)液 各加3.0ml 37精確反應(yīng)15min，各加1.0ml堿性溶液終止反應(yīng) 各加0.5%的鐵氰化鉀2.0ml 靜置10minA510測(cè)出各管A510值，以處理溫度為橫坐標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)。繪制熱穩(wěn)定曲線，并分析

12、在本實(shí)驗(yàn)條件下的堿性磷酸酶的熱穩(wěn)定性值范圍。1.2.5 抑制劑類型鑒別KH2PO4的抑制劑作用取6支試管，按下表操作管號(hào) 1 2 3 4 5 040mmol/L底物溶液 0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0碳酸鹽緩沖液 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9蒸餾水 0.80 0.70 0.60 0.50 0.10 0.900.25mKH2PO4 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混勻，37預(yù)熱5min酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1最終底物濃度 2 4 6 8 16 0 37精確保溫15min4 按順序各加1.0ml堿性溶液，1ml 4

13、-氨基安替吡啉，2ml鐵氰化鉀 靜置10min A510測(cè)出各管A510值，以底物濃度倒數(shù)為橫坐標(biāo)，作圖，觀察直線在縱軸和橫軸上的交點(diǎn)位置并計(jì)算其Km值，于未加抑制劑時(shí)的Km值比較，說(shuō)明該抑制劑屬于何種類型。2 結(jié)果與分析2.1 酶的分離純化將豬肝勻中加入正丁醇，經(jīng)過(guò)濾后，濾液用冷丙酮和冷乙酸進(jìn)行重復(fù)分離純化，獲得較為純凈的堿性磷酸酶。分裝在1ml的小管，一共10管，在-20的冰箱中保存。2.2 Km的測(cè)定在Km的測(cè)定時(shí)，各管的吸光度如下：0.443、0.612、0.508、0.559、0.550、0.589、0.638由于，第二管測(cè)得的吸光度明顯不對(duì)，所以，取后五管的吸光度的倒數(shù)作縱坐標(biāo)，以

14、后五管的作用物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。根據(jù)數(shù)據(jù)作圖如下：根據(jù)y=2.4182x+1.4598 算出Km值，即y=0,x=-14598/24182=-1/Km 所以，Km=1.6565。2.3 堿性磷酸酶的最適pH及酸堿穩(wěn)定性pH對(duì)酶活性的影響極為顯著，通常各種酶只有在一定的范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性。pH對(duì)酶活性有很大影響，而且對(duì)酶的穩(wěn)定性也有很大影響。在37的測(cè)活體系中，改變緩沖液的pH值,測(cè)各管的吸光度。以pH為橫坐標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)繪制pH-活性曲線，如圖所示：根據(jù)數(shù)據(jù)及圖可知本實(shí)驗(yàn)中堿性磷酸酶的最適PH為10.酶在過(guò)酸或過(guò)堿的條件下很容易變性失活，酸堿度對(duì)酶的穩(wěn)定性有很大的影響。以pH為橫坐

15、標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)，繪制酸堿穩(wěn)定曲線，如圖所示： 根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖可知pH為10的情況下該酶最穩(wěn)定，pH過(guò)高或過(guò)低會(huì)影響酶的穩(wěn)定性。2.4 最適溫度及熱穩(wěn)定性對(duì)溫度的敏感性是酶的又一個(gè)重要特性。溫度對(duì)酶的作用具有雙重影響，一方面與一般的化學(xué)反應(yīng)一樣，溫度加速酶反應(yīng)速度；另一方面該酶是蛋白質(zhì)，溫度加速酶蛋白的變性速度，因此，在較低的溫度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨溫度升高而增大，但是超過(guò)一定溫度后，反應(yīng)速度反而下降。酶反應(yīng)速度達(dá)到最大值時(shí)的溫度稱為酶反應(yīng)的最適溫度。在不同溫度條件下測(cè)定酶的活性，以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)，繪制溫度-活性曲線圖：根據(jù)數(shù)據(jù)和圖可知37時(shí)，酶活性最高。將酶在25,

16、37,80下處理，然后再在一定溫度條件下測(cè)定酶活力。以處理溫度為橫座標(biāo)，A510為縱坐標(biāo)繪制熱穩(wěn)定曲線：觀察圖可知37時(shí)該酶穩(wěn)定性最好。2.5 抑制劑類型鑒別抑制劑是引起酶促反應(yīng)速度降低的一類物質(zhì)的統(tǒng)稱。根據(jù)抑制劑與酶結(jié)合的特點(diǎn)可分為不可逆抑制劑和可逆抑制劑兩種類型。 在可逆抑制類型中，根據(jù)抑制劑、底物和酶三者的相互關(guān)系，又可分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制三種。在競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，酶不能同時(shí)和底物、抑制劑結(jié)合，即不能形成EIS，其動(dòng)力學(xué)特征是：米氏常數(shù)的表觀值K，m增加，酶的最大反應(yīng)速度Vm不變。 在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，抑制劑、底物都能同時(shí)和酶結(jié)合形成EIS，但是EIS不能進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物

17、，其動(dòng)力學(xué)特征是：Vm降低而Km不變。在反競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，抑制劑必須在酶和底物結(jié)合以后才能和酶結(jié)合形成EIS，即Ki=，其動(dòng)力學(xué)特征是；Km和Vm都發(fā)生了變化。本實(shí)驗(yàn)中KH2PO4作為堿性磷酸酶的抑制物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作可測(cè)得吸光度，以底物濃度倒數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖：根據(jù)y=4.1376x+1.1787算出Km值，即y=0, x=-11787/41376=-1/Km 所以，Km=3.5103。根據(jù)Km值和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)上的三種抑制類型的圖片，可以看出這個(gè)抑制劑是反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。3 結(jié)果與討論 堿性磷酸酶分離純化后應(yīng)-20保存，應(yīng)調(diào)好溫度等條件，避免溫度過(guò)高或過(guò)低影響酶的活性。采用豬肝提取堿性磷酸酶來(lái)測(cè)定其Km時(shí)，一般可稀釋2-3倍，由于各實(shí)驗(yàn)室所用試劑等各種條件差異，酶活性可能有不同，所以在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)作調(diào)節(jié)，按本實(shí)驗(yàn)條件，用最高的作用物濃度管做實(shí)驗(yàn)，所得到的吸光度應(yīng)調(diào)節(jié)在0.8以下，如酶活性過(guò)大，在規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)作用物分解過(guò)快，所測(cè)到的數(shù)值將與反應(yīng)初速度相差較遠(yuǎn)，則所測(cè)的Km不準(zhǔn)。如酶活性過(guò)低則受測(cè)定方法的靈敏度限制。如從第一管加入酶液開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔1分鐘向下一只試管加酶液,直至加完，到準(zhǔn)確15分鐘立即向第一管加堿試劑，以終止其反應(yīng)，并每隔1分鐘向下一只試管加堿試劑，直至加完止，這樣保證每管準(zhǔn)確保溫15分鐘。