生物化學教案上冊

1、生物化學教案院系： 食品與生物工程學院專業(yè)： 生物工程09級 教師： 馮 昕 時間： 2010-2011年第一學期 所用教材：王鏡巖、朱圣庚主編高等教育出版社出版緒論主要內容：生物化學的涵義、學科的形成和發(fā)展、本課程的內容組成、為什么要學習生化、學習生化注意的幾個問題目的：了解生物化學的含義及生物化學的發(fā)展史，掌握生物化學組成的30種分子。一、生物化學的含義生物化學是關于生命的化學本質的科學。它是以研究生物體的化學組成，生物物質的結構和功能，生命過程中物質變化和能量變化的規(guī)律，以及一切生命現象的生物化學原理為基本內容的科學。二、學科的形成和發(fā)展1、史前（19世紀以前）積累了許多與生化有關的實踐

2、經驗。我們的祖先早在公元前22世紀就用谷物釀酒；公元前12世紀就會制醬；公元7世紀孫思邈就用車前子、杏仁等中草藥治療腳氣，用豬肝治療夜盲癥；18世紀70年代，Scheele從動植物材料中分離出甘油及檸檬酸、蘋果酸、乳酸、尿酸等有機物；18世紀80年代，Lavoisier證明了呼吸就是氧化作用，他還證明了酒精發(fā)酵本質上是一系列的化學過程。2、19世紀，人們對生命現象展開了比較廣泛的研究，對生命的化學本質的認識有了很大的提高，為生物化學學科的形成奠定了基礎。1810年Gay-lussac推導出了酒精發(fā)酵的反應式；19世紀50年代Pasteur證明了酒精發(fā)酵是微生物引起的，排除了發(fā)酵自生論。1877

3、年，Hoppe-Seyler首次提出“biochemie”(生物化學)這一名詞，并創(chuàng)辦了生理化學雜志；1897年Bchner兄弟利用酵母汁液發(fā)酵蔗糖產生酒精的研究，是生化發(fā)展早期的一個里程碑。3、上世紀30年代到80年代，生物化學進入快速發(fā)展的時期。脂肪酸氧化降解途徑、糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)途徑的基本化學過程都是在30年代提出的；1955年，Sanger首次完成了牛胰島素分子的一級結構分析；1965年，我國生物化學家率先完成了結晶牛胰島素分子的人工合成；1965年，Monod提出了蛋白質變構學說。4、近20多年來，酶工程、遺傳工程、細胞工程都得到了快速發(fā)展。其中DNA重組技術已成為當代最突出的

4、科學成就之一。三、本課程的內容組成1、生物體的化學組成： 30種前提物質稱為生物化學的字母表20種氨基酸；5種芳香族堿基，2種嘌呤（腺嘌呤和鳥嘌呤）和3種嘧啶（胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶）；2種草糖，D-葡萄糖和D-核糖；脂肪酸、甘油和膽堿。由以上單位分子或它們的衍生物為基本單位組成的糖類、脂類、蛋白質、核酸以及對代謝起催化作用的酶、維生素和激素，通常被生物化學中的四大基本物質和三大活性物質。2、代謝的研究代謝是生物體與外界的物質和能量交換過程，是活細胞進行的復雜的系列酶促反應過程，包括同化作用和異化作用。六類化學反應：氧化還原反應、基團轉移反應、水解反應、裂解反應、異構反應和合成反應。3、遺傳

5、的分子基礎及代謝調節(jié)生物性狀之所以能代代相傳，是靠核酸和蛋白質作為物質基礎。DNA是遺傳信息的載體，通過DNA分子的半保留復制，將遺傳信息傳遞給子代，再通過蛋白質的生物合成將生物的遺傳性狀表達出來。4、生化實驗生化是一門實驗學科，生化理論本身就是通過實驗研究發(fā)展起來的。新技術的應用往往成為生化理論發(fā)展的關鍵。1940年，瑞典的Svedberg發(fā)明了超速離心技術；1937年Tiselins發(fā)明了電泳技術；上世紀40年代英國化學家發(fā)明了紙上層析，Sanger對胰島素的序列分析主要是依靠紙上層析技術完成的；（1）分配色譜法的創(chuàng)立快捷、經濟的分析技術由Martin.Synge創(chuàng)立。（2）Tiselli

6、us用電泳方法分離血清中化學構造相似的蛋白質成分。吸附層析法分離蛋白質及其他物質。（3）Svedberg第一臺超離心機，測定了高度復雜的蛋白質。（4）熒光分析法，同位素示蹤，電子顯微鏡的應用，生物化學的分離、純化、鑒定的方法向微量、快速、精確、簡便、自動化的方向發(fā)展。生化實驗是生化課程內容的重要組成部分。四、為什么要學習生化生物化學既是由多學科共同孕育形成并發(fā)展起來的邊緣學科，又是生物及醫(yī)、農各學科必不可少的基礎學科；既是在理論和技術方面都有很大影響的帶頭學科，又是涉及面很廣的應用學科。無論就其在自然科學中的地位來看，還是從其在國民經濟建設中的作用來看，都是一門十分重要的學科。使同學們了解生物

7、化學發(fā)展的歷史，掌握生命活動中重要組成成分糖、脂、蛋白質、酶、核酸的結構和性質，了解維生素、抗生素、激素和生物膜組成、種類、性質和功能，對于生物體內分子水平上所發(fā)生各種代謝反應有較深入的認識，熟悉其中重要的生物化學反應過程，同時對生物體內的各種反應的規(guī)律有一個基本的認識，從而為學習其他的高等生物學課程打下良好的基礎。五、學習生化應注意的幾個問題1、建立起以生物功能為軸線的思維體系生物化學的理論體系是以生物功能為軸線建立起來的，不同于無機化學以元素周期為基礎的理論體系；也不同于有機化學以官能基團為基礎的理論體系。從靜態(tài)化學到動態(tài)化學都貫穿著生物功能這根軸線。而且，分子結構和生物功能的關系更是生化

8、討論的內容。2、注意學習技巧3、要充分利用實驗課的機會來提高分析問題、解決問題和動手的能力。第一章 蛋白質重點：氨基酸的分類、氨基酸的酸堿化學、氨基酸的化學反應、氨基酸混合物的分析分離；肽、肽單位和肽平面、蛋白質一級結構的測定、穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力、二級結構：多肽鏈折疊的規(guī)則方式、超二級結構和結構域、球狀蛋白質與三級結構、亞基締合和四級結構；蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀、蛋白質的分離純化方法。難點：肽、肽單位和肽平面、多肽鏈折疊的規(guī)則方式、超二級結構和結構域、蛋白質一級結構的測定、蛋白質的分離純化方法。蛋白質是一類重要的生物大分子，蛋白質在生物體內占有特殊的地位，蛋白質和核酸是構成細胞

9、內原生質的主要成分，而原生質是生命現象的物質基礎。蛋白質存在于幾乎所有的生物細胞中，是構成生物體最基本的結構物質和功能物質。蛋白質是生命活動的物質基礎，它參與了幾乎所有的生命活動過程。一、蛋白質的化學組成 蛋白質主要由C、H、O、N、S等元素組成，有些蛋白質還含有其它的一些元素，如鐵、銅、鋅等。蛋白質的平均含氮量為16，這是蛋白質元素組成的一大特定，也是凱氏定氮法測定蛋白質含量的基礎。測得含氮量之后，只要乘以6.25就可得到物質的蛋白含量。二、蛋白質的水解蛋白質的水解是研究蛋白質組成的重要方法。蛋白質可以被酸、堿或酶催化水解，得到各種氨基酸或小的肽段。根據蛋白質的水解程度可以分為完全水解和部分

10、水解兩種情況。完全水解也稱徹底水解，得到的是各種氨基酸的混合物。部分水解也稱不完全水解，得到的是各種大小不等的肽段和氨基酸。水解的方法主要由酸水解、堿水解和酶水解三種。1、酸水解常用H2SO4或HCl。一般用6mol/LHCl，4mol/LH2SO4，回流煮沸20h左右可使蛋白質完全水解。優(yōu)點是不引起消旋作用，可到L-氨基酸。缺點是色氨酸安全被破壞，羥基氨基酸（絲氨酸和蘇氨酸）部分分解，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下來。2、堿水解一般用5mol/NaOH，煮沸1020h，可使蛋白質完全水解。但多數氨基酸不同程度的被破壞，并產生消旋現象，得到D-和L-型氨基酸，能引起精氨酸脫氨形成鳥氨酸和尿

11、素。但色氨酸是穩(wěn)定的。3、酶水解不產生消旋作用，不破壞氨基酸，但使用一種酶往往不能水解徹底。需要幾種酶的協(xié)同作用。三、氨基酸（一）-氨基酸的一般結構從不同天然蛋白質完全水解產物中分離到的20種基本氨基酸，稱為常見氨基酸。它們的分子結構有兩個共同的特點：1、除脯氨酸是亞氨基酸外，其余19中氨基酸都是-氨基酸，即與羧基相鄰的碳原子（-碳原子，C）上都有一個氨基，連接在-碳原子上的還有一個氫原子和一個可變的側鏈（R），各種氨基酸的區(qū)別作于R的不同。通式如圖；2、 除了甘氨酸之外，都是L-型氨基酸。甘氨酸的-碳原子不是不對稱碳原子，其它都是。不對稱碳原子是指與四個不同的原子或原子基團共價相連因而失去對

12、稱性的碳原子。也稱手性碳原子、手性中心。常用C*表示。構型是指不對稱碳原子的四個取代基在空間的相對取向。兩種構型形成鏡面異構，也叫旋光異構。甘油醛C2為不對稱碳原子，其上的羥基有兩種安排，羥基向左為L型，向右為D型。DL與（）不同。記三字母簡寫式。（二）氨基酸的分類氨基酸分類的方式很多，可以從不同的角度去分。1、根據R基團的不同可分為4類。（1）脂肪族氨基酸 包括Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、Lys、Arg共15種。（2）芳香族氨基酸 包括Pre、Tyr。（3）雜環(huán)氨基酸 包括His、Trp。（4）雜環(huán)亞氨基酸 Pro。

13、2、根據R基團的極性不同可分為2類。（1）非極性氨基酸 共9種。Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pre、Trp、Met、Pro。（2）極性氨基酸不帶電荷的極性氨基酸 包括Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys，此組氨基酸比非極性氨基酸易溶于水，他們帶有不解離的基團可與水形成氫鍵。帶負電荷的極性氨基酸 包括Asp、Glu，他們屬于酸性氨基酸，在pH7時帶負電荷。帶正電荷的極性氨基酸包括Arg、Lys、His，他們屬于堿性氨基酸，在pH7時帶正電荷。（3）按酸堿性來分酸性氨基酸 Asp、Glu。堿性氨基酸 Arg、Lys、His。中性氨基酸 其它氨基酸。（4）人體是否能合成分必需氨

14、基酸 人體不能合成，必需從食物中攝取的氨基酸。包括Lys、Thr、Met、Val、Leu、Ile、Trp、Pre。半必需氨基酸 成人能合成但新生兒不能合成的氨基酸。包括His、Arg。非必需氨基酸其它氨基酸。（三）氨基酸的理化性質1、兩性解離和等電點（1）概念氨基酸分子中具有堿性基團氨基（-NH2）和酸性基團羧基（-COOH），在晶體或水溶液中主要以兼性離子的形成存在。它即有酸的作用，又有堿的作用。象氨基酸這種在同一分子中帶有性質相反的酸、堿兩種解離基團的化合物，稱為兩性化合物或兩性電解質；兩性電解質的解離受環(huán)境pH值的影響，改變環(huán)境的pH可以使氨基酸帶上不同的電荷，也可使它處于正負電荷相等的

15、狀態(tài)，此時氨基酸的凈電荷為零，此時的pH稱為氨基酸的等電點。在等電點時氨基酸的凈電荷為零，在電場中既不向正極移動也不向負極移動。而且此時氨基酸的溶解度最小，易發(fā)生沉淀。各種氨基酸都有其特定的等電點，發(fā)酵生產中，可根據這種性質，從發(fā)酵液中提取并純化各種氨基酸。（2）等電點的計算側鏈不解離的氨基酸pI=0.5(pKa1+pKa2) 酸性氨基酸pI=0.5(pKa1+pKa2)堿性氨基酸pI=0.5(pKa2+pKa3)2、氨基酸的化學反應（1）-氨基參加的反應與亞硝酸反應 脫氨形成N2，N2中的N一半來自氨基，此法可用于氨基酸的定量測定。與?；噭┓磻被货；缗c芐氧甲酰氯等反應。此類試劑在

16、多肽和蛋白質的人工合成中被用作氨基的保護劑。烴基化反應 氨基的一個氫可被烴基取代，如2,4-二硝基氟苯（DNFB,FDNB）在弱堿性溶液中形成二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），此反應被Sanger用于鑒定蛋白質的N末端氨基酸。再如與苯異硫氰酸酯（PITC）在弱堿性條件下形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，此衍生物在硝基甲烷中與酸反應生成苯乙內酰硫脲（RTH）衍生物。這個反應被Edman用于鑒定蛋白質N端氨基酸。在多肽和蛋白質序列測定放面占重要地位。形成西佛堿反應與醛反應生成西佛堿。脫氨基反應氨基酸在體內經氨基酸氧化酶等催化脫去-氨基，形成酮酸（見下冊）。（2）-羧基參加的反應成鹽和成脂反應與堿

17、成鹽與醇成脂，具有保護羧基作用，同時使氨基活化，易與?；蛄u基反應，這就是為什么氨基酸的?；土u基化需要在堿性溶液中進行的原因。成酰氯反應與二氯亞砜或五氯化磷反應生成酰氯?？墒拱被岬聂然罨?，在多肽人工合成中常用。脫羧基反應經氨基酸脫羧酶作用放出二氧化碳并生成一級氨。疊氮反應氨基酸的氨基通過?；右员Ｗo，羧基經酯化轉變?yōu)榧柞?，然后與肼和亞硝酸反應即變?yōu)榀B氮化合物。此反應使氨基酸的羧基活化，常用于肽的人工合成。（3）-氨基和-羧基共同參與的反應與茚三酮反應茚三酮在弱酸性溶液中與-氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氨、脫羧反應，最后茚三酮與反應產物氨和還原茚三酮發(fā)生作用，生成紫色物質。顏色的深淺與

18、氨基酸的濃度成正比，利用此反應可以定性或定量氨基酸。利用茚三酮顯色可以定性鑒定并用分光光度法在570nm定量測定各種氨基酸。脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應不釋放NH3,而直接生成亮黃色化合物，最大光吸收在440nm。成肽反應一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基可以縮合成肽，形成的鍵稱肽鍵。羰氨反應氨基酸的氨基與糖類的羰基易發(fā)生反應，生成羰氨化合物，進而縮合成更復雜的棕色到黑色化合物“類黑色素”。食品加工中將這種反應稱為褐變。原料褐變后不僅影響原料的利用率，還有很多毒副作用。（4）側鏈R基參加的反應很多基團參與反應，其中一些是蛋白質化學修飾的基礎，所謂蛋白質的化學修飾就是在較溫和的條件下，以可控的

19、方式使蛋白質與某種試劑（稱化學修飾劑）起特異反應，以引起蛋白質中個別氨基酸側鏈或功能團發(fā)生共價化學改變?；瘜W修飾在蛋白質的結構與功能的研究中是很有用的。酪氨酸的酚基在3和5位易發(fā)生親電取代反應，還可以與重氮化合物結合生成橘黃色的化合物。組氨酸的咪唑（zuo）基與重氮苯磺酸反應形成棕紅色化合物。精氨酸的胍基在硼酸鈉緩沖液中與1,2-環(huán)己二酮反應生成縮合物，此縮合物在羥胺緩沖液中可重新生成精氨酸。色氨酸的側鏈吲哚基在溫和的條件下可被N-溴代琥珀酰亞胺氧化，此反應可用于分光光度法測定蛋白質中色氨酸的含量。蛋氨酸側鏈上的甲硫基是一個很強的親核基團，可與烴化試劑如甲基碘反應形成锍鹽。半胱氨酸的巰基反應性

20、能很高，在微堿性環(huán)境中-SH可解離為硫醇陰離子，能與鹵化烷如碘乙酸、甲基碘等反應生成穩(wěn)定的烷基衍生物。半胱氨酸的巰基能打開乙撐亞胺（氮丙啶）的環(huán)，生成的側鏈帶有-NH3，它為胰蛋白酶水解肽鏈提供了一個新的位點。巰基還能和各種金屬離子形成絡合物。由于許多蛋白質（酶）的活性中心有-SH，當遇到重金屬離子而生成硫醇鹽時將導致酶的失活。半胱氨酸可與二硫硝基苯甲酸（DTNB）或稱Ellman試劑發(fā)生硫醇-二硫化物交換反應，1分子半胱氨酸引起1分子硫硝基苯甲酸的釋放，它在pH8.0時，在412nm波長處有強烈的光吸收，因此可以利用分光光度計定量測定-SH的含量。巰基易被氧化形成-S-S-，二硫鍵在穩(wěn)定蛋白

21、質的構象上起重要作用。（四）氨基酸的光譜性質組成蛋白質的氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在紅外區(qū)和遠紫外區(qū)（中性氨基酸酸性氨基酸。通過改變洗脫液的pH，可以改變氨基酸的帶電情況，從而使氨基酸從離子交換樹脂上洗脫下來。除上述方法之外還有氣相色譜和液相色譜，較先進。四、蛋白質的一級結構（一）一級結構的含義一級結構又叫初級結構指的是肽鏈中的氨基酸的組成和排列順序。一級結構是高級結構的化學基礎，也是認識蛋白質分子生物學功能、結構與生物進化的關系、結構變異與分子病的關系等許多復雜問題的重要基礎。（二）多肽鏈肽鍵一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基所成的酰胺鍵，在蛋白質化學中稱為肽鍵，肽鍵是一個酰胺鍵，由

22、于酰胺鍵氮上的孤對電子與相鄰羰基之間的共振相互作用，表現出高穩(wěn)定性。組成肽鍵的C-N鍵，具有40雙鍵的性質，不能自由旋轉。肽鍵中的四個原子和它們相鄰的2個-碳原子都處于同一平面上，此剛性結構的平面稱為肽平面或肽酰平面，其中H和O處于C-N鍵的兩側形成反式。很多氨基酸依次通過肽鍵連接而形成的鏈狀結構稱為多肽鏈。由2個氨基酸組成的肽稱為二肽，三肽以上根據含氨基酸的多寡稱為寡肽、多肽。蛋白質就是由幾十個到幾百個甚至上千個氨基酸組成的多肽。肽鏈的骨干是由-NH-HCR-CO-單位規(guī)則的重復排列而成，稱之為共價主鏈。在多肽鏈中兩個氨基酸失去一分子水形成肽鍵，故已經不是原來完整的分子，因此稱為氨基酸殘基。

23、多肽鏈通常含有一個游離的末端氨基和一個游離的末端羧基，稱為氨基末端（N末端）和羧基末端（C末端）。書寫多肽鏈時，一般是將N末端寫在左邊，C末端寫在右邊。多肽的命名是根據參與其組成的氨基酸殘基來確定，規(guī)定從肽鏈的N末端殘基開始，稱為某氨基酰某氨基酰某氨基酸。多肽鏈的共價結構除了肽鍵外，還有二硫鍵，即肽鏈上的兩個半胱氨酸殘基的巰基脫氫形成，又稱“硫橋”，二硫鍵對蛋白質的空間結構非常重要。（三）一級結構分析1、一般程序 多肽鏈的氨基酸測序主要是根據英國F.Sanger實驗室中發(fā)展起來的方法進行測定的，這個方法首先應用于胰島素的氨基酸序列的測定，Sanger因此獲得1958年諾貝爾獎?，F在常用的氨基酸

24、序列分析儀是根據Edman反應原理發(fā)展起來的。只簡要的介紹蛋白質序列測定的一般步驟。（1）測定蛋白質分子中多肽鏈的數目，根據N末端和C末端的數量。（2）拆分蛋白質分子的多肽鏈（3）斷開多肽鏈內的二硫鍵，一般用甲酸氧化或巰基化合物還原。（4）分析每一多肽鏈的氨基酸組成，一部分樣品完全水解，測定氨基酸組成，并計算氨基酸成分的分子比。（5）鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基，建立兩個氨基酸序列的參考點。（6）斷裂多肽鏈為較小的片段（7）測定各肽段的氨基酸序列，目前常用Edman降解法。（8）根據上述個肽段的氨基酸序列測定結果，利用兩套或幾套肽段的序列彼此間的交錯重疊，可拼湊出整條多肽鏈的氨基酸序列。

25、（9）確定二硫鍵的位置。2、N末端和C末端氨基酸殘基的測定（1）N末端的分析方法二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法多肽或蛋白質的游離末端NH2與DNFB反應后，生成DNP-多肽或蛋白質。由于DNFB與氨基形成的鍵對酸水解的穩(wěn)定性比肽鍵高，因此DNP-多肽經水解后，只有N末端氨基酸為黃色DNP-氨基酸衍生物，其余的都是游離氨基酸。只要鑒別生成的DNP-氨基酸便可知多肽鏈的N末端殘基。丹磺酰氯法丹磺酰氯是二甲氨基苯磺酰氯的簡稱，所寫DNS。原理與DNFB法相同，由于丹磺酰氯具有強烈的熒光，靈敏度比DNFB法高100倍。苯異硫氰酸酯（PITC）法 多肽或蛋白質的末端氨基能與PITC作用，生成苯氨基硫

26、甲酰蛋白質或多肽，簡稱PTC-多肽或蛋白質，在酸性有機溶劑中加熱時，N-末端的PTC-氨基酸發(fā)生環(huán)化，生成苯乙內酰硫脲的衍生物并從肽鏈上掉下來，除去N末端的氨基酸后剩下的肽鏈仍然是完整的，PTC基的引入只使第一個肽鍵的穩(wěn)定性降低。代表末端氨基酸的是溶液中的PTH-氨基酸，分析PTH-氨基酸即可知末端氨基酸。氨肽酶法 氨肽酶能從多肽鏈的N末端逐個的向里切，根據不同的反應時間測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數量，按反應時間和殘基釋放量作動力學曲線，就能知道蛋白質的N末端氨基順序。（2）C末端的分析方法肼解法目前測定C末端的最重要的化學方法。蛋白質或多肽與無水肼加熱發(fā)生肼解，反應中除C末端氨基酸以游離

27、形式存在外，其它的氨基酸都轉變?yōu)橄鄳陌被狨ｋ禄?。生成的氨基酸酰肼化物可與苯甲醛作用變?yōu)樗蝗苄缘亩交苌锍恋怼Ｉ锨逡褐械挠坞xC末端氨基酸借助DNFB法或DNS法及層析技術進行鑒定。肼解過程中谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破環(huán)不易測出，C末端的精氨酸轉變?yōu)轼B氨酸。還原法 肽鏈的C末端氨基酸可與硼氫化鋰反應生成相應的-氨基醇。肽鏈完全水解后，-氨基醇可用層析法進行鑒定。羧肽酶法最有效的方法，最常用的方法。羧肽酶能從多肽鏈的C末端逐個的向里切，根據不同的反應時間測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數量，按反應時間和殘基釋放量作動力學曲線，就能知道蛋白質的C末端氨基順序。3、二硫鍵的斷裂和多肽鏈

28、的分離有的蛋白質由多條肽鏈，由兩種情況，一種是幾條肽鏈之間借助非共價鍵連接起來，另一種是幾條多肽鏈通過共價二硫鍵交連在一起。第一種可用變性劑如8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，就可將亞基拆開。第二種需打開二硫鍵，最普通的方法是用過量的-巰基乙醇處理可使-S-S-還原為-SH，與此同時反應系統(tǒng)需要有8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍使蛋白質變性，多肽鏈松散，才能使還原劑還原內部的二硫鍵。4、氨基酸組成的測定 用于蛋白質的氨基酸組成測定的水解方法主要是酸水解，同時輔以堿水解。5、多肽鏈的部分斷裂和肽段的分離目前的蛋白質序列測定方法一次能測定的序列都不長，最常用的Edman化學降解法一次只

29、能連續(xù)降解幾十個殘基。故必須把大的肽段斷裂成小的肽段。裂解時要求斷裂點少，專一性強，反應產率高。（1）酶裂解法最常見的蛋白水解酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶。這些酶都是肽鏈內切酶。胰蛋白酶，最常用的蛋白酶，專一性強，只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基形成的肽鍵。糜蛋白酶，專一性差常用于斷裂較短的多肽鏈或大肽段。胃蛋白酶，斷裂鍵兩側的殘基都是疏水性氨基酸的肽鍵。金黃色葡萄球菌蛋白酶，也稱Glu蛋白酶，在pH7.8的磷酸緩沖液中，它能斷裂谷氨酸殘基和天冬氨酸殘基羧基形成的肽鍵。在pH7.8的碳酸氫銨緩沖液或pH4.0的醋酸銨緩沖液中，只能斷裂谷氨酸殘基羧基側的肽鍵。羧狀芽孢

30、桿菌蛋白酶，也稱Arg蛋白酶專門斷裂精氨酸羧基形成的肽鍵。（2）化學裂解法溴化氰斷裂，只斷裂甲硫氨酸殘基的羧基形成的肽鍵。羥胺斷裂，NH2OH能專一的斷裂-Asn-Gly-之間的肽鍵，但專一性不很強，Asn-Leu及Asn-Ala之間的肽鍵也能斷裂。 斷裂后的肽段可用凝膠過濾、電泳，層析等方法分離提純。6、肽段的氨基酸序列測定多肽鏈經降解和分離后得到的大小合適、純度合格的肽段，即可進行氨基酸順序的測定。主要的測定方法是Edman化學降解法，此外還有酶法、氣譜質譜聯(lián)用法等。7、肽段在多肽鏈中此序的決定多肽如果指斷裂2或3段，則根據N末端氨基酸或C末端氨基酸即可推知其序列，但大多數斷裂不止3段，這

31、就需要2種以上的方法斷裂樣品，形成2套或幾套肽段，不同的方法指的是斷裂的專一性不同，即切口彼此錯位的方法。故2套肽段正好相互跨過切口而重疊，這種跨過切口而重疊的肽段稱為重疊肽，借助重疊肽可以確定肽段在原多肽鏈中的正確位置，拼湊出整個多肽鏈的氨基酸順序。如：肽段1：OUS、PS、EOVE、RLA、HOWT 肽段2：SEO、WTOU、VERL、APS、HO全序列：HOWT、OUS、EOVE、RLA、PS8、二硫鍵位置的確定用胃蛋白酶水解，胃蛋白酶專一性差，切點多，肽段較小易于分離鑒定，而且其最適pH為2.0左右，在此條件下二硫鍵不易破壞。然后用對角線電泳找出含二硫鍵的肽段，測定其序列以推斷二硫鍵的

32、位置。（四）一級結構舉例第一個被闡明一級結構的蛋白質是牛胰島素。也是第一個被人工合成的蛋白質。牛胰島素分子：51個殘基分A、B兩條鏈；A鏈有21個殘基，B鏈有30個殘基；A鏈有一鏈內二硫鍵，另有兩個鏈間二硫鍵。（五）一級結構與功能的關系蛋白質的一級結構決定了它的高級結構，進而也就決定了蛋白質的生理功能。進行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質氨基酸序列相似性分析、氨基酸殘基的化學修飾及切割實驗等方法。同源蛋白質：在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質稱為同源蛋白質。同源蛋白質的氨基酸序列具有明顯的相似性，這種相似性稱為序列同源性。不變殘基和可變殘基。（六）體內活性肽生物體內有很多游離存在的小

33、分子活性肽，各具有一定的生物功能。有些活性肽屬于激素類。如催產素、加壓素、舒緩素等都是9肽。有些微生物產生的活性肽是抗生素類物質，如短桿菌肽S、多粘菌素E、放線菌素D等。鬼筆鵝膏產生的a-鵝膏蕈堿是一種環(huán)狀8肽，能與真核細胞的RNA結合，抑制RNA的合成。動物、植物和微生物中都含有的一種還原型三肽：-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，稱為谷胱甘肽（GSH）。在細胞中是某些蛋白質和巰基酶的緩沖劑。五、蛋白質的三維結構（一）構型與構象構型：是由于化合物分子中某一不對稱碳原子上四種不同的取代基團（或原子）的空間排列所形成的一種光學活性立體結構。一個不對稱碳原子只能形成兩種不同的構型，分子從一種構型變成另一種構型

34、，必須發(fā)生共價鍵的斷裂。構象：構象是分子內所有原子或原子團的空間排布所形成的一種立體結構。天然蛋白質分子都有與其生物活性相關的一種或少數幾種特定的構象，這種天然構象相當穩(wěn)定。（二）穩(wěn)定蛋白質三維結構的化學鍵 穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力重要是一些所謂弱的相互作用或稱非共價鍵或次級鍵。包括氫鍵、范德華力 、疏水相互作用或鹽堿（離子鍵）。1氫鍵氫鍵是一種靜電吸引，當一個電負性較大的原子x與一個氫原子結合形成基團時，具有很大的偶極矩，成鍵電子云偏向x，氫原子核的外側裸露，顯正電性。當其遇到另一個電負性較大，半徑較小，帶有孤對電子的y原子是，便產生靜電吸引。這種靜電吸引即所謂的氫鍵。 xHy。氫鍵在穩(wěn)定

35、蛋白質的結構中起著極其重要的作用。2范德華力廣義的范德華力包括3種較弱的作用力，即定向效應、誘導效應和分散效應。定向效應發(fā)生在極性分子或極性基團之間，即永久偶極間的靜電相互作用。誘導效應發(fā)生在極性物質與非極性物質之間，即永久偶極與它誘導出來的誘導偶極之間的作用。分散效應是在多數情況下起主要作用的范德華力，是非極性基團或分子之間的作用力即瞬間偶極間的作用力，即狹義的范德華力，也稱London分散力，通常的范德華力就是指這種作用力。范德華力只有當兩個非鍵合原子處于一定距離時才能達到最大，這個距離稱為接觸距離或范德華距離，它等于兩個原子的范德華半徑之和。力雖小但數量大。3疏水相互作用 兩個非極性基團

36、（疏水基團）為了避開水相而互相聚集的作用稱為疏水相互作用。蛋白質分子中的疏水相互作用力主要是由疏水氨基酸的R基團間形成的。是維系蛋白質高級結構的主要作用力。4離子鍵又叫鹽鍵，是由于正負離子間的靜電吸引所形成的化學鍵，與環(huán)境的pH值有關。5配位鍵在兩個原子之間，由于單方面提供共用電子對所形成的共價鍵，即所謂配位鍵。金屬離子與蛋白質間的連接往往是配位鍵。6二硫鍵兩個半胱氨酸巰基氧化脫氫所形成的-S-S-橋稱為二硫鍵。它不規(guī)定多肽鏈的折疊，但對蛋白質的三維結構其穩(wěn)定作用。（三）蛋白質分子的二級結構1二級結構的涵義蛋白質二級結構是指蛋白質主鏈折疊產生的由氫鍵維系的有規(guī)則的構象。二級結構僅僅是主鏈構象，

37、不討論側鏈基團的空間排布。這些主鏈基本構象都是以酰胺平面為基本結構單位。2酰胺平面與二面角肽鍵具有部分雙鍵的性質，不能自由轉動。因此，每個肽單位的六個原子都被酰胺鍵固定在同一個平面上，這一平面稱為酰胺平面，也叫肽平面。它是一個剛性平面，六個原子的相對位置都是固定不變的。3二級結構的基本構象（1）-螺旋-螺旋是蛋白質分子中最常見、最典型、含量最豐富的很穩(wěn)定的二級結構元件。-螺旋的結構特點主鏈環(huán)繞中心軸按右手螺旋方向盤旋，每3.6個殘基前進一圈，每圈前進距離為0.54nm，每個殘基占0.15nm；每個殘基的亞氨基（NH）與它前面第四個殘基的羰基（C=O）氧原子形成氫鍵，氫鍵與螺旋軸近乎平行，大量鏈

38、內氫鍵維系-螺旋的穩(wěn)定；-螺旋的結構常用SN表示，S代表每圈螺旋的殘基個數，N表示氫鍵封閉環(huán)本身的原子數。3.613。影響-螺旋形成的因素一條多肽鏈能否形成-螺旋，以及形成的螺旋是否穩(wěn)定與他的氨基酸組成和序列有極大地關系。R基團小且不帶電荷的多聚丙氨酸在pH7的水溶液中能自發(fā)的形成螺旋。而帶電的多聚賴氨酸則不能形成-螺旋。除R基外，R基的大小對多肽鏈形成-螺旋也有影響。多聚異亮氨酸在-碳原子附近有較大R基團，造成空間阻礙，因而不能形成-螺旋，多聚脯氨酸的-碳原子參與形成R基吡咯的形成不能形成環(huán)內氫鍵，因此多肽鏈中只要存在脯氨酸（或羥脯氨酸），-螺旋即被中斷，產生一個“結”。（2）-折疊又叫-折

39、疊片或-片層結構，也是蛋白質分子中常見的主鏈構象之一。所謂-折疊是兩條或兩條以上充分伸展成鋸齒狀折疊構象的肽鏈，側向聚集，按肽鏈的長軸方向；平行并列，形成的折扇狀結構。-折疊可分為平行式和反平行式兩種。-折疊構象靠相鄰肽鏈主鏈亞氨基（NH）和羰基（C=O）氧原子之間形成有規(guī)律的氫鍵聯(lián)結維系的。-折疊片每條肽鏈稱為-折疊股或股。反平行折疊片中重復周期（肽鏈同側兩個相鄰的同一基團之間的距離）為0.7nm，而平行折疊片中為0.65nm。平行-折疊片比反平行-折疊片更規(guī)則。平行-折疊片一般是大結構，少于5個股的很少見。反平行折疊片可以少到2個-折疊股。平行-折疊片中疏水側鏈分布在折疊片平面的兩側，而反

40、平行-折疊片通常所有的疏水側鏈都排列在折疊片的一側。（3）-轉角和-凸起又稱-彎曲或發(fā)夾結構，在球狀蛋白質中發(fā)現的一種主鏈構象。自然界的蛋白質大多是球蛋白，因此多肽鏈必須具有彎曲回折。-轉角是由4個連續(xù)的殘基組成的，第一個殘基的羰基與第四個殘基的亞氨基間形成氫鍵連結，穩(wěn)定構象。此結構允許肽鏈作180旋轉。由于甘氨酸側鏈只有一個H，在-轉角中能很好的調整其他殘基的空間阻礙，因此是立體化學上最合適的氨基酸，而脯氨酸具有環(huán)狀結構和固定的角，因此在一定程度上迫使-轉角形成，促進多肽鏈自身回折。目前發(fā)現的-轉角多處于蛋白質分子的表面。-凸起是一種小片的非重復性結構，能單獨存在，大多數經常作為反平行-折疊

41、片中的一種不規(guī)則情況而存在。-凸起可認為是-折疊股中額外插入的一個殘基，它使得在兩個正常氫鍵之間、在凸起折疊股上是兩個殘基，而另一側的正常股上的一個殘基。-凸起可引起多肽鏈方向的改變，但改變的程度不如-轉角。（4）無規(guī)卷曲或稱卷曲，它泛指那些不能歸入明確的二級結構的多肽區(qū)段。無規(guī)卷曲并非完全沒有規(guī)則，它也像其他二級結構那樣有明確而穩(wěn)定的結構，但是它們受側鏈相互作用的影響很大。這類有序的非重復性結構經常構成酶活性部位和其它蛋白質特異的功能部位。是多肽鏈不規(guī)則，多向性地隨機盤曲所形成的構象。也是球狀蛋白質中常見的主鏈構象。球狀蛋白質分子的二級結構還不是活性分子的結構形式。在二級結構的基礎上在盤曲折

42、疊形成三級結構，有些蛋白質還要由三級結構單位再進一步締合成四級結構，才能成為具有完整生物功能的活性分子。4、纖維狀蛋白質（四）超二級結構和結構域蛋白質分子的折疊層次分為一、二、三、四級結構，但如果細分還可以在二級結構和三級結構之間增加兩個層次：超二級結構和結構域。1、超二級結構在蛋白質分子中特別是在球狀蛋白分子中經?？梢钥吹接扇舾上噜彽亩壗Y構元件（主要是-螺旋和-折疊片）組合在一起，彼此相互作用，形成種類不多的有規(guī)則的二級結構組合或二級結構串，在多種蛋白質中充當三級結構的構件，稱為超二級結構。標準折疊單位或折疊花式?，F在已知的超二級結構有三種基本的組合形式：、和。（1）由兩股平行或反平行排列

43、的右手螺旋互相纏繞而成的左手卷曲螺旋或稱超螺旋。還發(fā)現三股和四股螺旋。卷曲螺旋是纖維狀蛋白質和原肌球蛋白的主要結構元件。由于超卷曲，每圈螺旋不是3.6個氨基酸殘基，而是3.5個，重復距離不是0.54nm，而是0.51nm。超螺距約14nm，直徑2nm。兩股螺旋的軸相距1nm，氨基酸的序列分析表明，這些多肽鏈中存在7個殘基的重復序列。其中第1、4個是疏水殘基，第5、7個是極性殘基，第2、3、6個一般是荷電殘基。在超螺旋中一股螺旋鏈的非極性邊緣與另一鏈的非極性邊緣結合形成疏水核心，荷電殘基組成的極性邊緣位于超螺旋外側，與溶劑水相互作用，起到穩(wěn)定超螺旋結構。（2）兩股平行折疊股和一段作為連接鏈的螺旋

44、組成，股之間還有氫鍵相連。最常見的組合是由3股平行股和2股螺旋構成。（3）由一條多肽鏈的若干段折疊股反平行組和而成，兩個股間通過一個短回環(huán)連接起來。最簡單的折疊花式是發(fā)夾結構，由幾個發(fā)夾可以形成更大更復雜的折疊片圖案，如曲折和希臘鑰匙拓撲結構。曲折是一種常見的超二級結構，由氨基酸序列上連續(xù)的多個反平行折疊股通過緊湊的轉角連接而成，穩(wěn)定性高，說明其廣泛存在。希臘鑰匙拓撲結構也是反平行折疊片中常見的一種。此結構有兩種回旋方式，但實際上只存在一種，從NC末端回旋幾乎總是逆時針的。2結構域（1）定義多肽鏈在二級結構或超二級結構的基礎上形成三級結構的局部折疊區(qū)，它是相對獨立的緊密球狀實體，稱為結構域。結

45、構域是球狀蛋白質的獨立折疊單位。對于那些較小的蛋白質分子或亞基來說，結構域和三級結構是一個意思，也就是說這些蛋白質或亞基是單結構域的，如紅氧還蛋白、肌紅蛋白等；對于較大的球狀蛋白質或亞基，其三級結構往往由兩個或多個結構域締合而成，也即它們是多結構域的，如免疫球蛋白的每條輕鏈含有兩個結構域。結構域有時也指功能域，功能域是蛋白質分子中能獨立存在的功能單位。功能域可以是一個結構域，也可以是由2個結構域或2個以上結構域組成，例如幾糖激酶的功能域是由兩個結構域構成，并處于它們之間的交界處。從結構的角度看，一條長的多肽鏈先分別折疊成幾個相對獨立的區(qū)域，再締合成三級結構要比整條多肽鏈直接折疊成三級結構在動力

46、學上是更為合理的途徑。從功能上看許多結構域的酶，其活性中心都位于結構域之間，因為通過結構域容易構建具有特定三維排布的活性中心。由于結構域之間常常只有一段柔性鉸鏈連接，形成所謂鉸鏈區(qū)，使結構域容易發(fā)生相對運動，這是結構域的一大特點。然而這種柔性的鉸鏈不可能在亞基之間存在，因為它們之間沒有共價連接，如果作較大的運動亞基將完全分開。結構域之間的這種柔性將有利于活性中心結合底物和施加應力，有利于別構中心結合調節(jié)物和發(fā)生別構效應。（2）結構域類型結構域大體可分為四類，反平行-螺旋結構域（全-結構）、平行或混合型-折疊片結構域（，-結構域）、反平行折疊片結構域（全-結構）和富含金屬或二硫鍵結構域（不規(guī)則小

47、蛋白結構）。（五）球狀蛋白質與蛋白質的三級結構 球狀蛋白質具有三級結構，球狀蛋白質種類很多，功能也很多。 1、三級結構的涵義 一個蛋白質的三級結構是指由二級結構元件構建成的總三維結構，包括一級結構中相距遠的肽段之間的幾何相互關系和側鏈在三維空間中彼此間的相互關系。2、球狀蛋白質的分類球狀蛋白根據它們的結構域類型可分為四類：全-結構、，-結構、全-結構以及小的富含金屬或二硫鍵結構。（1）全-結構（反平行螺旋）蛋白質（2），-結構（平行或混合型-折疊片）蛋白質（3）全-結構（反平行折疊片）蛋白質（4）富含金屬或二硫鍵（小的不規(guī)則）蛋白質3、球狀蛋白質三維結構的特征（1）球狀蛋白質分子含多種二級結構

48、元件。但不同球狀蛋白質中各種元件的含量不同。（2）球狀蛋白質三維結構具有明顯的折疊層次。 在一級序列上相鄰的二級結構往往在三維折疊中彼此靠近并相互作用形成超二級結構。由超二級結構進一步裝配成相對獨立的球狀實體結構域或三級結構，或再由兩個或多個結構域裝配成緊密的球狀或橢球狀的三級結構。如果是亞基的三級結構，將由三級結構的亞基締合成四級結構的多聚體。（3）球狀蛋白質分子是緊密的球狀或橢球狀實體。 多肽鏈折疊過程中各種二級結構彼此緊密裝配，它們之間也插入松散的肽段。整個蛋白質的大約75被氨基酸占據，大約有25以空腔形式存在，鄰近活性部位的區(qū)域密度比平均值低得多，這可能意味著這較松散的區(qū)域有較大的空間

49、可塑性，使構象容易發(fā)生變化，可允許活性部位的結合基團和催化基團有較大的活動范圍。（4）球狀蛋白質疏水側鏈埋藏在分子內部，親水側鏈暴漏在分子表面。蛋白質折疊的作用力有2種，一是肽鏈必須滿足自身結構故有的限制，包括折疊中-碳的二面角的限制以及手性效應；二是肽鏈必須折疊以便埋藏疏水側鏈，使之與溶劑水的接觸降到最小程度。（5）球狀蛋白質分子的表面有一個空穴 這種空穴是結合底物、效應物等配體并行使生物功能的活性部位?？昭ù笮∧苋菁{12個小分子配體或大分子配體的一部分?？昭ㄖ車植贾S多疏水側鏈，為底物等發(fā)生化學反應營造了一個疏水環(huán)境。（六）球狀蛋白質分子的四級結構 自然界中很多蛋白質是以獨自折疊的球狀蛋

50、白質的聚集體形式存在的，這些球狀蛋白質通過非共價鍵彼此締合在一起，多個球狀蛋白質締合形成聚集體的方式構成蛋白質的四級結構。四級結構的蛋白質中每個球狀蛋白質稱為亞基，亞基一般是一條多肽鏈。亞基有時也稱為單體，由2個亞基組成的稱為二聚體，4個稱四聚體。由2個或2個以上亞基組成的蛋白質統(tǒng)稱為寡聚蛋白質，多聚蛋白質或多亞基蛋白質。僅由一個亞基組成無四級結構的蛋白質稱為單體蛋白質。多聚蛋白質可以是由單一類型的亞基組成，稱為同多聚蛋白質；由幾種不同類型的亞基組成的稱為雜多聚蛋白質。對稱的寡聚蛋白質分子可以看成是由兩個或多個不對稱的相同結構成分組成，這種相同結構成分稱為原聚體或原體。如血紅蛋白（22）兩個原

51、體。六、蛋白質性質（一）蛋白質的大小和分子量蛋白質的分子量很大，其變化范圍在6000-1百萬或更大。因分子量巨大故不能透過半透膜。可以用來分離蛋白質和無機小分子。測定蛋白質分子量的方法很多，最常用的是凝膠過濾法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法。對于那些不含輔基的簡單蛋白質，用110除它的分子量可以粗略的估計其氨基酸殘基的數目。蛋白質的20種氨基酸的平均分子量是138，但在大多數蛋白質中較小的氨基酸占優(yōu)勢，因此平均分子量接近128。因形成一個肽鍵脫掉一個水分子，故氨基酸殘基的平均分子量是110。（二）蛋白質的紫外吸收大部分蛋白質均含有芳香族氨基酸殘基（Trp、Tyr、Phe），所以在280nm處有最大的吸

52、收。利用這一性質，可以用紫外分光光度計測定溶液中蛋白質的濃度。所有的蛋白對小于230nm波長的光波都有強烈的吸收。這是肽鍵的屬性。（三）蛋白質的旋光性蛋白質的旋光性是由構成其結構的各種氨基酸旋光度和蛋白質分子中的-螺旋結構所決定的。通常蛋白質溶液是右旋的，但變性后螺旋結構松開，其左旋性增大。利用這一性質，可以推算出蛋白質分子中-螺旋結構的含量。（四）蛋白質的兩性解離和等電點1、兩性解離蛋白質分子中有很多酸性解離基團和堿性解離基團，是具有兩性解離性質的化合物。各種解離基團的解離度與溶液的pH有關，pH越低，堿性解離度越大，蛋白質分子帶正電荷越多，負電荷越少；pH升高，則解離情況相反。2、等電點調節(jié)溶液的pH可以改變