設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物的方法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物的方法一、 為什么要設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物區(qū)別或消除gDNA的擴(kuò)增二、 如何設(shè)計(jì)1、 在pubmed上找到目標(biāo)基因的DNA序列以及其內(nèi)含子和外顯子情況步驟：打開NCBI主頁(yè)面，選GENE，輸入基因名稱，找到符合要求的基因，links到geneback即可顯示出該基因DNA的信息,這是基因組DNA,從mRNA選項(xiàng)中JION后面的是外顯子的位置，為了以后的操作，可以把這個(gè)DNA序列、外顯子和CDS序列的起至位置記下來(lái)。2、 在pubmed上找到目標(biāo)基因的mRNA序列步驟：打開NCBI主頁(yè)面，選GENE，輸入基因名稱，找到符合要求的基因，點(diǎn)擊進(jìn)入基因頁(yè)面，即可顯

2、示出這個(gè)基因的mRNA信息，最后的ORIGIN是CDNA序列，把它記下來(lái)。注：最好能找到以NM或XM開頭的序列，以此做為設(shè)計(jì)引物的模板。 NCBI RefSeq (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心參考序列庫(kù)) 是目前世界上最完整和最具有權(quán)威性的人類基因組編碼mRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)。它已收集了大約17,500個(gè)經(jīng)cDNA測(cè)序證實(shí)的"NM"序列，還有大約10,000個(gè)主要由計(jì)算機(jī)推測(cè)產(chǎn)生的"XM"序列。由于一些序列來(lái)自異常連接產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物或由計(jì)算機(jī)推演產(chǎn)生的不正確內(nèi)含子-外顯子剪切，因此該數(shù)據(jù)庫(kù)所收集的參考序列一直在不斷地被修改中，盡管如此，NCBI RefSeq仍是目

3、前最可信賴的人類基因mRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)。3、 如何設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物（利用primer 5）步驟：1）、在第2步頁(yè)面右邊，點(diǎn)擊 real time PCR 一般產(chǎn)物長(zhǎng)度為80150bp，引物長(zhǎng)度1520bp，點(diǎn)擊GET primer。2）、會(huì)得到若干條引物，從圖中信息即可看出跨內(nèi)含子的引物，建議只用BLST找到跨內(nèi)含子的引物在CDNA的定位，然后，用primer 5繼續(xù)設(shè)計(jì)引物。此時(shí)，需記下跨內(nèi)含子引物所在2個(gè)外顯子的位置（確認(rèn)是否在CDS序列內(nèi)）。3）、打開Primer Premier5，點(diǎn)擊File-New-DNA sequence, 出現(xiàn)輸入序列窗口，Copy步驟1的CDNA序列在輸入框

4、內(nèi)（選擇As），此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點(diǎn)擊Primer，進(jìn)入引物窗口。4）、此窗口可以鏈接到“引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結(jié)果”選項(xiàng)，點(diǎn)擊Search按鈕，進(jìn)入引物搜索框，選擇“PCR primers”“Pairs”，設(shè)定搜索區(qū)域、引物長(zhǎng)度和產(chǎn)物長(zhǎng)度。搜索區(qū)域即為上一步記下的兩外顯子序列位置，QPCR引物長(zhǎng)度大約為1520bp,產(chǎn)物長(zhǎng)度為80150bp.在Search Parameters里面，可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無(wú)特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可。5）、點(diǎn)擊OK，軟件即開始自動(dòng)搜索引物，搜索完成后，會(huì)自動(dòng)跳出結(jié)果窗口，搜索結(jié)果默認(rèn)按照評(píng)分（Rating）排序，點(diǎn)擊其中任一個(gè)

5、搜索結(jié)果，可以在“引物窗口”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息等。6）、對(duì)于引物的序列，可以簡(jiǎn)單查看一下， Tm應(yīng)該在5570度之間，GC應(yīng)該在4555間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯(cuò)誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級(jí)結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊該紅色按鈕，即可看到相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)位置圖示。最理想的引物，應(yīng)該都不存在這些二級(jí)結(jié)構(gòu)，即這幾個(gè)按鈕都顯示為“None”為好。但有時(shí)很難找到各個(gè)條件都滿足的引物，所以要求可以適當(dāng)放寬，比如引物存在錯(cuò)配的話

6、，可以就具體情況考察該錯(cuò)配的效率如何，是否會(huì)明顯影響產(chǎn)物。對(duì)于引物具體詳細(xì)的評(píng)價(jià)需要借助于Oligo來(lái)完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺不如Primer5.7）、在Primer5窗口中，若覺得某一對(duì)引物合適，可以在搜索結(jié)果窗口中，點(diǎn)擊該引物，然后在菜單欄，選擇File-Print-Current pair，使用PDF虛擬打印機(jī)，即可轉(zhuǎn)換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細(xì)信息。4、用PRIMER 5查找已知引物的在DNA序列內(nèi)的產(chǎn)物位置，確定其是否跨內(nèi)含子步驟：打開PRIMER 5，將DNA序列貼入，點(diǎn)擊primer，顯示primer primer界面，點(diǎn)擊左上方的

7、“S”，再點(diǎn)擊EDIT primer，顯示EDIT primer界面，在“5-3”框中貼入上一步確定的Forward primer，點(diǎn)擊as is，顯示序列已被貼入，點(diǎn)擊analyze，再點(diǎn)擊primer，顯示輸入的序列和已知DNA良好配對(duì)，點(diǎn)擊OK。顯示“primer primer界面”， 點(diǎn)擊左上方的“A”，再點(diǎn)擊EDIT primer，顯示EDIT primer界面，在“3-5”框中貼入已知的REVERSE primer，點(diǎn)擊REVERSE，顯示序列已被貼入，點(diǎn)擊analyze，再點(diǎn)擊primer-，顯示輸入的序列和已知DNA良好配對(duì)，點(diǎn)擊OK，顯示“primer primer界面”，在

8、右上角顯示PCR產(chǎn)物的起始和結(jié)束位點(diǎn)。對(duì)照步驟1記錄的CDS起始位點(diǎn)，即可驗(yàn)證。5、用Oligo驗(yàn)證評(píng)估引物1）、在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，該序列已經(jīng)被保存為Seq文件），會(huì)跳出來(lái)兩個(gè)窗口，分別為Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，點(diǎn)擊最左下角的按鈕，會(huì)出來(lái)引物定位對(duì)話框，輸入候選的上游引物序列位置（Primer5已經(jīng)給出）即可，而引物長(zhǎng)度可以通過點(diǎn)擊ChangeCurrent oligo length來(lái)改變。定位后，點(diǎn)擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引

9、物位置，點(diǎn)擊Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分利用Analyze菜單中各種強(qiáng)大的引物分析功能了。2）、Analyze中，第一項(xiàng)為Key info，點(diǎn)擊Selected primers，會(huì)給出兩條引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method計(jì)算，會(huì)比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中還給出引物的Delta G.3端的Delta G過高，會(huì)在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對(duì)值應(yīng)該小一些，最好不要超過9。3）、Analyze中第二項(xiàng)為Duplex Formation，即二聚體形成分析，可以選

10、擇上游引物或下游引物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二聚體情況，還可以選擇Upper/Lower ，即上下游引物之間的二聚體形成情況。引物二聚體是影響PCR反應(yīng)異常的重要因素，因此應(yīng)該避免設(shè)計(jì)的引物存在二聚體，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其Delta G值應(yīng)該偏低，一般不要使其超過4.5kcal/mol，結(jié)合堿基對(duì)不要超過3個(gè)。Oligo此項(xiàng)的分析窗口中分別給出了3端和整個(gè)引物的二聚體圖示和Delta G值。4）、Analyze中第三項(xiàng)為Hairpin Formation，即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析?？梢赃x擇上游或者下游引物，同樣，Delta G值不要超過4.5kcal/mo

11、l，堿基對(duì)不要超過3個(gè)。5）、Analyze中第四項(xiàng)為Composition and Tm，會(huì)給出上游引物、下游引物和產(chǎn)物的各個(gè)堿基的組成比例和Tm值。上下游引物的GC需要控制在4060，而且上下游引物之間的GC 不要相差太大。Tm值共有3個(gè)，分別采用三種方法計(jì)算出來(lái)，包括nearest neighbor method、GC method和2(AT)4(GC)method，最后一種應(yīng)該是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在5070度之間。6）、第五項(xiàng)為False Priming Sites，即錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)，在Primer5中雖然也有False priming分析，但不如oligo詳細(xì)

12、，并且oligo會(huì)給出正確引發(fā)效率和錯(cuò)誤引發(fā)效率，一般的原則要使誤引發(fā)效率在100以下，當(dāng)然有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的話，比如達(dá)到400500，錯(cuò)誤引發(fā)效率超過100幅度若不大的話，也可以接受。7）、其次，Internal stability很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊低的弧形，最起碼保證3端不要過于穩(wěn)定。8）、Analyze中，有參考價(jià)值的最后一項(xiàng)是“PCR”，在此窗口中，是基于此對(duì)引物的PCR反應(yīng)Summary，并且給出了此反應(yīng)的最佳退火溫度，另外，提供了對(duì)于此對(duì)引物的簡(jiǎn)短評(píng)價(jià)。若該引物有不利于PCR反應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在，并且Delta G值偏大的話，Oligo在最后的評(píng)價(jià)中會(huì)注明，若沒有注明此項(xiàng)，表明二級(jí)結(jié)構(gòu)能值較小，基本可以接受。9）、引物評(píng)價(jià)完畢后，可以選擇FilePrint，打印為PDF文件保存，文件中將會(huì)包括所有Oligo軟件中