皮膚敷用的納米乳劑增加生物利用度

1、皮膚敷用的納米乳劑增加生物利用度T. Kotyla a, F. Kuob, V. Moolchandani c, T. Wilson a, R. Nicolosi a,摘要本研究的目的是比較敷用的丁型生育酚的納米乳劑和微米乳劑,因?yàn)檫@涉及到粒子大小和生物利用度。使用七只F1B敘利亞金色的倉(cāng)鼠分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn),相隔1星期。制備兩種乳劑都用到了菜籽油,吐溫80、去離子水和丁型生育酚，唯一的區(qū)別是在制備納米乳劑時(shí)使用了微流化處理器。都是按配方制成膏狀物，敷用在倉(cāng)鼠刮過(guò)皮毛的背部區(qū)域。微米乳劑的粒徑是2788納米而納米乳劑的粒徑是65納米。兩小時(shí)后，敷用納米乳劑的倉(cāng)鼠血漿中生育酚濃度相對(duì)基線明顯增加了36

2、倍，而敷用微米乳劑的倉(cāng)鼠只增加了9倍。在敷用3 h后，分別比較的基線，納米乳劑作用的倉(cāng)鼠血漿生育酚顯著提高了68倍,而敷用微米乳劑的倉(cāng)鼠血漿生育酚只提高了11倍。分別敷用納米乳劑和微米乳劑2和3 h后同樣觀察到顯著的差異。這項(xiàng)研究表明納米乳劑顯著提高丁型生育酚透皮敷用的生物利用度。,1 引言維生素E被假設(shè)可以減少與氧化應(yīng)激效應(yīng)有關(guān)的疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重性，比如實(shí)驗(yàn)性的動(dòng)脈粥樣硬化，癌癥，慢性炎癥和神經(jīng)紊亂等(Brigelius-Flohe et al., 2002)，因?yàn)樗哂锌寡趸芰Α６?大量證據(jù)表明維生素E由于阻止亞硝胺的形成，從而可以減少自發(fā)發(fā)生的DNA氧化損傷及抑制早期階段的致癌作用

3、(Ohshima et al., 1982; Azzi et al., 1995; Moore et al.，1999)。其他研究表明，維生素E類化合物對(duì)腫瘤及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有直接的抵抗作用(Kline et al.,2001)。此外，據(jù)報(bào)道，一些生育酚的同分異構(gòu)體，尤其是-生育酚,有抗炎癥的特性(Grammas et al., 2004; Singh and Jialal, 2004; Singh et al., 2005)，因此，一個(gè)可以增強(qiáng)生物利用度和功效的遞藥系統(tǒng)，比如生育酚對(duì)營(yíng)養(yǎng)制品和藥物制劑的醫(yī)學(xué)應(yīng)用有很大的價(jià)值。脂質(zhì)為基礎(chǔ)的納米劑型是改善藥物溶解度和靶向作用非腸胃用藥的最佳待選材

4、料(Moghimi and Agrawal, 2005)。納米乳劑是一類由表面活性劑和水中的油狀懸浮物組成的穩(wěn)定乳劑，粒徑通常小于100納米(Becher, 1983; Porrasa et al., 2004; Sonneville-Aubrun et al., 2004).。報(bào)道納米乳劑的穩(wěn)定性使它們常常被描述為“接近熱力學(xué)穩(wěn)定性”(Tadros et al., 2004).。這表明乳劑系統(tǒng)可以作為溶解性差的藥物的配方替代品，如藥物如紫杉酚和胺碘酮 (Constantinides et al., 2004)。相對(duì)于典型的微米乳劑，納米乳劑粒徑約100 nm的遞藥系統(tǒng)，能提高多數(shù)化合物的生物

5、利用度和有效性的，如消炎藥的化合物(Kumar et al., 2004),胰島素(Yan et al., 2002),破傷風(fēng)類疫苗(Vila et al., 2005)和雙香豆素(Thanos et al., 2003). 對(duì)納米乳劑遞藥系統(tǒng)的效果的證明來(lái)自我們實(shí)驗(yàn)室, 相對(duì)于微米乳劑的配方（ASF），在微流化處理器上制備的納米乳劑含有抗氧化劑協(xié)同配方(ASF)，顯著減少鼠模型的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中腫瘤的大小(Kuo et al.,2007)。2材料和方法2.1納米乳劑和微米乳劑的配方納米乳劑是由三種物質(zhì)混合制成：丁型生育酚（西格瑪奧德里奇公司,密蘇里州,美國(guó))(4.62mg/ml)溶解在10 g

6、菜籽油和10 g吐溫80中(西格瑪奧德里奇公司,密蘇里州,美國(guó))。丁型生育酚和-生育酚被用在該研究中，因?yàn)閭}(cāng)鼠體內(nèi)血流本底水平非常低,從而更容易測(cè)定微米乳劑和納米乳劑作用下生育酚的增加量。加熱溶液(50C)，并用電磁攪拌器輕輕地?cái)?0分鐘。加熱二百四十毫升蒸餾水 (60C)，然后加入到該溶液中。繼續(xù)攪拌20分鐘，使溶液均衡。型號(hào)為M-110EH的微流化處理器用來(lái)制備丁型生育酚的納米乳劑（微流體公司，美國(guó)）。微流化處理器通過(guò)加速產(chǎn)物通過(guò)微通道來(lái)提供高壓力及高剪切速率，使產(chǎn)物快速被磨細(xì)到納米范圍。將流體一分為二，以75微米的尺寸高速(50 - 300米/秒)推進(jìn)微通道。流體噴出微通道時(shí)會(huì)與反向的流

7、體碰撞，流體在通道里經(jīng)歷了的高剪切率（107 L/s），數(shù)量級(jí)上優(yōu)于傳統(tǒng)技術(shù)。流體碰撞導(dǎo)致亞微粒水平的混合。因此，高剪切率和撞擊是導(dǎo)致粒徑減小和微流化處理器中多相流體混合的因素。在該研究中，生育酚的納米乳劑配方以24000psi的壓力通過(guò)微流化處理器，而制備微米乳劑的配方不經(jīng)過(guò)微流化處理器。2.2 粘度和粒徑烏氏粘度計(jì)（波士頓，MA，美國(guó)）用來(lái)測(cè)定配方粘度，25C，測(cè)定微滴粒徑均值，動(dòng)態(tài)激光散射莫爾文納米儀器測(cè)定多分散性指數(shù)（粒徑分布的寬度）（莫爾文儀器公司，美國(guó)）。2.3研究設(shè)計(jì)七只敘利亞金倉(cāng)鼠（F1B，菲奇堡，美國(guó)）810周年齡的鼠被單獨(dú)安置在室溫20C的籠子里，12h光循環(huán)。它們被喂食商

8、業(yè)非凈化飲食(Ralston Pruina 4001,密蘇里州圣路易市,美國(guó))和水。兩種乳劑配方分別和低過(guò)敏乳膏劑(PCCA,休斯頓,德克薩斯州,美國(guó))1:1混合。所有的鼠在實(shí)驗(yàn)前一天都刮過(guò)皮毛。在第一天,把1毫升含有乳膏的微米乳劑敷在刮過(guò)皮毛的金鼠的背側(cè)區(qū)域，涂抹直到看不見為止，記下出血基線的時(shí)間，13小時(shí)后，在純CO2 / O2(50/50)氣體(Northeast Airgas, Salem, NH)麻醉下收集通過(guò)眼窩竇到抗凝測(cè)定毛細(xì)管的丁型生育酚，并分析濃度。隨后的一周，使用含有乳膏的納米乳劑給上述金倉(cāng)鼠重復(fù)實(shí)驗(yàn)，倉(cāng)鼠被馬薩諸塞州大學(xué)的洛厄爾的研究辦公室(IACUC)指導(dǎo)委員會(huì)喂養(yǎng)，實(shí)

9、驗(yàn)室動(dòng)物研究所的實(shí)驗(yàn)室資源,國(guó)家研究委員會(huì)(DHEW出版NO.85 - 23,1985年修訂的)。2.4血漿生育酚的分析血漿丁型生育酚濃度測(cè)定：添加200µl的血漿與10µ l的視黃醇乙酸酯(國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn);10µg /ml)和200µl含對(duì)甲酚(BHT)(10 mg / L)的乙醇 1.0 ml己烷,然后混合。樣本在500×g的離心機(jī)中離心5分鐘,有機(jī)層轉(zhuǎn)移到一個(gè)7.0毫升棕色硼硅酸鹽瓶中，殘留樣品用1.0毫升己烷重新提取，有機(jī)層與之前提取液合并。在N2蒸發(fā)有機(jī)層， 加入200µ l含有二叔丁基對(duì)甲酚 (10 mg / dL) 的乙醇再次

10、溶解，并注入到高效液相色譜儀中。高效液相色譜系統(tǒng)是一個(gè)型號(hào)5600 CoulArray的八管道系統(tǒng)，有兩個(gè)580型泵、高壓梯度混合器, PEEK脈沖阻尼器,一個(gè)540的自動(dòng)注射器，調(diào)溫室和一串連續(xù)的八個(gè)電量電極(ESA實(shí)驗(yàn)室.,切姆斯福德,MA美國(guó))。柱子：3.0 mm×150 mm，3µm Supelcosil LC-18 (色譜科，貝爾豐特，PA，美國(guó))，流動(dòng)相由甲醇/ 1 m，丙醇/ 1 m，醋酸銨(78:20:2 v / v / v) 以0.8ml/min的速度流動(dòng)。生育酚的濃度決定于標(biāo)準(zhǔn)化的純凈丁型生育酚 (Sigma Chemicals,圣路易斯,密蘇里州,美國(guó)

11、)。2.5統(tǒng)計(jì)評(píng)估 用SigmaStat軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估（Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) (Snedecor and Cochouran, 1980) 用重復(fù)單向的方差 (RM方差分析)法來(lái)分析使用兩種乳劑1 - 3 h后基線之間的血漿生育酚濃度。通過(guò)方差分析發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)的有效性，用Student-Newman-Keuls分離法確定差異，Apaired t-test用于分析每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)血漿生育酚濃度，所有的值表示為均值+S.E.M，統(tǒng)計(jì)學(xué)有效度p < 0.05。3.結(jié)果3.1微流化處理器對(duì)制備丁型生育酚粒徑和濃度的影響丁型生育酚的微米乳劑和納米

12、乳劑的粒徑分別是2788 nm 和 65 nm（圖1和圖2）,圖1中，第三個(gè)峰是截止的，因?yàn)樗^(guò)了莫爾文納米儀器的測(cè)定范圍。我們可以假設(shè)微型乳劑的真實(shí)粒徑大于圖中所示的2788nm。兩種丁型生育酚的起始濃度是4.6mg/ml.圖1.微米型丁型生育酚乳劑的動(dòng)態(tài)激光散射粒徑分析顯示粒子平均粒徑2788nm,在0.08 66µm范圍波動(dòng)。圖2. 納米型丁型生育酚乳劑的動(dòng)態(tài)激光光散射粒徑分析顯示粒子平均粒徑65nm在 10200nm范圍波動(dòng)。丁型生育酚的最終濃度在微米級(jí)的乳劑配方(4.13毫克/毫升)要高出納米級(jí)的乳劑配方(3.48毫克/毫升)19%。我們之前已經(jīng)證明損失的丁型生育酚是因?yàn)?/p>

13、單獨(dú)通過(guò)微流化處理器（圖中未顯示）。3.2丁型生育酚的微米乳劑與納米乳劑生物利用度的研究在敷用微米乳劑或納米乳劑1h后，相對(duì)于基線沒(méi)有觀察到明顯的血漿丁型生育酚濃度差別（圖3）。2h后，使用生育酚納米乳劑的倉(cāng)鼠，血漿生育酚濃度相對(duì)基線有明顯增加（36倍），使用1h后（10倍）（圖3）。3h后，敷用丁型生育酚納米乳劑的倉(cāng)鼠，血漿濃度相對(duì)基線上升（68倍），1h 后（20倍），2h后（0.86倍）（圖3）。相比較而言，敷用丁型生育酚微米乳劑的倉(cāng)鼠，在2h和3h 后生育酚相對(duì)于基線分別上升了9倍、11倍。另外，在兩組數(shù)據(jù)中，敷用納米型生育酚倉(cāng)鼠的血漿濃度在2h(129%),3h（265%）分別高于使

14、用微米丁型生育酚的倉(cāng)鼠。4.討論丁型生育酚納米乳劑的平均粒徑為65nm，而其微米乳劑的平均粒徑為2788nm。微米乳劑的第三個(gè)峰超過(guò)了莫爾文儀器所測(cè)定的范圍，我們假設(shè)它的實(shí)際粒徑可能要大于我們所得到的數(shù)據(jù)，粒徑的差別可能是使用納米乳劑比使用微米乳劑生育酚血漿濃度要高的一個(gè)主要因素。我們的實(shí)驗(yàn)室有更多的證據(jù)支持該結(jié)論（(Kuo et al., 2007），使用了抗氧化劑協(xié)同的納米乳劑的小鼠，神經(jīng)母細(xì)胞瘤明顯下降。在研究中，相對(duì)使用了微米乳劑的小鼠，敷用納米乳劑的小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯下降。此外，我們的研究和更早的引證也說(shuō)明了粒徑對(duì)幾類化合物的生物利用度的影響(Yan et al., 200

15、2; Thanos et al., 2003; Kumar et al., 2004; Vila et al., 2005)。類似的發(fā)現(xiàn)也被報(bào)到(de Smidt et al., 2004).。penclomedine作為中鏈甘油三酯，粒徑在納米范圍(160720 nm)，配方的粒徑在160nm有一個(gè)很好的生物利用度。作者提出小粒徑的粒子可以滲入更大的范圍，有一個(gè)更大的表面積的表面吸收，從而成為更有效的遞藥系統(tǒng)（Seki et al. 2004) 報(bào)道說(shuō), 相比于300nm的地塞米松棕櫚酸酯(DMP) 25 nm的地塞米松棕櫚酸酯(DMP)作為活性物質(zhì)，有效性更好,在不同條件下粒徑穩(wěn)定，藥物血

16、漿濃度高，改善其在抗炎部位的分布容積，（Wegmuller et al. (2004)。報(bào)道稱,鐵元素粒徑的決定從食物中吸收難溶性鐵類物質(zhì)的難易程度，通過(guò)減小鐵元素的粒徑，可以增加小鼠對(duì)鐵元素吸收。在目前的研究中假設(shè)，比微米生育酚小42倍的納米生育酚可以增加表面體積比，從而有效的影響生物利用度。局部的施用，納米乳劑可以增加水溶性差的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和藥物的吸收，將其傳遞到細(xì)胞膜，藥物釋放并作用在皮膚表面，增加藥物的皮膚滲透(Paolino et al., 2002)。藥物在媒介中的流動(dòng)性和在其中釋放速度及在皮膚表面的滲透性這三個(gè)因素決定了經(jīng)皮滲透的效果。這些因素也影響了藥物在皮膚中傳遞的熱力學(xué)活性或者在皮膚中的滲透作用，尤其是角質(zhì)層(Peltola et al., 2003)。小粒徑的藥物增加角質(zhì)層的吸收，促進(jìn)了封裝藥物/營(yíng)養(yǎng)滲透進(jìn)