血吸蟲試劑盒主要原材料研究資料

1、血吸蟲抗體快速檢測(cè)試劑盒主要原材料的研究資料1 .血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)(試劑盒檢測(cè)點(diǎn)原料)(1)制備方法：取人工感染1500條日本血吸蟲尾蝸 45d的家兔肝臟，用生理鹽水洗凈后經(jīng)高速搗碎機(jī) 搗碎，分樣篩分離除去肝臟組織，沉淀離心，收集分離蟲卵，依次經(jīng) 200目和300目尼龍 絹過(guò)濾，收集濾渣，即為較純凈的血吸蟲蟲卵。然后加入10倍量的生理鹽水，置玻璃勻漿器內(nèi)制成勻漿，用超聲粉碎機(jī)超聲處理 (1minX10次)，液氮凍融3次，最后以10 000 r/ min 離心30 min ,上清液即為血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA),經(jīng)0.22um超濾膜過(guò)濾除菌后分裝，一20C凍存?zhèn)溆谩?2)抗原性

2、測(cè)定a.測(cè)定方法1) 取抗原2001加入比色杯內(nèi)，用分光光度計(jì)測(cè)定A280和A260OD值；2) 將抗原用pH9.6碳酸鹽緩沖液作1:4、1:8、1:16、1:32、1:64稀釋,分別包被于酶標(biāo)板內(nèi) (100ul/孔),37C 3小時(shí)；然后傾去抗原液，用洗滌液洗滌3次，每次5分鐘；BSA(0.5mg/ml) 為對(duì)照，同法操作；3) 加樣：分別加已作 1:100稀釋的血吸蟲抗體檢測(cè)質(zhì)控品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清各100d,空白孔僅加100 /稀釋液。置于濕盒內(nèi)，37 C培育30分鐘；4)洗板：取出酶標(biāo)板，甩去孔內(nèi)液體，每孔注滿洗滌液洗滌 5次，每次均需停留30秒后 再甩凈拍干；5)加酶標(biāo)結(jié)合物：除空

3、白對(duì)照孔外，每孔加入酶標(biāo)結(jié)合物2滴，37c培育30分鐘；6) 洗板：同3;7) 顯色：每孔加底物和顯色劑各1滴，混勻，37c避光反應(yīng)10分鐘，加終止液1滴，混勻，判斷結(jié)果。b.判斷依據(jù)：1) 根據(jù)公式計(jì)算：樣品濃度( mg/ml) = (1.45X A280-0.74 X A260 ) X稀釋倍數(shù)； 2)肉眼觀察：不加終止液觀察，基本無(wú)色或微藍(lán)色為陰性，呈明顯藍(lán)色為陽(yáng)性；3) 儀器判斷：酶標(biāo)儀上450nm讀取OD值，待檢樣本孔的OD值大于陰性對(duì)照 2.1倍者為陽(yáng)性。c.結(jié)果抗原OD值A(chǔ)280nm2.1510抗原OD值A(chǔ)260nm2.5121SJK-DIGFA-008第7頁(yè)共7頁(yè)計(jì)算公式抗原濃度

4、抗原濃度(mg/ml) = ( 1.45XA280-0.74 X A260 ) X稀釋倍數(shù);1.26mg/mlSEA陰參陽(yáng)參血吸蟲抗體檢測(cè)質(zhì)控品陽(yáng)參比值血吸蟲抗體檢測(cè)質(zhì)控品1:40.050.450.159.033.081:80.040.510.1710.263.481:160.050.520.1910.313.781:320.050.490.189.413.521:640.060.610.2410.924.35BSA0.010.040.010.820.11結(jié)論：濃度為1.26mg/ml,經(jīng)倍比稀釋，用于 ELISA檢測(cè)血吸蟲抗體陽(yáng)性臨界血清, 1:64（0.02mg/ml）仍呈陽(yáng)性結(jié)果，具有高

5、度的免疫原性，可用于血吸蟲抗體檢測(cè)（3）工作濃度：SEA的作用是作為檢測(cè)點(diǎn)，包被于硝酸纖維素膜上，用于檢測(cè)人血清中特異性抗血吸 蟲抗體。因此，其工作濃度的選擇對(duì)于檢測(cè)效果的評(píng)價(jià)是試劑盒研制的關(guān)鍵技術(shù)。如果濃度過(guò)高，陽(yáng)性反應(yīng)色度過(guò)強(qiáng)，易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；反之，濃度過(guò)低，則不易辨別，影響檢測(cè)的 靈敏度。所以，研究目的是選擇能較清晰產(chǎn)生反應(yīng)色度的最低抗原濃度。方法：a. SEA抗原原液濃度測(cè)定：以紫外分光光度法測(cè)定 SEA抗原原液A280和A260OD值, 根據(jù)公式計(jì)算濃度（mg/ml） =1.45X A280-0.74 X A260 ;b. SEA稀釋：以0.02 mol/L pH8.0 PBS將S

6、EA從1:2至1:10稀釋成9個(gè)稀釋度，與原 液一起分成10個(gè)濃度組。c.包被：將上述10個(gè)濃度的SEA分別點(diǎn)膜，在每塊空白反應(yīng)板中的硝酸纖維素膜 （德 國(guó)Schleicher & Schuell Bioscience,孔徑0.45um）上點(diǎn)滴1ul,每個(gè)濃度組包被 3塊，室溫 干燥2小時(shí)后加入2滴封閉液（主要成分為牛血清白蛋白） ，待干。c. 效果測(cè)試：分別在上述 10個(gè)濃度組的金標(biāo)反應(yīng)板中央小孔內(nèi)滴加2滴洗滌液，滲入后于反應(yīng)板中央加 25止血吸蟲抗體檢測(cè)質(zhì)控品（參照血吸蟲病抗體診斷試劑國(guó)家參考品低 感染度血清（P13）制備，方法見(jiàn)附頁(yè)），待液體充分吸入，加 2滴洗滌液，滲入后分別加

7、 3種 濃度的顯色液（即金標(biāo)二抗，濃度依據(jù)A520OD值確定，制備方法見(jiàn)后），每塊反應(yīng)板加1種濃度的顯色液，每種顯色液均加 4滴，最后加2滴洗滌液，滲入后根據(jù)檢測(cè)點(diǎn)顏色深淺判 斷效果。結(jié)果：d. SEA 抗原原液 OD 值：A280 為 2.1510, A260 為 2.5121 ,根據(jù)公式（mg/ml） =1.45 X A280-0.74 X A260 計(jì)算，濃度為 1.26 mg/ml。b.檢測(cè)效果金標(biāo) 二抗 濃度SEA抗原稀釋度原液1:21:31:41:51:61:71:81:91:101.2+土1.0+土土0.8+土土土土土-注：色度判斷：+深，+易見(jiàn)，誡，-無(wú)c.最適工作濃度選擇：

8、金標(biāo)二抗?jié)舛仍?.2 （A520值）時(shí)所有金標(biāo)反應(yīng)板的背景較深， 且制備成本高；0.8時(shí)，檢測(cè)效果較差；1.0時(shí)的檢測(cè)效果最好，在抗原稀釋度1:8（0.157mg/ml） 仍可清晰顯示檢測(cè)點(diǎn)。因此，抗原最適工作濃度為1:51:8范圍內(nèi)（約0.2 205mg/ml）,而金標(biāo)二抗的最適工作濃度為1.0 （A520值）。進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)：以0.2mg/ml工作濃度的SEA抗原為檢測(cè)點(diǎn)，1.0 （A520值）金標(biāo)二抗為顯色液研制的 血吸蟲抗體快速檢測(cè)試劑盒（斑點(diǎn)免疫金滲濾法），采用中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的“血吸蟲病抗體診斷試劑國(guó)家參考品”（批號(hào)：20041108）作為測(cè)定血清。其中陰性參考品由15份

9、正常人血清組成，血吸蟲病抗體均為陰性，用于測(cè)定試劑盒的特異性。陽(yáng)性參考品由 15份強(qiáng)、中、弱陽(yáng)性血清組成，用于測(cè)定試劑盒對(duì)血吸蟲病抗體陽(yáng)性血清的檢出能力。最 低陽(yáng)性檢出參考品為 1份血吸蟲病抗體陽(yáng)性樣品，從1:21:16作倍比稀釋，用于測(cè)定試劑盒的最低檢出量（靈敏度）。診斷試劑的精密性測(cè)定由1份中等陽(yáng)性血清組成，重復(fù)檢測(cè)10次，用于測(cè)定試劑盒的精密性（操作方法同1 （3） d ）。結(jié)果:血清份數(shù)陰性（數(shù)）陽(yáng)性（數(shù)）符合率（）陰，性參考品15150100陽(yáng)性經(jīng)f品15015100精密度參考品10010100火敏度經(jīng)f品1:2+（1 份）1:4+（1 份）1:8羽份）1:16-（1 份）2.金標(biāo)二

10、抗（試劑盒顯色液原料） （1）制備方法：a.膠體金制備采用糅酸-檸檬酸鈉還原法，膠體金顆粒直徑為20 nm。具體方法為：取1%氯金酸5ml溶于395 ml dH2O,加熱至60 C ,快速加入糅酸-檸檬酸鈉溶液100 m l（1%檸檬酸三鈉20 ml, 1%糅酸0.05 ml, dH2O 80 ml ),加熱煮沸15 min,溶液顏色由黑逐漸變?yōu)榱良t色。冷卻后 用0.1 mol/L碳酸鉀調(diào)溶液 pH至8.0。b.金標(biāo)二抗制備二抗為親和層析法純化的羊抗人IgG(上海神航生物科技有限公司，蛋白濃度為3.34mg/ml,批號(hào)：IP2030)。最適蛋白穩(wěn)定量選擇：將待標(biāo)記的二抗分別加到1ml膠體金溶液

11、中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對(duì)照管，5分鐘后加入 0.1ml 10% NaCl溶液，混勻后靜置2 小時(shí)觀察結(jié)果，紅色不變者為能使膠體金穩(wěn)定的蛋白量，再加20%即為最適標(biāo)記蛋白量。反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)下表：試管123456膠體金1ml1ml1ml1ml1ml1ml二抗0 ul1 ul1.5 ul2 ul2.5 ul3 ul10%NaCl0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml顏色藍(lán)淺藍(lán)灰淺紅紅紅從反應(yīng)結(jié)果觀察，5號(hào)管(2.5ul)顏色未變，2.5ulX120%=3 ul,再乘以二抗的蛋白濃度3.34mg/ml ,則最適蛋白穩(wěn)定量為0.01mg/ml膠體金。在500 ml膠體金溶液內(nèi)加入 5

12、mg二抗，磁力攪拌 30 min ,依次加入 1% PEG20000 20ml和5% BSA 80 ml ,繼續(xù)攪拌 10 min , 20 000 r/min 離心 20 min ,沉淀物用 PB 緩沖液(0.02 mol/L , pH8.0)洗滌，再以 20 000 r/min 離心20 min,沉淀物用金標(biāo)稀釋液(0.02 mol/L , pH8.0 TBS)稀釋至 A520nm為0.8、1.0、 1.2等3種濃度，過(guò)濾除菌。(2)最適工作濃度選擇：分別用以上3種濃度的金標(biāo)二抗檢測(cè)已包被不同濃度抗原的 檢測(cè)點(diǎn)，根據(jù)檢測(cè)點(diǎn)顏色深淺和背景¥#晰度判斷效果，操作方法同1 (2) do

13、(3)結(jié)果：同1 (3) b, c,金標(biāo)二抗?jié)舛仍?1.0時(shí)的檢測(cè)效果最好，在抗原稀釋度1:8(0.157mg/ml )仍可清晰顯示檢測(cè)點(diǎn)。繼對(duì)“血吸蟲病抗體診斷試劑國(guó)家參考品”進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證了這一工作濃度的顯色效果(見(jiàn)1 (4)。3.人IgG (試劑盒質(zhì)控點(diǎn)原料)(1)制備方法：采用辛酸提取法，從健康獻(xiàn)血者 5ml血清中提取人IgG。經(jīng)0.22um超濾膜過(guò)濾除菌后 分裝，2ul/支，置凍干機(jī)抽成干粉，-20C保存。臨用時(shí)每支加工作濃度的 0.02 mol/L pH8.0 PBS 緩沖液復(fù)溶即可。(2)活性測(cè)定a.測(cè)定方法1) 取人IgG 10 l由口 190 d生理鹽水作1:20稀釋后

14、加入比色杯內(nèi)，用分光光度計(jì)測(cè)定 A280 和 A260OD 值；2)將樣品用pH9.6碳酸鹽緩沖液從 1:6400起倍比稀釋14個(gè)滴度，分別包被于酶標(biāo)板內(nèi) (100ul/孔),37C3小時(shí)；然后傾去液體，用洗滌液洗滌3次，每次5分鐘；BSA (0.5mg/ml) 為陰性對(duì)照，同法操作；3)加酶標(biāo)結(jié)合物：除空白對(duì)照孔外，每孔加入酶標(biāo)結(jié)合物2滴，37 c培育30分鐘；4)洗板：取出酶標(biāo)板，甩去孔內(nèi)液體，每孔注滿洗滌液洗滌5次，每次均需停留30秒后再甩凈拍干；5) 顯色：每孔加底物和顯色劑各1滴，混勻，37 C避光反應(yīng)10分鐘，加終止液1滴,混勻，判斷結(jié)果。b.判斷依據(jù)：1) 根據(jù)公式計(jì)算：人IgG

15、濃度(mg/ml) = (1.45X A280-0.74 X A260 ) X稀釋倍數(shù)；2)肉眼觀察：不加終止液觀察，基本無(wú)色或微藍(lán)色為陰性，呈明顯藍(lán)色為陽(yáng)性；3) 儀器判斷：酶標(biāo)儀上450nm讀取OD值，待檢樣本孔的OD值大于陰性對(duì)照 2.1倍者為 陽(yáng)性。c.結(jié)果：人 IgG OD 值 A280nm2.8619人 IgG OD 值 260nm 1.7831計(jì)算公式人 IgG 濃度(mg/ml) = (1.45X A280-0.74 X A260 ) X稀釋倍數(shù)；人 IgG 濃度56mg/ml人IgGOD值比值人IgGOD值比值1:64002.56867551.37351:16384000.0

16、1990.3979961:128002.50180450.036071:32768000.013580.2715961:256002.11549742.309941:65536000.003660.0731981:512001.2928525.856991:131072000.009180.1835981:1024000.61812912.362581:262144000.006110.1221981:204800.3102796.2055821:524288000.005520.1103991:4096000.097321.946396BSA0.013540.27081:8192000.05

17、911.181997空白-0.00069-0.0138d.結(jié)論：原液濃度為 56mg/ml,從1:6400起作倍比稀釋，經(jīng) ELISA方法檢測(cè)，最低檢測(cè)濃 度為1:204800(0.3 pg / ml),與抗人IgG的結(jié)合力強(qiáng)，可用作斑點(diǎn)免疫金滲濾法質(zhì)控點(diǎn)。(3)工作濃度：人IgG的作用是作為質(zhì)控點(diǎn)，包被于硝酸纖維素膜上，能夠與金標(biāo)二抗結(jié)合，產(chǎn)生紅 色圓點(diǎn)，以此判斷金標(biāo)二抗處于有效期內(nèi)；如不能出現(xiàn)紅色圓點(diǎn)，則金標(biāo)二抗失效。因此， 試驗(yàn)?zāi)康木褪沁x擇能清晰產(chǎn)生反應(yīng)色度的人IgG濃度。a方法：1) 人IgG原液濃度測(cè)定：以0.02 mol/L pH8.0 PBS將原液作1:20稀釋，用紫外分光光度儀

18、 測(cè)定 A280 和 A260OD 值，根據(jù)公式2計(jì)算濃度(mg/ml) = (1.45XA280-0.74 X A260) X稀釋倍數(shù)；2) 以0.02 mol/L pH8.0 PBS 將人IgG原液從1:100至1:1000稀釋成10個(gè)稀釋度。3)包被：將上述10個(gè)濃度的人IgG分別點(diǎn)膜，在每塊空白反應(yīng)板中的硝酸纖維素膜(德國(guó)Schleicher & Schuell Bioscience )上點(diǎn)滴0.5ul,每個(gè)濃度組包被 1塊，室溫干燥 2小時(shí)后加入2滴封閉液，待干。4)效果測(cè)試：分別在上述 10個(gè)濃度組的金標(biāo)反應(yīng)板中央小孔內(nèi)滴加2滴洗滌液，滲入后于滴加4滴顯色液(即金標(biāo)二抗，濃

19、度 1.0 (A520值)，最后加2滴洗滌液，滲入后根 據(jù)檢測(cè)點(diǎn)顏色深淺判斷效果。b.結(jié)果：1） 人 IgG 作 1:20 稀釋的 OD 值：A280 為 2.8619, A260 為 1.7831 ,根據(jù)公式（mg/ml）=(1.45 X A280-0.74 X A260 ) X稀釋倍數(shù)計(jì)算，原液濃度為56 mg/ml。2)檢測(cè)效果金標(biāo) 二抗 濃度人IgG稀釋度1:1001:2001:3001:4001:5001:6001:7001:8001:9001:10001.0+土土土土注：色度判斷：+深，+易見(jiàn)，誡c.最適工作濃度選擇：人 IgG在工作濃度1:600至1:100 (約0.1mg/ml

20、0.6 mg/ml)均 能清晰顯示紅色圓點(diǎn)， 均可作為判斷金標(biāo)二抗是否有效的質(zhì)控點(diǎn)。但因?qū)嶋H用量極微(每只反應(yīng)板僅需0.5 ul),最適工作濃度選擇 1:300(0.19mg/ml)為宜。參考文獻(xiàn)1 毛守白主編.血吸蟲生物學(xué)與血吸蟲病的防治.北京：人民衛(wèi)生出版社，1990: 465.2 現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002年3 丁建祖，干小仙，沈慧英，等.快速檢測(cè)抗日本血吸蟲抗體的金標(biāo)免疫滲濾法的建立及應(yīng)用J.中國(guó)寄生蟲病防治雜志,1998,11 (4) :308-3104 辛?xí)苑?，張?jǐn)，薄淑英，等.血吸蟲病免疫診斷試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)J.中國(guó)血吸蟲病防治雜志,2006,18(2):119-121.附：血吸蟲抗體檢測(cè)質(zhì)控品制備方法本品參照“血吸蟲病抗體診斷試劑國(guó)家參考品”(批號(hào)：20041108)低感染度抗體水平(P13)制備，作為斑點(diǎn)免疫金滲濾法試劑盒出廠檢驗(yàn)的質(zhì)控品。具體方法：將2 ml血吸蟲病陽(yáng)性血清(江西