輻射對神經(jīng)細(xì)胞移動(dòng)

1、輻射對神經(jīng)細(xì)胞移動(dòng)     本文作者：邱 俊、蔡二朋、吳翠萍、王明明                                   單位： 安徽醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所、安徽醫(yī)科大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所中樞神經(jīng)系

2、統(tǒng)因其特殊性，其輻射生物效應(yīng)的研究歷來受到人們的重視。國際放射防護(hù)委員會(huì)（ICRP）和聯(lián)合國原子輻射效應(yīng)科學(xué)委員會(huì)（UNSCEAR）曾對有關(guān)胚胎和胎兒受照影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的人類資料和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料進(jìn)行了全面綜述和評論1，2，證明輻射能以損傷神經(jīng)元前體細(xì)胞、影響神經(jīng)元遷移及其通道分化、神經(jīng)元間正確聯(lián)系及神經(jīng)元的分布等多種方式干擾腦發(fā)育,使其結(jié)構(gòu)異常,機(jī)能發(fā)育延遲和低下。而細(xì)胞遷移涉及鈣離子濃度、細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)變化3。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度、微管和神經(jīng)細(xì)胞粘附分子表達(dá)改變等角度來研究輻射對神經(jīng)元細(xì)胞遷移的影響，以深入了解輻射所致腦損傷機(jī)理，為防治這種損傷提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法

3、1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出生24小時(shí)內(nèi)的SD新生鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2細(xì)胞與試劑DMEM/F12（11）和B27購于Gibco公司;bFGF、EGF、MAP2抗體購于Sigma公司；Fluo-3/AM（美國分子探針公司）；培養(yǎng)板（6孔、24孔、96孔，美國Falcon公司）；小鼠抗大鼠-微管蛋白（-tubulin）抗體，NCAM單克隆抗體（OBl1，Sigma公司）；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購于北京中杉金橋生物工程公司。1.3細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)取新生1天SD大鼠，無菌條件下分離雙側(cè)海馬，剪碎，加0.25%胰蛋白酶消化（37，30min）然后用胎牛血清終止消化；彎頭滴管輕輕吹打10次，

4、以800r/min離心10min，棄上清，重新懸浮細(xì)胞，過200目篩網(wǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL種植于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的24孔板和60mm培養(yǎng)皿,培養(yǎng)基為DMEM/F12(含10%胎牛血清、2%B27，bFGF20g/mL，EGF20g/mL),置于37，5%CO2，飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng);接種第3天加入終濃度為5mol/LAra-c作用48小時(shí),抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。1.6神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離Ca2+測定用0.25胰蛋白酶消化法制備細(xì)胞懸液。0.1mol/mLPBS洗滌2次,取細(xì)胞懸液lmL，加Fluo-3/AM至終濃度為5mol/L，置CO2培養(yǎng)箱，避光孵育1小時(shí)，其間輕輕

5、振蕩幾次。取細(xì)胞懸液，離心，棄上清。0.1mol/mLPBS洗滌3次，最后用PBS重懸至0.5mL，流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為506nm，發(fā)射波長為526nm。隨機(jī)測定單個(gè)神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度值，取其平均值為各組測定值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)4個(gè)平行樣。結(jié)果以WinMDI2.9軟件分析處理,利用熒光強(qiáng)度的大小來相對反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的大小。1.7Westernblot檢測收集HTO處理過的細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)考馬斯亮蘭G-250染色法定量蛋白。灌制7分離膠和5濃縮膠，取30L總蛋白上樣，經(jīng)十二烷基苯磺酸鈉一聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶封閉；分別與一抗

6、-tubulin（1500）和NCAM單克隆抗體（1800）孵4過夜；加二抗（15000）室溫孵育1小時(shí)；發(fā)光顯影，定影晾干，同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參對照。圖像分析：分別對實(shí)驗(yàn)組的Westernblot結(jié)果進(jìn)行圖像掃描，各組隨機(jī)抽取10張掃描圖像，以GAPDH蛋白表達(dá)條帶作為目的帶進(jìn)行IOD測定，然后根據(jù)目的蛋白表達(dá)的IOD與GAPDH蛋白表達(dá)的IOD比值作為相對量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)4個(gè)平行樣。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)表示為均值±單次測量標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組之間進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1氚輻射對神經(jīng)細(xì)胞遷移的影響不同劑量氚水照后

7、8小時(shí)神經(jīng)細(xì)胞遷移的距離列于表1。由表1可見，氚水濃度在03.7×106Bq/mL，神經(jīng)細(xì)胞的遷移距離呈現(xiàn)劑量依賴性縮短,均明顯小于對照（p<0.05）。2.2氚輻射對Ca2+濃度的影響照后24小時(shí)，用Fluo-3/AM標(biāo)記腦海馬神經(jīng)元，以流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度來間接反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，結(jié)果示于圖1。由圖1可見，隨著氚水照射劑量的增大，受照細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度分別為42.83±6.38、55.64±9.15、58.19±7.24、80.27±9.67，均明顯高于對照組（25.59±8.92，p<0.05），呈劑量依賴性

8、增加。表明加入氚水后，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子增多。2.3氚輻射對-tubulin表達(dá)的影響結(jié)果示于圖2。由圖2可見，隨著氚輻射劑量的增大，各組細(xì)胞內(nèi)-tubulin蛋白含量逐漸降低，-tubulin與GAPDH蛋白OD值之比分別為2.057±0.096、1.849±0.126、1.737±0.12、1.181±0.308、0.920±0.262。2.4氚輻射對NCAM表達(dá)的影響結(jié)果示于圖3。由圖3可見，隨著輻射劑量的增大，各組細(xì)胞NCAM蛋白表達(dá)量逐漸降低，NCAM與GAPDH蛋白OD值之比分別為0.436±0.032、0.401±

9、;0.013、0.381±0.026、0.232±0.047、0.132±0.031。受照神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的NCAM含量明顯低于對照（p0.05）。3討論神經(jīng)細(xì)胞的遷移是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，研究輻射影響神經(jīng)細(xì)胞遷移的分子機(jī)制有助于深入了解腦輻射損傷。輻射對腦損傷的研究以前主要集中在輻射對大腦皮層和海馬結(jié)構(gòu)的組織、細(xì)胞及大腦內(nèi)蛋白質(zhì)水平的損傷效應(yīng)及這些損傷與輻射所致腦機(jī)能障礙之間的關(guān)系4-6。但低劑量輻射妨礙神經(jīng)元細(xì)胞遷移及其分子機(jī)制的相關(guān)資料相當(dāng)缺乏，本實(shí)驗(yàn)通過從鈣離子、細(xì)胞骨架和神經(jīng)細(xì)胞粘附分子等三方面來深入研究輻射影響神經(jīng)細(xì)胞遷移的相關(guān)分子機(jī)制。結(jié)果證實(shí)

10、電離輻射可使神經(jīng)細(xì)胞遷移發(fā)生顯著改變。電離輻射作用于神經(jīng)元細(xì)胞，引起鈣離子內(nèi)流，從而激活一系列信號通道，引起相關(guān)分子如細(xì)胞骨架蛋白和神經(jīng)細(xì)胞粘附分子的變化，影響神經(jīng)元遷移。鈣離子是神經(jīng)細(xì)胞信息傳遞及神經(jīng)遞質(zhì)合成與釋放重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)一定濃度的游離Ca2+對維持細(xì)胞正常的生理活動(dòng)包括細(xì)胞遷移起著重要的作用。Ca2+通道有細(xì)胞溶質(zhì)蛋白因此具有緩沖能力，所以Ca2+內(nèi)流可在進(jìn)入位點(diǎn)周圍產(chǎn)生局部信號。局部信號隨Ca2+內(nèi)流逐漸增多而產(chǎn)生一系列的增大效應(yīng)，以至于細(xì)胞膜系（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）的其他一些離子通道開放，引起胞內(nèi)一系列的反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元遷移和軸突生長過程中有Ca2+的信號表達(dá)。在上皮

11、角質(zhì)細(xì)胞和小腦神經(jīng)元細(xì)胞遷移過程中Ca2+作用不同，故其濃度分布也迥然不同3。在其他實(shí)驗(yàn)中同樣也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)游離Ca2+的增多，可以刺激介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞遷移相關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白的變化3，7。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，受氚水照射后細(xì)胞游離Ca2+的含量均有改變。隨著照射劑量的增加，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的含量呈上升趨勢。電離輻射直接作用于神經(jīng)細(xì)胞，可引起Ca2+大量內(nèi)流，激活鈣依賴性蛋白酶（calpain），使細(xì)胞骨架蛋白降解，影響神經(jīng)細(xì)胞遷移8。細(xì)胞骨架是構(gòu)成細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)，而微管蛋白是神經(jīng)細(xì)胞骨架成分微管的重要組成部分，它具有神經(jīng)特異性，是最早的神經(jīng)元標(biāo)志物之一。受照后，微管蛋白上有一些重要的與微

12、管功能密切相關(guān)的巰基基團(tuán)被氧化,影響這些基團(tuán)所在區(qū)域構(gòu)象改變,妨礙微管聚合。同時(shí)電離輻射可誘發(fā)微管相關(guān)蛋白激酶失活，致使微管相關(guān)蛋白（MAP）磷酸化，失去結(jié)合微管的能力，因?yàn)镸AP參與微管的組裝及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,當(dāng)MAP被磷酸化后失去結(jié)合微管的能力,從而使微管處于不穩(wěn)定狀態(tài)9-12。微管構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)的網(wǎng)狀支架，支持和維持細(xì)胞的形態(tài)，是細(xì)胞骨架的主要成分之一，參與細(xì)胞分裂、遷移和極化。細(xì)胞遷移時(shí)微管被極化，促進(jìn)與遷移有關(guān)物質(zhì)的運(yùn)輸，有利于整個(gè)細(xì)胞的極化和遷移進(jìn)行。資料證實(shí)，NUDF（NuclearDistributionF）人類同系物L(fēng)IS1（1issencephalyprotein1）、NUDE與微

13、管或其他細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白動(dòng)力蛋白、動(dòng)力肌動(dòng)蛋白共同控制細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)13，14。本實(shí)驗(yàn)Westernblot結(jié)果表明，隨著HTO輻射劑量的增加，神經(jīng)元細(xì)胞骨架蛋白-tubulin的灰度值呈下降趨勢，證實(shí)輻射影響微管蛋白表達(dá)。故電離輻射使微管處于不穩(wěn)定狀態(tài)，妨礙微管的聚合，從而阻止神經(jīng)元細(xì)胞的遷移。NCAM屬于粘附分子免疫球蛋白超家族成員之一，NCAM可以通過參與同源性(NCAM-NCAM)和異源性（NCAM和一系列蛋白包括成纖維生長因子受體、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子L1和不同類型的膠原和蛋白聚糖）細(xì)胞間相互作用來調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞軸突生長、遷移15，16。這種細(xì)胞間相互作用過程可能與成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）受體可激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)。FGF受體上含有細(xì)胞粘附分子的同源結(jié)構(gòu)域（CHD）。NCAM可能通過與CHD上的NCAM同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合來調(diào)節(jié)FGF受體活性。本研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞受照后，NCAM隨氚輻射劑量增加而表達(dá)減少，從而影響神經(jīng)細(xì)胞遷移。當(dāng)電離輻射作用于神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，誘導(dǎo)大量Ca2+內(nèi)流，激活磷脂酶C（PLC）產(chǎn)生甘油二酯（DAG），此時(shí)FGF受體可能受到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，活性受到抑制，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞遷移15-17。