自發(fā)性高血壓大鼠腦缺血后腦區(qū)一氧化氮的變化

1、自發(fā)性高血壓大鼠腦缺血后腦區(qū)一氧化氮的變化摘要目的： 研究自發(fā)性高血壓大鼠(SHR) 腦缺血后大腦皮質(zhì)、海馬、 紋狀體和小腦組織中一氧化氮(NO)的變化。 采用放射免疫法和 熒光分光光度法檢測腦組織中一氧化氮合酶(NOS)和亞硝酸鹽(NO2)的含量。 結果顯示SHR 腦缺血10 min， 各腦區(qū)NOS和NO2的含量均明顯高于假手術組(P0.01或P0.05) 。 說明了SHR腦缺血早期腦組織NO的生成增加， 提示用特異的NO生成抑制劑類藥物， 可能 有助于腦缺血的治療。關鍵詞腦缺血一氧化氮合酶亞硝酸鹽自發(fā)性高血壓大鼠 Change of nitric oxide in brain region

2、s of SHR during cere bral ischemiaWu Xiuli, Zhang Hong, Xu Guoyan, Liu Youyao, Murong Shensing.Department of Neurology, 1st Affiliated Hospital, Fujian Medical University, F uzhou, 350005Abstract To study the change of nitric oxide in cerebral co rtex, hippocampus, striatum and cerebellum during cer

3、ebral ischemia in SHR. The activity of nitric oxide synthase(NOS) and the level of nitrite(NO2)were measu red with radioimmunoassay and fluorometric method. The results showed that after 10 min cerebral ischemia, the activity of NOS and the level of NO2 in four re gions were significantly higher com

4、pared with sham-operated (P0.01 or P0 .05). These results indicated that the level of NO in brain regions significan tly increased in SHR during cerebral ischemia. It suggested that using specific NO inhibitor to suppress the excessive production of NO at early stage of ischem ia may benefit to the

5、treatment of cerebral ischemia.Key words cerebral ischemia nitric oxide synthase ni trite spontaneously hypertensive rats.一氧化氮(NO)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的遞質(zhì)分子， 在 中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛的作用1。 臨床研究證實高血壓是引起腦卒中的重要因 素之一。 本實驗通過檢測自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)全腦缺血后腦區(qū)一氧化氮合酶(NOS)和一 氧化氮代謝產(chǎn)物(NO2)的變化， 研究NO在腦缺血中的作用。材料與方法1. 實驗動物及分組： 健康雄性SHR大鼠， 體重24020g，

6、由福建省高血壓病研究所動 物室提供， 隨機分為腦缺血10 min組和假手術組， 每組8只動物。2. 腦缺血動物模型的制備： 采用改良的Plsinelli方法2。 用20%烏拉坦(1g/ kg)腹腔麻醉后， 將大鼠固定在手術臺上， 作頭背部正中切口， 分離肌肉， 暴露第一頸 椎翼小孔， 分離小孔周圍組織， 用尖端約0.5mm直徑的電針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動脈。 在手術顯微鏡下觀察并證實椎動脈已燒斷后， 迅速翻轉(zhuǎn)大鼠， 作頸前正中切口， 分離雙 側(cè)頸總動脈(CCA)， 用1號絲線結扎雙側(cè)CCA， 造成全腦缺血模型。 缺血時間從雙側(cè)CCA關 閉的瞬間開始計算。 假手術組分離出翼小孔和CCA， 不行燒

7、灼和結扎。3. 腦組織NOS活性測定： NOS放射免疫測定試劑由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所藥理室 提供。 參照Bredt等方法3，4， 所有操作均在04下進行。 稱取凍存腦組織 ， 按15(w/v)比例加入預冷的50mM Hepes pH7.4(內(nèi)含0.32M蔗糖， 1mM EDTA, 0.1 mM E GTA, 1mM PMSF, 1mM MDTT, 1M Leupetin, 2M Pepstatin)， 在冰浴中用玻璃勻漿器勻 漿， 離心(4, 20000g) 60min , 上清即為NOS提取液， 取50l NOS提取液， 加入50l 反應Buffer, ， 使其終濃度為50mM he

8、pes pH7.4， 內(nèi)含有0.1mM NADPH, 30M BH4，10 nM CaM, 1.25mM Cacl2, 1mM EGTA, 0.2Ci 3H-精氨酸， 反應管中加入1mM L-nit ro-Arg 作為本底。 于37水溶中反應15min， 用2ml預冷的Buffer C(20M Hepes, PH5. 5, 內(nèi)含2mM EDTA, 0.2mM EGTA, 1mM L-Cit)終止反應。 再經(jīng)0.50.7ml Dowex 50WX8(Na +型)陽離子交換樹脂層析柱分離反應液中的3H-流出液和2ml的蒸餾水洗脫液。 將收集的 樣品混勻后取出1ml于閃爍杯中， 加入甲苯-Trito

9、n X-100閃爍液7ml。 在液體閃爍計數(shù)儀( Beckman L-9800型)上測定樣品中的放射性活性。 由此計算3H-胍氨酸的生成量。 結合蛋 白質(zhì)濃度計算NOS的比活性。4. NO2的測定： 參照Ohta等的方法5。 稱取凍存腦組織， 加入3ml預冷的1 00mmol/L磷酸鉀緩沖液中(含1mmol/L EDTA pH7.5)， 制成勻漿， 離心(4、 4000rpm/mi n) 10min。 取上清液2ml， 加入0.04% 4-羥香豆素(用二甲基甲酰胺與2N鹽酸11混合配制 )1ml， 0放置5min。 再加入8%硫代硫酸鈉100ul， 室溫放置5min。 加入1.5mol/L的N

10、aOH 1ml， 置室溫10min。 用日立F-4000型熒光分光光度計測定樣品的熒光強度。 以NaNO2 作標準曲線， 結合蛋白質(zhì)濃度計算NO2的含量。5. 組織蛋白質(zhì)測定： 采用Bradford法6。6. 統(tǒng)計學處理： 實驗結果以XS表示， 組間差別的顯著性用t檢驗。結果1. SHR腦缺血后腦區(qū)NOS活性的變化(表1)。表1SHR腦缺血后不同腦區(qū)NOS活性的變化(Pmol/mg蛋白/min)組別大腦皮質(zhì)海馬紋狀體小腦假手術組64.0011.9154.209.8877.777.83154.3219.86腦缺血組442.4430.01*134.1613.41*247.0618.04*1039.

11、0682.10*注： 與假手術組相比*P0.01*P0.05從表1可見， SHR腦缺血后大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體和小腦組織中NOS活性明顯高于假手術組(P0.01)。2. SHR腦缺血后腦區(qū)NO2含量的變化(表2)。表2SHR腦缺血后不同腦區(qū)NO2含量的變化(pmol/mg蛋白)組別大腦皮質(zhì)海馬紋狀體小腦假手術組48.136.7844.126.49104.6411.36150.0512.12腦缺血組102.0214.21*112.2914.25*124.8116.79* 196.4910.16*注： 與假手術組相比*P0.01， *P0.05從表2可見， SHR腦缺血大腦皮質(zhì)、海馬、 紋狀體和小

12、腦組織中N O2的含量明顯高于假手術組(P0.01或P0.05)。討論近年來的研究證實了NO作為一種新的遞質(zhì)分子， 具有舒張血管、 抑制血管平滑肌增殖以 及血小板粘附等重要的生理作用， 參與機體很多生理活動和病理過程， 在腦缺血的發(fā)病中 起重要作用。 由于NO的半衰期短， 僅幾秒鐘， 使得直接檢測組織NO的含量有一定困難。 但是通過檢測生成NO的關鍵酶NOS和NO的代謝產(chǎn)物NO2， 可間接反映組織中NO的含量變化 。本實驗通過對SHR腦缺血后不同腦區(qū)NOS和NO2檢測的結果顯示大鼠腦缺血10 min腦組織N OS和NO2的含量明顯增加， 這一結果與文獻報道一致7。 腦缺血后早期NO生成 增加可

13、能是由于缺血組織中谷氨酸等興奮性氨基酸的含量增加， 作用于N-甲基-D-天門 冬氨酸受體， 引起細胞內(nèi)鈣增加， 當細胞內(nèi)鈣達到一定濃度時便可激活NOS1； 同時， 腦缺血組織細胞分泌細胞因子如白細胞介素-1和腫瘤壞死因子等增加， 也可刺激 NOS8； 另外， 腦缺血時， 由于ATP減少， NOS發(fā)生去磷酸化作用， 也可使NOS 活性增加9。 由于NOS活性增加， 導致NO生成增加， 經(jīng)過氧化作用， 使得組織 中NO2的含量也相應增加。 已知一定量的NO具有神經(jīng)遞質(zhì)或信使的作用， 但過量NO的生 成就有可能通過氧化生成有毒性作用的氧自由基， 使細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用， 使DNA 受 到破壞，

14、最終導致神經(jīng)細胞壞死。 本實驗的結果提示了NO參與SHR腦缺血的發(fā)病過程， 開 發(fā)和選擇特異性NO生成抑制劑可能有助于腦缺血的治療。作者單位：吳秀麗(350005福建醫(yī)科大學附一醫(yī)院，福建省神經(jīng)病學研究所)張洪(350005福建醫(yī)科大學附一醫(yī)院，福建省神經(jīng)病學研究所)許國英(350005福建醫(yī)科大學附一醫(yī)院，福建省神經(jīng)病學研究所)慕容慎行(350005福建醫(yī)科大學附一醫(yī)院，福建省神經(jīng)病學研究所)劉友堯(福建醫(yī)科大學生化教研室)參考文獻1，Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide : physiology, pathophysiology and

15、 pharmacology. Pharmacol Rev, 1991； 4310914 2.2，Pulsinelli WA, Brierley JB A new model of bilateral h emispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 1979；10267272.3，Bredt DS, Snyder SH. Isolation of nitric oxide synthet ase,a calmodulin requiring enzyme Proc Natl Acad Sci USA, 1990； 87682685

16、.4，Mayer B, John M, Bohme E. Purification of a Ca2+ Cal modulin-dependent nitric oxide synthase from portine cerebellum; cofactor role o f tetrahydrobiopterin. FEBS Lett. 1990；227215219.5，Ohta T , Arai Y, Takitani S. Flurometric determinatio n of nitrite with 4-hydroxycoumarin. Anal Chem. 1986, 5831

17、323135.6，Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quan t itation of microgram quitities of protein utilizing the principle of protein-dy e-binding. Anal Bilchem. 1976, 72248250.7，Kader A, Frazzini VI, Solomn RA, et al.Nitric oxide pr oduction during focal cerebral ischemia in rats. Stroke,1993；2417091716.8，Wang X, Yue TL, Barone FC, et al. Concomitant cortical expression of TNF-alpha and IL-1 beta mRNAs follows early response gene expres sion in transient focal ischemia. Mol Chem Neuro Pathol,1994；23103114.9，Bredt