魚用口服疫苗免疫佐劑研究進(jìn)展.docx

1、南方農(nóng)業(yè)學(xué)報JOURNALOFSOUTHERNAGRICULTURE2012,43(6):869-872ISSN2095-1191;CODENNNXAABDOI：10.3969/j：issn.2095-l191.2012.06.869魚用口服疫苗免疫佐劑研究進(jìn)展黃鈞】,施金谷巳陳明2,黃艷華I,溫華成：彭民毅)王瑞2,梁萬文2(】廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣西水生動物疾病診斷實(shí)臉室，南寧530005；2廣西水產(chǎn)研究所/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530021)摘要:免疫佐劑是一種先于或與抗原同時使用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力及相應(yīng)抗原的免疫原性，但其本身不具備抗原特性的物質(zhì)

2、。文章對魚用口服疫苗免疫佐劑的作用機(jī)理以及霍亂毒素(CT)、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)、細(xì)胞因子等兒種主要魚用口服疫苗免疫佐劑的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)魚用口服疫苗免疫佐劑的研究應(yīng)用過程中仍存在作用機(jī)理研究相對滯后、忽略腸道黏膜免疫機(jī)理特殊性、使用成本過高、安全性等問題,建議今后加強(qiáng)對魚類腸道黏膜免疫機(jī)理以及口服疫苗免疫佐劑作用機(jī)理的研究,優(yōu)化曰服疫苗免疫佐劑的免疫劑星和程序，降低生產(chǎn)成本,研發(fā)出更為廣泛、廉價的口服疫苗免疫佐劑,提高其安全性等,以促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。關(guān)鍵詞：魚用口服疫苗；免疫佐劑；霍亂毒素；大腸桿菌不耐熱腸毒素；細(xì)胞因子；應(yīng)用現(xiàn)狀中圖分類號：S948文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編

3、號:2095-1191(2012)06-0869-04AdvanceinoralvaccineimmuneadjuvantforfishHUANGJunSHIJin-gufCHENMing2,HUANGYan-hua',WENHua-cheng1,PENGMin-yi1,WANGRui2,LIANGWan-wen2CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity/GuangxiAquaticAnimalDiseaseDiagnoseIxib,Nanning530005,China;2GuangxiResearchInstitut

4、eofFisheries/GuangxiKeyLaboratoryofAquaticGeneticBreedingandHealthyAquaculture,Nanning530021,China)Abstract:Thoughadjuvantitselfdoesnotpossessantigencharacteristics,whenitisusedbeforeortogetherwithantigen,itcanfortifynon-specificimmunityabilityandimmunogenicitytotheantigen.Mechanismoforalvaccineimmu

5、neadjuvantforfishesandthecurrentapplicationstatusofmajoradjuvantsincludingcholeratoxin(CT),heat-labileenterotoxin(LT)andcytokinewerereviewedinthepaper.Severalproblemswerefoundsuchaslaggedmechanismresearch,ignorancetoparticularityofintestinalmucosalimmunity,highcost,andsafely,etc.Tostimulatesounddeve

6、lopmentofaquacultureindustry,aslewofmeasuresshouldbeadoptedincludingsustainingresearchesonmechanismofintestinalmucosalimmunityandoralvaccineimmuneadjuvant,optimizationofimmunizingdoseandprocedureoforalvaccineimmuneadjuvant,decreasingdevelopmentandresearchcost,developingcheaperandsaferoralvaccineimmu

7、neadjuvant,soenhancingitssafetytopromotehealthdevelopmentofaquacultureindustry.Keywords：oralvaccineforfish；adjuvant;choleratoxin(CT)；heat-labileenterotoxin(LT)；cytokine；applicationstatus收稿日期：2012-03-21基金項(xiàng)目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項(xiàng)目(桂科攻1123006-4)作者簡介:黃鈞(1957-)，副教授,主要從事水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖及病害防控技術(shù)的教學(xué)與研究工作,E-mail：hi135l0引言近幾

8、十年來,隨著國內(nèi)外學(xué)者對魚類腸道免疫機(jī)理的研究不斷深入,魚用口服疫苗的研制取得長足發(fā)展,與之密切相關(guān)的魚用口服疫苗免疫佐劑也越來越受到重視。免疫佐劑是一種先于或與抗原同時使用,能夠增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力及相應(yīng)抗原的免疫原性，但其本身不具備抗原特性的物質(zhì)。常見的免疫佐劑有鋁鹽佐劑、弗氏佐劑等，這些佐劑通常是作為注射型免疫佐劑，既能保護(hù)抗原，又能夠增強(qiáng)機(jī)體對抗原的吸收，增強(qiáng)免疫效果(Dotsikaetal.,1997；陳明等,2010)o目前，人們已研制出多種口服疫苗免疫佐劑。Merino-Contreras等(2001)以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(CTB)作為佐劑對斑帶副魴進(jìn)行口服免疫，

9、結(jié)果發(fā)現(xiàn)以CTB作為佐劑組的抗體效價水平最高,其免疫保護(hù)率高達(dá)70%,并能防止由維氏氣單胞菌所引起的組織損傷。常青等(2006)通過在飼料中添加殼聚糖投喂花魴30d,其機(jī)體的補(bǔ)體活性、溶菌酶活性及吞噬活性顯著增強(qiáng)。此外,脂質(zhì)體、海藻酸鈉、霍亂毒素(CT)、細(xì)胞因子等均被動物試驗(yàn)證明其能夠有效地引起免疫反應(yīng)。1魚類口服疫苗免疫佐劑作用機(jī)理免疫佐劑不僅可以改變免疫球蛋白的種類，還可以改變免疫反應(yīng)強(qiáng)度、增強(qiáng)免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫、消除機(jī)體產(chǎn)生的免疫耐受、減少機(jī)體免疫副反應(yīng)等(Anderson,1992)。目前，關(guān)于魚類口服疫苗免疫佐劑的研究主要集中在是否具備佐劑效應(yīng),而其機(jī)理研究尚處于推測

10、階段，有關(guān)免疫佐劑在機(jī)體內(nèi)與免疫細(xì)胞、免疫分子間相互作用以及對于信號通路等均有待進(jìn)一步探索?，F(xiàn)有的免疫佐劑作用機(jī)理研究主要集中在人類和小鼠,這些研究成果對魚類口服疫苗免疫佐劑研究具有重要的指導(dǎo)意義。一般來說，佐劑免疫機(jī)理包括4個方面:(1)起免疫調(diào)節(jié)作用，主要是對體內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，通過細(xì)胞因子的升高或降低來介導(dǎo)免疫反應(yīng)(O*Haganetal.,2001),表現(xiàn)為由輔助性T細(xì)胞(Th)中Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫、Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫。(2)起抗原呈遞作用，口服疫苗免疫佐劑能夠保持抗原構(gòu)象的完整性，并增強(qiáng)抗原的呈遞作用,使抗體能夠更好識別抗原而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。如左旋咪哇能夠抑制可溶性免

11、疫抑制因子，降低其氧化率，從而增強(qiáng)抗原的呈遞作用(Allison,1998)0(3)起靶向性作用，如脂質(zhì)體等經(jīng)H服后,能釋放抗原或被抗原呈遞細(xì)胞(APC)吞噬后釋放其包裹的抗原;海藻酸鈉微囊等微球佐劑則能通過APCs靶向巨噬細(xì)胞，促進(jìn)抗原加工(Langeretal.,1997)。(4)誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答,而具有儲存功能(孫紅祥和潘杭君,2005)。2幾種主要魚用口服疫苗免疫佐劑2.1霍亂毒素(CT)CT是由霍亂弧菌產(chǎn)生的一種腸毒素，由一個A亞單位和5個B亞單位連接形成的AB5結(jié)構(gòu)。CTA是一個毒性亞單位，除了具有與CTB連接的功能外，還具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酮活性，能夠

12、通過活化G蛋白引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苜(cAMP)濃度升高，從而導(dǎo)致腹瀉。CTB是無毒的受體結(jié)合亞單位，能夠與細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)昔脂受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)型改變，將CTA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)。CT和CTB都是一種較強(qiáng)的免疫佐劑,但由于CT具有腸毒性，限制了其作為佐劑的可能性。CTB與抗原同時免疫動物時,能夠極大增強(qiáng)免疫動物對抗原的特異性免疫應(yīng)答。同時,CTB還是一種良好的弱免疫原和蛋白半抗原的載體,能夠增加弱免疫原的免疫原性，使蛋白半抗原獲得免疫原性。目前，關(guān)于CTB的研究主要集中在小鼠。Derzbaugh等(1990)經(jīng)口服途徑給小鼠免疫300-600昭CTB和鏈球菌糖基化轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白后，檢測其

13、血清抗體水平,結(jié)果顯示，該融合蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平達(dá)200400倍。Merino-Contreras等(2001)提取維氏氣單胞菌的胞外凝集素(MCBP)后，以CTB作為佐劑對斑帶副魴進(jìn)行口服免疫，同時設(shè)計MCBP組和MCBP微囊組，結(jié)果表明，以CTB作為佐劑組的抗體效價水平最高，其免疫保護(hù)率高達(dá)70%,且能防止由維氏氣單胞菌所引起的組織損傷。Isaka等(2004)研究發(fā)現(xiàn),將重組rCTB和牛血清蛋白(BSA)混合后經(jīng)口服途徑免疫小鼠,能夠在小鼠腸道產(chǎn)生中度水平的BSA特異性IgA應(yīng)答，且能引起高水平的血清IgG應(yīng)答;單純服用BSA組則無特異性免疫產(chǎn)生。2.2大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)

14、LT是由大腸桿菌毒性株產(chǎn)生的一種腸毒素,與CT相似，也是由一個毒性A亞單位和非毒性五聚體B亞單位以非共價鍵連接而成的AB晶構(gòu)。LTA具有ADP核糖基化活性，能夠使腸道上皮細(xì)胞合成cAMP并分泌大量的腸液和電解質(zhì)，引起腹瀉。由于LTA具有毒性，因而限制了LTA作為免疫佐劑的應(yīng)用前景。LTB能夠識別細(xì)胞表面的單唾液酸四己糖(GM1)神經(jīng)節(jié)甘脂以及其他受體,而常被作為抗原載體，與抗原聯(lián)合使用，加強(qiáng)機(jī)體對抗原的攝取，增加其免疫應(yīng)答能力(陳明等,2010)o同時,B亞單位與GM1結(jié)合是LT發(fā)揮免疫原性的基礎(chǔ)。LT及LTB在動物中的研究應(yīng)用較常見。張茂林等(2004)將狂犬病毒減毒疫苗與LT混合后，分別通

15、過灌胃、灌腸、口腔滴入的免疫途徑對小鼠進(jìn)行免疫,經(jīng)檢測免疫小鼠的IgGJgA及免疫保護(hù)率等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)腸道免疫組的免疫應(yīng)答水平明顯高于口腔滴入和灌胃接種的免疫水平。Companjen等(2006)研制出成日和一種病毒肽融合蛋白轉(zhuǎn)基因土豆,經(jīng)肛門免疫途徑免疫鯉魚,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,試驗(yàn)組的血清效價顯著提高，但由于試驗(yàn)動物過少,LTB作為水產(chǎn)口服疫苗免疫佐劑仍有待進(jìn)一步研究探討。Wang等(2012)將狂犬病毒糖蛋白(RV-G)基因片段和LTB基因片段融合后插入pVAXl真核質(zhì)粒，并將該重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到減毒沙門氏菌中形成pVAXl-G-LTB重組株,用該重組株口服途徑免疫小鼠，狂犬病毒I

16、gG抗體檢測結(jié)果顯示，重組株誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體水平明顯高于對照組;而動物保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，重組株的保護(hù)率達(dá)50%?？梢姡琇TB能有效誘導(dǎo)機(jī)體激發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫。2.3細(xì)胞因子細(xì)胞因子是一類可溶性的小分子蛋白質(zhì)或多肽,能夠作用于細(xì)胞膜表面受體，促使免疫細(xì)胞增殖分化,從而加強(qiáng)免疫細(xì)胞活性或深入影響細(xì)胞內(nèi)生物活性物質(zhì)的表達(dá)和分泌。近年來，隨著細(xì)胞因子深入研究，已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子具有免疫佐劑效應(yīng)，如包細(xì)胞介素(1L)、腫瘤壞死因子(INF)、淋巴因子(1L-2)、細(xì)胞干擾素(a罰干擾素)等oJimenez等(2006)將虹含尊病毒性出血敗血癥病毒G蛋白DNA疫苗與1L-8共同免疫虹芻尊，發(fā)現(xiàn)其

17、能夠促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,增強(qiáng)機(jī)體免疫力。Diaz-Rosales(2009)對IL-2進(jìn)行克隆表達(dá)及生物活性分析，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌重組兒-2能夠刺激轉(zhuǎn)錄因子STAT5和Blimp-1分泌，由于STAT5和Blimp-1是一類能夠誘導(dǎo)成熟B淋巴細(xì)胞發(fā)育為漿細(xì)胞的蛋白，因而推測IL-2可作為一種免疫輔助手段來增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)。雖然目前細(xì)胞因子在水產(chǎn)上的研究應(yīng)用相對較少，但其作為口服疫苗佐劑特別是DNA口服疫苗免疫佐劑將成為一個新的研究熱點(diǎn)。2.4其他口服疫苗免疫佐劑除了CT、LT和細(xì)胞因子3種免疫佐劑外，還包括有化學(xué)藥物、海藻酸鈉、殼聚糖、脂多糖等。Lavelle和Harris(1997)將

18、甲氤米肌、碳酸氧鈉和疫苗同時拌入飼料后投喂虹統(tǒng)，1h后檢測發(fā)現(xiàn)其胃腸道pH升至7.24；取不同時間的腸道粘液和血液進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),發(fā)現(xiàn)抗原的完整性和大分子片段與對照組相比均有明顯提高。McLean等(1999)在魚的腺激素(HGG)中添加氫氧化鋁或CTB,發(fā)現(xiàn)其不僅能增加機(jī)體對HGG的吸收，還能增強(qiáng)抗原抗體間的相互作用。Vervarckea等(2004)研究發(fā)現(xiàn),在海藻酸鈉微囊中加入維生素E、水楊酸鈉、水溶性維生素E(TPGS)等，均能提高腸道及血液對抗原的吸收量，同時檢測到皮膚粘液中的抗體水平高于空白對照組。常青等(2006)通過在飼料中添加殼聚糖投喂花魴30d,發(fā)

19、現(xiàn)機(jī)體的補(bǔ)體活性、溶菌酶活性和吞噬活性顯著增強(qiáng)。鄭克孝等(2008)將海藻酸鈉制成球形凝膠顆粒，通過細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉對刺激樹突狀細(xì)胞的成熟具有與腫瘤壞死因子細(xì)菌脂多糖相當(dāng)?shù)淖饔谩?展望目前,有關(guān)口服疫苗免疫佐劑的研究主要集中在獸用，魚用口服疫苗免疫佐劑的研究資料卻很少。Jimenez等(2006)和常青等(2006)的研究結(jié)果為魚用口服疫苗免疫佐劑領(lǐng)域的研究提供了有益的參考。魚用口服疫苗免疫佐劑研究應(yīng)用遇到的障礙:首先是其作用機(jī)理研究相對滯后,雖然獸用疫苗免疫佐劑能夠給予一定的方向性指導(dǎo)，但魚類的免疫系統(tǒng)相對低級,且有其自身的特殊性，如極具發(fā)展前途的胞壁酰二肽(Muramyldipe

20、ptide,MDP)在魚類免疫過程中卻未表現(xiàn)出明顯的佐劑效應(yīng);其次，當(dāng)前對口服疫苗免疫佐劑的研發(fā)一般是以魚類注射免疫劑量和免疫程序作為參照，忽略了腸道黏膜免疫機(jī)理的特殊性，從而影響了口服免疫效果;再次,價格也是影響口服疫苗免疫佐劑推廣應(yīng)用發(fā)展的重要因素,如生產(chǎn)材料昂貴、制作繁瑣、使用劑量大、多次免疫均可導(dǎo)致免疫佐劑使用成本過高；此外，口服疫苗免疫佐劑本身的安全性及使用劑量也是制約其發(fā)展的關(guān)鍵因素。上述問題均是限制魚用口服疫苗免疫佐劑研發(fā)及其在魚病防治上大規(guī)模使用的重要因素。因此，加強(qiáng)對魚類腸道黏膜免疫機(jī)理以及口服疫苗免疫佐劑作用機(jī)理的研究,優(yōu)化口服疫苗免疫佐劑的免疫劑量和程序，降低生產(chǎn)成本，研

21、發(fā)出更為廣泛、廉價的口服疫苗免疫佐劑，提高其安全性等將是今后魚用口服疫苗免疫佐劑的研究重點(diǎn)。隨著魚用口服疫苗免疫佐劑的進(jìn)一步研究利用,尤其是對其作用機(jī)理、免疫程序、免疫劑量等方面的深入研究,魚用口服疫苗免疫佐劑將成為增強(qiáng)魚類免疫水平、防治魚病的有效途徑，同時對保護(hù)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境、促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展均具有重要意義。參考文獻(xiàn)：常青,梁萌青，王家林,孫靜.2006.殼聚糖對花鯨生長和非特異性免疫力的影響J.海洋水產(chǎn)研究,27(5)：17-22.ChangQ,LiangMQ,WangJL,SunJ,2006.Influenceofchitosanonthegrowthandnon-specifici

22、mmunityofJapaneseseabass(Lateolabraxjaponicus)J"MarineFisheriesResearch,27(5):17-22.陳明，李超，王瑞，王秋華，黃婷，雷愛瑩，陳福艷，甘西，余曉麗,梁萬文.2010.大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位在畢赤酵母中的表達(dá)及鑒定J.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,23(6):2093-2097.ChenM,LiC,WangR,WangQHJIuangT,LeiAY,ChenVY,GanX,YuXL,LiangWW.2010.Expressionandidentificationofrecombinantheat-labileent

23、erotoxinsubunitBinPichiapastorisJSouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences,23(6)：2093-2097.孫紅祥，潘杭君.2005.免疫佐劑作用機(jī)理的研究進(jìn)展J.中國獸藥雜志,39(10)：22-27.SunHX,PanHJ.2005.AdvancesinmechanismsofimmunologicadjuvantsJChineseJournalofVeterinaryDrug,39(10)：22-27.張茂林，劉紅麗,余興龍，涂長春,扈榮良，鄒嘯環(huán),郭學(xué)軍，殷震.2004.大腸桿菌不耐熱腸毒素對狂犬病病毒減毒疫

24、苗株粘膜免疫效應(yīng)的增強(qiáng)作用J.中國獸醫(yī)學(xué)報,24(1)：39-42.ZhangML,UuHL,YuXL,TuCC,HuRL,ZouXH,GuoXJ,YinZ.2004.Enhancingeffectofheat-labiletoxinonmucosaimmunityofattenuatedrabiesvaccineJChineseJournalofVeterinaryScience,24(1)：39-42.鄭克孝，崔巍，沈秉謙，楊勝利.2008.具有佐劑效果的海藻酸鈣納米膠囊制備J.中國生物工程雜忐,28(1):49-54.ZhengKX,CuiW,ShenBQ,YangSL.2004.Pre

25、parationofcalciumalginatenanocapsuleswithadjuvanteffectlJChinaBiotechnology,28(1)：4954.AllisonAC.1998.Themodeofactionofimmunologicaladjuvantsi.J.DevelopmentsinBiologicalStandardization,92:3-11.AndersonDP.1992.Immunostimulants,adjuvants,andvaccinecarriersinfish:applicationstoaquacultureLJAnnualReview

26、ofFishDiseases,2：281-307.CompanjenAR,FlorackDE,SlootwegT,BorstJW,RomboutJH.2006.Improveduptakeofplant-derivedLTB-linkedproteinsincarpgutandinductionofspecifichumoralimmuneresponsesuponinfeeddeliveryJj.Fish&ShellfishImmunology,21(3):251-260.DerzbaughMT,PetersonDL,MacrinaFL.1990.CholeratoxinB-subu

27、nitgenefusion:structuralandfunctionalanalysisofthechimericproteinJ.InfectionandImmunity,58(1)：70-79.DiazRosalesP,BirdS,WangTH,FujikiK,DavidsonWS,ZouJ,SecombesCJ.2009.Rainbowtroutinterleukin-2：Cloning,expressionandbioactivityanalysis，.Fish&ShellfishImmunology,27(3):414-422.DotsikaE,KaragouniE,Sun

28、dquistB,MoreinB,MorganA,Vil-lacres-ErikssonM.1997.InfluenceofQuillajasaponariatriterpenoidcontentontheimmunomodulatorycapacityofEpstein-BarrvirusISCOMsJScandinavianJournalofImmunology,45(3):261-268.IsakaM,KorniyaT,TakahashiM,YasudaY,TaniguchiT,ZhaoY,MatanoK,MatsuiH,MaeyamaJ,MorokumaK,0hkumaK,GotoN,T

29、ochikuboK.2004.RecombinantcholeratoxinBsubunit(rCTB)asamucosaladjuvantenhancesindue-tionofdiphtheriaandtetanusantitoxinantibodiesinmicebyintranasaladministrationwithdiphtheria-pertussis-tetanus(DPT)combinationvaccinefJ.Vaccine,22(23-24):3061-3068.JimenezN,CollJ,SalgueroFJ,TafallaC.2006.Co-injectiono

30、finterleukin8withtheglycoproteingenefromviralhaemorrhagicsepticemiavirus(VHSV)modulatesthecytokineresponseinrainbowtrout(Oncorhynchusmykiss)fj.Vaccine,24(27-28):5615-5626.LangerR,ClelandJL,HanesJ.1997.Newadvancesinmicro-sphere-basedsingle-dosevaccinesJAdvancedDrugDeliveryReviews,28(1)：97-l19.LavelleEC,HarrisJE.1997.Theprocessingofanorallyadministeredproteinantigeninthedigestivetractofrainbowtrout,OncorhynchusComparativeBiochemistryandPhysiologyPartA:Physiology,117(2):263-275.McLeanE,RonsholdtB,StenC,Najamuddin.1999.Gastroint