高效液相色譜-熒光檢測(cè)流速梯度法測(cè)定去卵巢小鼠腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì).docx

1、2005年1月January2005色譜ChineseJournalofChromatographyVol.23No.17678高效液相色譜熒光檢測(cè)流速梯度法測(cè)定去卵巢小鼠腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)張雷，盧英俊，鄧同樂(lè)，鄭筱祥(浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，浙江杭州310027)播要：建立了同時(shí)檢測(cè)去卵巢(OVX)小鼠腦內(nèi)的去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羥色胺(5-HT)3種神經(jīng)遞質(zhì)的高效液相色譜方法。采用的色譜條件為：G,柱分離.熒光檢測(cè)器檢測(cè)，流動(dòng)相為0.1mol/L的KH2PO4緩沖液-甲醇(體積比為9：1),設(shè)置單泵流速梯度洗脫。方法的檢測(cè)限(S/N=3)均在10nmol/L以下，絕對(duì)回收

2、率均在80%以上，樣品日內(nèi)測(cè)定蜂面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.03%以下。該方法具有檢測(cè)靈敏度高、樣品制備簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn).對(duì)小鼠腦內(nèi)的3種單肢類(lèi)遞質(zhì)的檢測(cè)具有實(shí)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：高效液相色譜；流速梯度；去甲腎上腺素；多巴胺;5-羥色胺；去卵巢小鼠中圖分類(lèi)號(hào)：O658文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-8713(2005)01-0076-03MeasurementofMonoamineTransmittersintheBrainsofOvariectomizedMiceUsingHighPerformanceLiquidChromatographywithFluorescenceDetectionandGra

3、dientFlowRateElutionZHANGLei,LUYingjun,DENGTongle,ZHENGXiaoxiang(DepartmentofBiomedicalEngineeringofZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)Abstract:Amethodforthedeterminationofnorepinephrine(NE),dopamine(DA)and5-hydroxytryptamine(5-HT)inbrainsofovariectomizedmicewasestablishedbyusinghighperformance

4、liquidchromatographwithafluorescencedetector,aC18columnandagradientflowratedeliveredbyasinglepump.Themobilephasewasamixtureof0.1mol/LKH2PO4andCHjOH(9/1,v/v).Detectionlimitsofthemethodweredeterminedtobelowerthan10nmol/L,absoluterecoverieswereabove80%andtherelativestandarddeviations(RSDs)ofintra-daywe

5、reallwithin3.03%.Themethodhastheadvantagesofhighsensitivityandofsimplesamplepreparation.Shortanalysistimeandbetterseparationofsampleswerealsoobtained.Keywords:highperformanceliquidchromatography；gradientflowrate；norepinephrine；dopamine；5-hydroxytryptamine；ovariectomizedmice單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與腦缺血、鎮(zhèn)痛、學(xué)習(xí)

6、記憶等多種生理過(guò)程.具有重要的生理意義。該類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)包括兒茶酚胺和呼噪胺等.前者主要指去甲腎上腺素TNE）和多巴胺（DA）,后者主要指5-羥色胺（5-HT）。國(guó)內(nèi)關(guān)于NE,DA和5-HT3種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)多采用高效液相色譜-電化學(xué)分析法（HPLC-ECD）CS，但由于ECD對(duì)流動(dòng)相變化較為敏感，故較少采用梯度洗脫。梯度洗脫中以流動(dòng)相的濃度變化最為常見(jiàn)，而以流動(dòng)相的流速梯度的應(yīng)用在文獻(xiàn)中少有報(bào)道。本文采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法，嘗試設(shè)置單泵流速梯度洗脫，同時(shí)檢測(cè)了NE,DA和5-HT,樣品的洗脫時(shí)間得到明顯縮短。1材料和方法1.1儀器和試劑島津LC-10Atvp系列：RF-10AXL熒光檢測(cè)器

7、，LC-10Atvp高壓泵，Rheodyne7725進(jìn)樣閥。Heraeus公司Labofuge400R冷凍離心機(jī)。DA,5-HT,NE和磷酸二氫鉀（KH2PO4）均為Sigma公司收稿日期：2004-02-04作者簡(jiǎn)介：張雷.男，碩士研究生，E-mail：zl78213.通訊聯(lián)系人：鄭筱洋.女.教授.博士生導(dǎo)主要從事系統(tǒng)與定量生理學(xué)研究,E-mail；z6>.第1期張雷等：高效液相色譜法-熒光檢測(cè)流速梯度法測(cè)定去卵巢小鼠腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)77產(chǎn)品；甲醇為國(guó)產(chǎn)HPLC色譜純，高氯酸和鹽酸為國(guó)產(chǎn)分析純。12標(biāo)準(zhǔn)品和腦勻漿樣品的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品NE4.23mg,DA47.40mg,5-HT5

8、3.18mg,分別溶于0.1mol/LHC1中，并定容于25mL容量瓶，制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（NE5mmol/L,DA10mmol/L,5-HT10mmol/L）o再按需要用0.1mol/LHC1稀釋成各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。腦勻漿樣品的制備：小鼠直接斷頭，在冰臺(tái)上剝離出小鼠全腦（保留大腦及間腦），稱(chēng)重。按0.1g腦（濕重）加入1mL5%高氯酸的比例加入高氯酸，放入玻璃勻漿管內(nèi)，冰浴下勻漿。將勻漿液收集于1.5mL離心管中，于13000r/min下低溫離心20min,取上清液進(jìn)樣檢測(cè)。13色譜條件Shim-pack柱，6.0mmi.d.x150mm,5m；流動(dòng)相：0.1mol/L的KH2PO4緩沖液-甲

9、醇（體積比為9：l）o單泵流速線性梯度程序：0.510min2.5minmL/min1mL/min1.5mL/min（保持18min）*0.5mL/min；進(jìn)樣環(huán)體積為20|xL；柱溫為室溫；熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)為254nm,發(fā)射波長(zhǎng)為338nm02實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1線性范圍和檢測(cè)限采用外標(biāo)法，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積丫為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣濃度X（”nol/L）為橫坐標(biāo)作圖，計(jì)算出線性回歸方程（如表1）。以S/N=3汁得到方法的最低檢測(cè)限分別為：NE5nmol/L,DA10nmol/L,5-HT5nmol/Lo衰1NE.DA和5-HT的城性回歸方程Table1Regressionequati

10、onsofNE,DAand5-HTy：Peakarea；X：concentrationofsample,“mol/L.CompoundLinearrange/(|imol/L)Regressionequation*rNE0.05-20Y=547740X+4302.80.9999DA0.10-25Y=379769X0.98915-HTO.OO5-I.2F=8x!06X0.99972.2色譜分離和保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)液和腦勻漿樣品中的NE,DA和5-HT的峰之間分離較好（樣品中NE與雜質(zhì)峰的分離尚有待改善），保留時(shí)間分別在5,7和12min左右。腦勻漿中的各種雜質(zhì)峰均在20min內(nèi)洗脫完畢，且雜質(zhì)峰對(duì)結(jié)果

11、無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1和圖2（由于生物樣品的日間變異因素，個(gè)別物質(zhì)在不同樣品中的保留時(shí)間稍有出入）。圖13種神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的色譜圖Fig.1Chromatogramofthemixtureofthreestandards圖2腦勾漿樣品色謂圖Fig.2Chromatogramofabrainsampleofovariectomizedmice2.3回收率的測(cè)定將混合標(biāo)準(zhǔn)液定量地加入5份未處理過(guò)的腦勻漿樣品中，進(jìn)樣后測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。衰2NE,DA和5-HT的回收率測(cè)定（n=5）2.4方法的精密度Table2DeterminationofrecoveryofNE,DAand5-HT(n-5)Comp

12、oundAdded/(p.mol/L)Found/(p.mol/L)Recovery(5±SD)/%NE0.54390.464885.45±2.431.08780.922584.80±1.811.63171.417286.85t1.33DA0.33240.318695.86±3.660.66480.642996.71±1.420.99720.967997.06±0.895-HT0.25320.213784.38t1.790.50640.424183.74i1.370.75960.643284.68±2.27連續(xù)測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)液

13、6次，NE,DA和5-HT的峰面積日內(nèi)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.83%,1.18%和3.03%。2.5樣品測(cè)定應(yīng)用所建立的方法對(duì)雙側(cè)去卵巢（OVX）一個(gè)月后的小鼠腦內(nèi)的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并-78-第23卷與對(duì)照組進(jìn)行比較（結(jié)果見(jiàn)表3）,發(fā)現(xiàn)小鼠在去卵巢一個(gè)月后，由于體內(nèi)雌激素水平下降，腦內(nèi)DA的含量比對(duì)照組顯著性升高（P<0.01）,而NE和5-HT的含量變化卻沒(méi)有顯著差異。衰3去卵M(OVX)小M腦內(nèi)NE,DA和S-HT水平的變化Table3ChangeofthelevelsofNE,DAand5-HTinthebrainsofovarlelomized(OVX)miceg/g

14、CompoundOVX(x±SD)Control(x±SD)(n=8)(n=11)NE3.84±0.443.97±0.54DA2.35±0.56,1.7110.255-HT0.6110.100.62±0.10Note：P<0.01vscontrol.3討論據(jù)研究，許多疾病的發(fā)生和體內(nèi)的雌激素水平有密切關(guān)系，如阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森氏?。≒D）等，其中的機(jī)制之一就是影響了中樞單胺能神經(jīng)特別是多巴胺（DA）系統(tǒng)的功能'。本實(shí)驗(yàn)采用島津Cm柱，用熒光檢測(cè)器測(cè)定了小鼠雙側(cè)去卵巢后腦內(nèi)單胺能神經(jīng)遞質(zhì)的變化。由于NE和DA出峰

15、較早,5-HT的出峰時(shí)間較為拖后，故采用梯度洗脫；又由于NE在流動(dòng)相流速較高時(shí)不易與雜質(zhì)峰分離，故在設(shè)置單泵流速梯度時(shí)，開(kāi)始階段調(diào)低流動(dòng)相流速，使NE充分分離，而后提高流動(dòng)相流速，使5-HT較快出峰，并使更多的雜質(zhì)較快洗脫。.本方法不僅靈敏度高，特異性強(qiáng)，而且使整個(gè)樣品的洗脫時(shí)間較短，可用于血液、體液等生物樣品中NE,DA和5-HT的測(cè)定。參考文獻(xiàn)：1XuShaofen.Neurobiology.2nded.Shanghai:ShanghaiMedicalUniversityPress(許紹芬.神經(jīng)生物學(xué).第2版.上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社)1999.119(2：TangAiguo.WuHong

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