酶工程實驗指導(dǎo)

1、.廣東省高教廳重點實驗室現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室教材酶工程實驗技術(shù)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省教育廳現(xiàn)代生物技術(shù)重點實驗室酶工程分室2007 年 11 月.編者的話華南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)實驗室酶工程分室是由廣東省高教廳和華農(nóng)大投資建設(shè)的教學(xué)提高型實驗室， 面向石牌地區(qū)六所高校的高年級本科生及碩士、博士研究生開設(shè) 酶工程實驗技術(shù) 課程。該課程以實驗為主， 為保證學(xué)生在修讀本課程時有較好的理論基礎(chǔ)，要求所有學(xué)生預(yù)修 “酶工程與蛋白質(zhì)工程 ”。本課程實驗內(nèi)容分酶源的獲取、酶制劑分離純化及分析鑒定、酶制劑的體外改造、酶制劑的應(yīng)用和酶基因的重組表達五大部分 ， 具體如下：內(nèi)容實驗序號實驗項目名稱I、酶源的獲取1， 5

2、產(chǎn)淀粉酶菌株的快速篩選、木瓜蛋白酶制劑的制備2雞蛋清溶菌酶的磁性親和分離II 、酶制劑的分3純化雞蛋清溶菌酶的純度分析離純化及鑒定4純化雞蛋清溶菌酶的熱穩(wěn)定性分析分析5木瓜蛋白酶制劑的制備III 、酶制劑的體6殼聚糖凝膠顆粒固定化木瓜蛋白酶外改造*實驗 8中過氧化物酶在濾紙上固定化的部分亦屬此部分內(nèi)容。IV、酶制劑的應(yīng)7酶反應(yīng)器設(shè)計及酪蛋白水解物的制備用8消毒液中過氧化氫濃度的酶試紙法測定V 酶基因的重組9鄰苯二酚雙加氧酶基因在大腸桿菌中的高效重組表達表達VI 實驗總結(jié)及演實驗總結(jié)等。示等為滿足課程教學(xué)的需要，經(jīng)反復(fù)修改，特編寫了本實驗教材。本實驗指導(dǎo)的編寫由王煒軍，郭振飛，方穎、劉娥娥老師參

3、加編寫，在此一并表示感謝！本實驗指導(dǎo)為試用第五版，試用后我們將根據(jù)各校修課的情況作進一步修改，敬請兄弟院校的同行多提寶貴意見。.編者2006 年 11 月實驗一、產(chǎn)淀粉酶菌株的快速篩選一、目的學(xué)習(xí)和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和篩選方法。二、原理產(chǎn)淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周圍的培養(yǎng)基中，從而水解培養(yǎng)基中的淀粉，由于使用的是經(jīng)活性染料標記的帶顏色的淀粉（本實驗為 RBV-淀粉，呈鮮艷的紫紅色），當(dāng)其被淀粉酶作用后便形成可溶，且較易擴散的小分水解物，從而在該菌落周圍形成顏色較淺的透明圈。而透明圈直徑與菌落直徑之比則可反應(yīng)菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、簡單易行等優(yōu)點。圖1 產(chǎn)淀粉酶菌

4、落形成的透明圈三、材料、試劑和儀器1 、菌的來源取不同地點的表層土壤。2 、試劑：RBV-Starch （ Sigma ） , NaNO 3, K 2HPO4, MgSO 4 , KCl, 2 mol/L NaOH無菌水和瓊脂粉等。3 、器皿250mL 三角瓶兩個、9.0cm培養(yǎng)皿若干、涂布棒、200 L移液槍、200 L槍頭若干、牙簽若干、指形管若干、10mL 具塞刻度試管四支、滴管四支、取樣器和塑料直尺等。4 、儀器設(shè)備高壓消毒鍋、恒溫通氣式培養(yǎng)箱、搖床、離心機、電子天平等。四、實驗操作步驟.1 、器皿的消毒：培養(yǎng)皿、槍頭、牙簽、指形管、塞刻度試管、滴管四支等用四層報紙包好，在121下滅菌

5、20 min ，取出備用。2 、培養(yǎng)基的配制與滅菌培 養(yǎng)基 的組 成為 ： RBV- 淀 粉（ 1.2%, w/v ） ，NaNO 3(0.2%,w/v),K2HPO4 (0.2%, w/v),MgSO4 ·7H2 O （ 0.1%, w/v） , KCl(0.1%, w/v),瓊脂（ 2% , w/v） , 調(diào) PH 至 6.0 左右。在三角瓶中，121 滅菌20 min ，將滅菌后的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，每皿大約15mL ，靜置凝固備用。（倒平板之前務(wù)必將培養(yǎng)基搖晃均勻，以避免標記的RBV-淀粉在培養(yǎng)基中分布不均勻，影響菌落的觀察。）3 、土樣的采集及稀釋于校園等不同地點采集土壤樣品

6、；取樣時，用取樣器向下打取1cm 左右深度的土樣，將從各個地點取得的土樣混合；取樣點最好選擇有機質(zhì)豐富的地方。4 、富集稱取 5.0 g 混合土樣和 0.5 g 的淀粉混合，并加入適量的蒸餾水使其濕潤，置于培養(yǎng)皿中富集培養(yǎng) 24h 。5 、菌種的初篩稱取 1.0g 步驟 4 所得的土樣于滅菌具塞刻度試管中，在超凈工作臺內(nèi)（亦可使用酒精燈，直接在實驗臺上完成），加入無菌水至5mL ，振蕩后靜置，待土壤顆粒沉降后，取上層液1mL 轉(zhuǎn)移至另一刻度試管中， 加入 9mL 無菌水， 搖勻； 從第二支試管中取出1mL 轉(zhuǎn)移至第三支刻度試管，加入 9mL 無菌水，搖勻；再從第三支試管中取出1mL 轉(zhuǎn)移至第四

7、支刻度試管，加入9mL 無菌水，搖勻。如此重復(fù)即得到稀釋倍數(shù)分別10、 100 、 1000 倍的土壤稀釋液。用移液槍分別吸取稀釋100 和 1000 倍的樣品液50 L，加入至已凝固的培養(yǎng)基表面，用涂抹棒涂布均勻。將涂過樣的培養(yǎng)皿倒置放置，于30培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，觀察菌落透明圈的出現(xiàn)情況。（一般 30h后即可出現(xiàn)一些透明圈）。6、菌株的純化于超凈工作臺內(nèi)（亦可使用酒精燈，直接在實驗臺上完成）用接種環(huán)挑取長勢良好且透明圈直徑與菌落直徑的比值較大的菌落于平板上劃線分離，培養(yǎng)一定時間，進一步分離能形成透明圈的單菌落。并在斜面培養(yǎng)基中保存。.圖2 平板劃線分離法示意圖五、結(jié)果處理與分析1 、菌落產(chǎn)生透明

8、水解圈的觀察用直尺分別于不同方向測量菌落和水解圈的直徑大小，求平均值，并計算透明水解圈直徑與菌落直徑的比值。表1 不同菌落產(chǎn)淀粉酶能力的比較菌落編號菌落直徑（mm ）透明圈直徑(mm)透明圈直徑/ 菌落直徑菌落形態(tài)特征2 、侯選菌落的形態(tài)觀察：觀察并描述分離所得菌株的菌落形態(tài)，以大致了解產(chǎn)酶菌株屬于那一類菌。3 、你所用的涂布平板法或劃線法是否較好地得到了單菌落？如果不是請分析原因。六、注意事項1、 進行無菌操作前，將接種所需用具放于臺面鐵架上，對超凈工作臺即周圍環(huán)境進行75酒精噴霧，使灰塵沉降，打開紫外燈照射滅菌30min ，操作前，用75酒精噴手殺菌。（在本實驗中省去此步）。2 、操作應(yīng)盡

9、量靠里，在酒精燈的火焰旁工作。3 、實驗過程中避免說話、走動。4 、每次涂板后涂布棒皆要用火焰灼燒滅菌，冷卻后再涂下一塊板。.實驗二、雞蛋清溶菌酶的磁性親和分離一、目的學(xué)習(xí)和掌握親和層析法分離純化酶的基本原理和方法。二、原理許多生物分子都具有能和某些相對應(yīng)的專一分子可逆地特異結(jié)合的特性（分子間通過某些次級鍵結(jié)合，如范德華力，疏水力，氫鍵等，在一定條件下又可解離）。如：酶和底物（包括酶的抑制劑、產(chǎn)物、輔酶及其底物的類似物）的結(jié)合，特異性的抗體一抗原（包括病毒、細胞）、激素與其受體、載體蛋白的結(jié)合，基因與其互補DNA、 mRNA 及阻遏蛋白的結(jié)合，植物凝集素與淋巴細胞表面抗原及某些多糖的結(jié)合等。均

10、屬于專一性而可逆的結(jié)合，這種分子之間的結(jié)合能力叫做親和力。親和層析正是利用生物分子間所具有的專一親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。所以有人稱為 “生物專一吸附技術(shù) ”或 “功能層析技術(shù) ”。它具有分離快速，純化效率高。特別是對于那些含量少，雜質(zhì)多，采用常規(guī)方法難于分離的生物活性分子，顯示了獨特的優(yōu)越性。因此，親和層析技術(shù)已成為純化生物分子，特別是純化生物活性物質(zhì)最重要的方法之一。磁性介質(zhì)被廣泛用于分離細胞、核酸蛋白質(zhì)等生物大分子和激素等小分子生物活性物質(zhì)，其優(yōu)點在于通過外磁場的作用可快速地實現(xiàn)固液及磁性介質(zhì)與其它固形物間的分離，尤其是當(dāng)待分離的液體樣品含有其它固形物或粘度較大時。磁性親和分離技術(shù)是將親和

11、吸附的專一性、高效性與磁性材料的磁可導(dǎo)向性相結(jié)合的一種新型分離技術(shù)。溶菌酶（）廣泛地存在于動物、植物和微生物中，其中雞蛋清中的含量較為豐富。雞蛋清溶菌酶的相對分子質(zhì)量為14.6KD，由 129 個氨基酸殘基組成的單肽鏈蛋白，含有4 個S-S 鍵，在中性及偏酸性條件下結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。溶菌酶能催化水解細菌細胞壁多糖的N- 乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的 -1 ，4 糖苷鍵，幾丁質(zhì)（又稱甲殼素）則是這類細胞壁多糖的類似物，因此可利用溶菌酶與甲殼素間的特異結(jié)合來分離純化溶菌酶。三、材料、試劑及儀器1、材料 新鮮雞蛋清：取自市售的雞蛋。 親和層析介質(zhì)：幾丁質(zhì)磁性凝膠介質(zhì)（自制）。 溶壁微球菌 （Mic

12、rococcus Lysodeikticus）（ Sigma 公司）2、試劑 0.15N HAc ：吸取 18mL 冰乙酸，定容至1000 mL 。 10%的 HAc ：吸取 100mL 冰乙酸，用蒸餾水定容至1000 mL 。 0.2mol/L NaHCO 3 溶液：稱取 16.8g NaHCO 3，溶解，定容到 1000mL 。 5mmol/L NaHCO 3 溶液（含 0.2 mol/L NaCl）：先將 0.2mol/L NaHCO3 稀釋 40 倍，再于每升溶液中加入 NaCl 11.688g 。 5mmol/L NaHCO 3 溶液（不含 NaCl ）：將 0.2mol/L NaH

13、CO 3 稀釋 40 倍。 10mmol/L NaHCO 3 溶液：將 0.2mol/L NaHCO 3 稀釋 20 倍。 1/15 mol/L磷酸緩沖液 （ pH6.2 ）：Na2 HPO3·12H2 O4.7752g ，KH2PO4 7.2576g ，溶解，定容至 1000mL 。. 考馬斯亮藍G-250 ：稱取 100mg 考馬斯亮藍溶于50mL 90%乙醇，加入85%磷酸 100mL ，用蒸餾水定容至 1000mL ，過濾。 2 mol/L NaOH：稱取 80g 的 NaOH 定容至 1000 mL 。0.1mol/LpH 7.8磷酸緩沖液 (內(nèi)含 0.5mol/LNH A

14、c)：稱取 32.78g 的 Na HPO ·12H2O， 1.33g 的423NaHPO ·2H O, 38.54 g 的 NH Ac 溶解后，定容至 1000mL.24243、 儀器分部收集器、分光光度計、恒溫水浴器、恒流泵、電子天平、強力電動攪拌器、抽濾裝置。四、操作步驟（一）、雞蛋清溶菌酶的磁性親和分離1.親和層析介質(zhì)的再生和平衡：用3-4 個床體積的5mmol/L NaHCO3（含NaCl ）溶液淋洗親和層析介質(zhì)即可。（若發(fā)現(xiàn)介質(zhì)上有太多雜蛋白和一些微生物污染，可用 0.5mlo/L的 NaOH 淋洗親和層析進行在位清洗 ）2. 蛋清提取液的制備：取一個新鮮雞蛋的

15、蛋清，用5mmol/LNaHCO 3 （不含 NaCl ）液攪勻并稀釋至400mL ，雙層尼龍布過濾，取濾液。（測定酶液總體積，并留1.0 mL 樣品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的測定）。3.酸和熱變性：用10%的 HAc 將稀釋后蛋清的pH 值調(diào)至4.5 ， 60水浴15 分鐘，雙層尼龍布過濾，取濾液，用2 mol/L的 NaOH 將上清的pH 值調(diào)回至7.0 （邊緩慢加入NaOH 邊攪拌，以免局部溶液pH 值過高和將pH 值調(diào)過頭 ），（測定酶液總體積，并留1.0mL 樣品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的測定）。4.開放吸附：向步驟3 的上清液中加入上述平衡好的磁性凝膠介質(zhì)，于燒

16、杯中用玻棒緩慢攪拌30 min（見圖1-1 ）。（盡量緩慢地攪拌，以免破碎凝膠顆粒）。在此步驟中溶菌酶被親和吸附到凝膠介質(zhì)上。5. 介質(zhì)的磁性回收及洗滌：用帶環(huán)型條紋塑料外套的圓形鐵氧體磁鐵作為外磁場收集親和介質(zhì)，此時介質(zhì)被吸附于塑料外套的表面，取出塑料外套中的磁鐵將吸附于塑料外套的表面的介質(zhì)懸浮于10mmol/L NaHCO3 溶液中，緩慢攪拌洗滌介質(zhì)，磁性回收，如此洗滌介質(zhì)2 次（見圖 1 2,3 ）。將洗滌后的介質(zhì)裝柱（測柱徑及層析床的高度）， 再用 pH 7.8 含 0.5mol/L NH4Ac 的 0.1mol/L磷酸鈉鹽緩沖液 (以下稱溶液B)洗滌至流出液的A280 < 0.

17、05 時，再用 10mmol/LNaHCO3 溶液 20mL 洗滌以替換柱子中的溶液B，以便下一步的洗脫操作。.123圖 1 雞蛋清溶菌酶的磁性親和吸附分離1 溶菌酶的開放吸附；2 親和介質(zhì)的磁性收集；3 介質(zhì)的洗滌6.洗脫： 用 0.15N HAc溶液進行洗脫，流速控制在30ml/h左右，分部收集 (4mL/ 管 ) ，分別測定A280nm（其可快速地監(jiān)控蛋白的洗脫情況）和酶活性，收集活性部分即為純化酶，4下保存?zhèn)溆谩?（測定酶液總體積）。因本步驟所得酶液的活性很高，故應(yīng)取部分酶液（如0.2mL ）稀釋10 倍后再用于酶活性測定，而用于蛋白含量測定時則不必稀釋）。7.用離心管保留粗提液及酸熱

18、變性后的酶液，用刻度試管保留親和層析后的酶液，放置在4 ，以備實驗三和四使用。（二）、測定方法1.溶菌酶活性的測定原理：由于溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物懸浮液的濁度（可用450nm波長下的吸光度來衡量）下降，故可用反應(yīng)液在450nm 波長下吸光度下降的速度來表示酶活性。具體方法為： 將溶壁微球菌研磨并溶于0.1mol/L磷酸緩沖液 （ pH6.2 ）中，使其 A450nm 在 0.6-0.9間。吸取上述底物懸浮液2.0mL 于玻璃比色杯，然后加入0.05mL 酶液，用移液槍攪動迅速混勻，啟動反應(yīng)，測定1min 內(nèi) A450nm 的變化（ 用 0.1mol/L磷酸緩沖液調(diào)零，當(dāng)蓋上分光光度計

19、2-3 秒鐘后開始用秒表計時并讀數(shù)），每 15s 記錄一次讀數(shù)。酶活力的計算：首先要自定義酶活性單位 （ U）。定義在當(dāng)前測定條件下， 使測定體系在 450 nm 波長下吸光度每分鐘下降 0.01 所需的酶量為 1 個酶活力單位（ U）。酶液活力（ U/mL ） =A450/ min100 稀釋倍數(shù)0.052. 蛋白含量的測定用考馬斯亮藍G-250 法分析溶液中可溶性蛋白的含量。取50uL 的樣品液加入.2.5mL的考馬斯亮藍G-250 溶液，搖勻，放置5 min 后，在 595nm波長下測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計算出蛋白含量。（由標準曲線求得的回歸方程為：酶樣蛋白含量：b (mg/mL)

20、= 1.674 ×A595nm- 0.0354 ）五、結(jié)果處理與分析1 、 繪制親和層析洗脫曲線。（參考下圖格式繪制）1.27000160000.15mol/l HAc50000.8mn08A400020.630000.420000.2100000051015202530管號（支）A280nmLysozyme activity)Lm/U(性活酶菌溶圖 2雞蛋清溶菌酶的親和層析( 2.0× 15 cm )流速： 60 mL/h ； 4.0 mL/管2 、 制作純化表。對每個純化步驟中的酶樣測定以下3 個指標：單位體積酶樣的活性: a （ U/mL ） = A450 /（ 1.

21、0 min× 0.01× 0.05），mL即酶液活力。酶樣的蛋白含量: b （ mg/mL ）、酶樣總體積：c（ mL ）。由此即可制作如下純化表：表 1 雞蛋清溶菌酶純化表純化步驟總體積總蛋白總 活 性比活性回收率純化倍數(shù)濃縮倍數(shù)（ mL ）（ mg)（ U）( U/mg 蛋白）（ %）（ ×）（ ×）粗提液C1b1×C1a1×C1a1 / b110011酸、熱變性C2b2×C2a2×C2a2/ b2a2×C2a2/ b2a2/ a1a1×C1a1 /b1親和層析C3b3×C3a3&

22、#215;C3a3 / b3a3×C3a3 /b3a3/ a1a1×C1a1 /b13、 常見的酶活性表示方法有那些（如：U/mL 酶液； U / mg protein; U/g干重或鮮重；U / g酶.粉等）？它們各有什么含義，適用哪些場合？4、 與一般介質(zhì)相比磁性親和介質(zhì)有何優(yōu)缺點？5、 層析操作中如何更換緩沖液？6、 如何保存介質(zhì)？六、注意事項1、 攪拌開放吸附時，攪拌的速度不要太快，以免破壞介質(zhì)，攪拌速度以能使介質(zhì)懸浮即可。2、 裝好層析柱后，應(yīng)在介質(zhì)的面上鋪一張圓形的小濾紙片，以免在柱層析過程中介質(zhì)被液滴沖起。.實驗三、純化雞蛋清溶菌酶的純度分析一、目的了解酶（蛋

23、白質(zhì)）純度鑒定的常用手段。掌握用SDS-PAGE法進行蛋白純度鑒定。二、原理蛋白質(zhì)純度鑒定通常采用物理化學(xué)方法，如：電泳、HPLC 等。其中常用的電泳分析方法有SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、等電聚焦、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）等。純的蛋白質(zhì)在一系列條件下進行電泳時，都將以單一的速度泳動，它的非變性電泳圖譜應(yīng)只呈現(xiàn)一條染色帶。HPLC 常用于多肽、蛋白質(zhì)純度鑒定，純的蛋白樣品在洗脫圖譜上呈現(xiàn)出單一的對稱峰。三、材料、試劑1. 材 料： 實驗二親和層析所得的純化雞蛋清溶菌酶。2. 試劑： 溶壁微球菌 （ Micrococcus Lysodeikticus）（ Sigma 公司

24、）、丙烯酰胺（ Acr ）、甲叉雙丙烯酰胺（ Bis）、甘氨酸、瓊脂、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（ SDS）、巰基乙醇、溴酚蘭、甘油、考馬斯亮藍R-250、甲醇、冰乙酸等。低分子量標準蛋白（上海生化研究所），（已處理好不必再加樣品裂解液進行處理?。╇娪驹噭┡渲疲海?1）30%凝膠貯液： 取 30g 丙烯酰胺（ Acr ）， 0.8 g 甲叉雙丙烯酰胺（ Bis）加水定容至 100mL ，過濾后置棕色瓶中，于 4保存?zhèn)溆谩?2 ）電極緩沖液：Tris 3.03 g ，甘氨酸14.4 g ， SDS 1.0 g，溶解并定容至1000mL （ pH 值約 8.3 ） 。（ 3） 1

25、%瓊脂糖溶液：1g 瓊脂 +100mL 電極緩沖液加熱溶解。（ 4）樣品裂解液 （2× SDS加樣緩沖液）：10 %SDS ：1.00 mL巰基乙醇：0.1mL濃縮膠 buffer ： 0.5 mL水：0.15mL共： 2.5mL甘油：0.5 mL2 % 溴酚蘭：0.25mL（ 5）染色液：稱考馬斯亮藍R-2500.5g，甲醇225 mL ，冰乙酸50mL，定容至 500 mL 。（ 6）脫色液： 取冰乙酸75 mL ，甲醇50 mL，定容至1000mL 。（ 7）分離膠緩沖液： 取 18.15 gTris 溶解后， 加 6mol/L HCl溶液 4mL ，調(diào) pH 值至 8.8 ，

26、定容至 100 mL 。（ 8）濃縮膠緩沖液：取 6.0 gTris 溶解后，加6 mol/L HCl溶液 8mL ，調(diào) pH 值至 6.8 ，定容至 100 mL 。（ 9） 10 SDS：取 10g 溶解后，定容到 100mL 。（ 10） 1過硫酸銨 ：取 0.1g 溶解后，定容到 10mL 。（ 11） TEMED：分裝。其它試劑： 1mol/L NaOH ：稱取 20g 的 NaOH 定容至 500 mL 。四、操作步驟1.封瓊脂糖： 取加熱溶解的1% 瓊脂糖溶液，用滴管加入兩玻璃板底部的凹槽中，冷卻凝固以封住兩玻板.間底部的縫隙。2. 分離膠制備： 加分離膠至玻板頂部 3cm 處，

27、立即覆蓋水層，靜置至膠與水層形成清晰的界面。3. 濃縮膠的制備： 倒去水層，用濾紙吸干，加濃縮膠，插入梳子，靜置聚合。注意：每一次吸膠后，立即用蒸餾水洗凈滴管及微量進樣器，以免堵塞！附：膠溶液配方：分離膠12.5%15%30%凝膠貯液3.15 mL3.75 mL水2.1 mL1.60 mL分離膠 buffer pH8.81.90 mL1.85 mL共 7.5ml10% SDS0.1 mL0.10 mL1%過硫酸銨0.25 mL0.25 mLTEMED5 L5 L（最后加入以啟動反應(yīng)）濃縮膠30 %凝膠貯液0.7 mL水2.85 mL10%SDS0.1 mL濃縮膠 buffer1.2 mL共 5

28、 mL1 %過硫酸銨0.25 mLTEMED10 L（最后加入以啟動反應(yīng)）4. 樣品的濃縮與脫鹽：因?qū)嶒? 親和層析所得的純化溶菌酶的蛋白濃度太低不利于電泳后染色，故先要對其進行如下濃縮：（注：本實驗中的其它樣品不必濃縮）1）取 a mL 樣品（在本實驗中用1.0 mL純化的雞蛋清溶菌酶） ，緩慢加入4a mL -20o C 預(yù)冷的丙酮 （邊加邊混勻），然后將其在 -20oC 靜置 2h 以上。離心（ 10000rpm ， 10min ）后，棄上清（用吸管輕輕吸取上清），并將試管口倒扣于吸水紙上約半分鐘以瀝干溶液，沉淀于空氣中干燥后備用。2）取適量樣品裂解液（本實驗中約用60 L）溶解沉淀 -

29、 用移液槍反復(fù)吸沖壁然后吸取至1.5mL 離心管中 沸水浴加熱3-5min 離心備用（ 12000rpm ， 5min ）。3）本實驗中的其它樣品( 粗酶、酸和熱變性酶)不必濃縮，按1： 1 加入樣品裂解液（100 L酶液加100 L樣品裂解液） ，100 加熱處理5min離心后備用； 標準分子量蛋白100 加熱處理3-5min 后，即可使用。5.上樣向電泳槽中加上電極緩沖液，上接負極（黑），下接正極（紅） 。用微量進樣器在加樣孔中點樣。（上樣量在 15-25 L間比較合適 ）6. 電泳：開始時用8 mA 電流，當(dāng)溴酚藍遷移至分離膠處后，改用10mA 電流。7. 染色、脫色：.取出凝膠平板（從

30、尾部撬出！以免弄爛玻璃板）切去濃縮膠或瓊脂糖部分，于蒸餾水中漂洗3min ，如此重復(fù)2 次，浸于染色液中，不斷振蕩1-2hr ,脫色，半小時換一次脫色液。五、電泳結(jié)果分析1. 根據(jù)電泳圖譜分析溶菌酶的純化情況。2. 根據(jù)標準蛋白的分子量和遷移率及目的蛋白的遷移率，計算目的蛋白的分子量（以 lgM 對遷移率R 作圖，其中M 為蛋白質(zhì)分子量） 。123圖 1 雞蛋清溶菌酶的 SDS-PAGE圖譜1.親和層析后的雞蛋清溶菌酶；2.低分子量標準蛋白；3.粗酶。其中標準分子量蛋白分別為：雞蛋清溶菌酶（14.4KDa ）、胰蛋白酶抑制劑（20.1KDa）、牛碳酸酐酶 （ 31.0 KDa ）、兔肌動蛋白

31、（ 43.0 KDa ）、牛血清白蛋白（ 66.2 KDa ）、兔磷酸化酶B（ 97.4 KDa ）。.實驗四、純化雞蛋清溶菌酶的熱穩(wěn)定性分析一、目的了解各環(huán)境因素（如：溫度、pH 值等）對酶穩(wěn)定性的影響。了解衡量酶穩(wěn)定性的指標：半衰期T1/2 。二、原理酶的穩(wěn)定性是指酶抵抗各種因素的影響而保持其活性的能力，酶的穩(wěn)定性在生產(chǎn)應(yīng)用上具有重要的意義。酶的穩(wěn)定性常用半衰期（T1/2 ）來衡量，其表示一定條件下酶活力喪失50%所需的時間。一般來說半衰期越長表明酶在特定條件下的穩(wěn)定性越好。溶菌酶的熱失活行為可簡化為不可逆的一級失活模型。以 E 和 D 分別表示活性酶與失活酶，則失活反應(yīng)方程式可以表示為：

32、EK dDkr式中 Kd 和 Kr 分別表示正反應(yīng)和逆反應(yīng)的速度常數(shù)，因是不可逆失活反應(yīng)，故Kr=0。令時間為 t 時活性酶的濃度為E t , 酶活性為At ，則有：d E tk d E tdt E tE0exp(k d t )ln E tlnE 0k d tlnAtlnA0k d tlnA0k d t .(1)AtT1/2ln 2.(2)k d根據(jù)式（ 1），以 lnA0 對處理時間 t作圖其斜率即為kd 。進而通過式（ 2）便可求得半衰期（T 1/2 ）。At三、材料、試劑1. 材 料： 實驗二親和層析所得的純化雞蛋清溶菌酶、指形管等。2. 試劑和儀器： 0.5 mol/L NaOH ；

33、pH 計。四、實驗步驟1.取親和層析所得的純化溶菌酶用蒸餾水稀釋5 倍后 （此時溶菌酶所處的環(huán)境為酸性的醋酸溶液 ），分裝入5 根指形管中，每管0.5mL ，放入75水浴中保溫，分別處理0, 10, 20, 40, 60 min后取.出，在自來水下冷卻，測定酶液的殘留活力，以未經(jīng)處理（即0 min ）的酶液活性為100%，計算其它加熱處理酶液的相對活力，并以“相對活力 ”對 “加熱處理時間”作圖。2.同時取稀釋后的純化溶菌酶5mL,在 pH 計上用0.5 mol/LNaOH 將酶液的pH 值調(diào)至8.0 左右（此時溶菌酶所處的環(huán)境為中-偏堿性的溶液，此步調(diào)pH 值特別關(guān)鍵，避免過堿或過酸?。?，分

34、裝入5根指形管中，每管0.5mL ，同步驟1 將其放入75 水浴中加熱，處理0, 10, 20, 40， 60 min后，分別測定酶液的殘留活力，做與上述同樣的分析。五、實驗結(jié)果與分析：1.觀察加熱處理中酶液的變化情況（如沉淀的出現(xiàn)）。2. 以 “相對活力 ”對 “加熱處理時間 ”作圖。3.以 ln A0 對處理時間t 作圖，其斜率即為kd ，進而便可求得半衰期（T1/2 ）。At4.比較兩者酶液熱穩(wěn)定性的差異，并分析環(huán)境pH 值條件對酶分子熱穩(wěn)定性影響的原因。六、注意事項1. 由于所得純化酶的活力太高不便于活力的測定分析，故應(yīng)將實驗二所得的純化酶作適當(dāng)稀釋（本實驗約為 5 倍）后，再進行加熱

35、處理試驗。2.在步驟2 中，要確保酶液的pH 值被調(diào)至8.0 左右。.實驗五、木瓜蛋白酶的制備一、目的學(xué)習(xí)和掌握有關(guān)酶源（本實驗為木瓜乳汁）的選取、采集及粗酶提取等方面的基本原理和方法。二、原理木瓜又名番木瓜（Carica Papaya），多年生常綠大型草本植物，生長在南北緯32o 之間。木瓜蛋白酶則被廣泛地應(yīng)用于食品醫(yī)藥等行業(yè)，如：啤酒的澄清、餅干的膨松等，其大量存在于木瓜乳中?，F(xiàn)有木瓜酶的生產(chǎn)上是以未成熟的木瓜果實為原料來采集木瓜乳。本實驗以生長在植株上的木瓜果實為材料，通過劃破果皮來采集新鮮的乳汁，進而用緩沖液抽提其中的蛋白酶，并分析其酶活性。三、材料、試劑和儀器1. 材料種植在網(wǎng)室中結(jié)

36、有果實的木瓜樹、牙簽、燒杯、離心管等。2. 試劑0.4mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2 ）： Na2HPO4·12H2O 103.14g ， NaH2 PO4 ·2H2 O17.5g ，溶解，定容至 1000mL。0.1mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2 ）：將 0.4mol/L磷酸緩沖液（ pH 7.2 ）稀釋 4倍。1% 的酪蛋白溶液：稱10g 的酪蛋白用0.1mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2 ）配至1000 mL 。激活劑：用0.1mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2 ）配制含半胱氨酸10 mmol/L, EDTA1mmol/L的混合液。即 2.423g 半胱氨酸，

37、 0.744gEDTA 溶解于 2L pH7.2 ，0.1mol/L磷酸緩沖液。10% 三氯乙酸（TCA）：稱取100 g 的 TCA，定容到 1000mL 。3. 儀器： 分光光度計、離心機、 HZS-H 水浴振蕩器、 Sartorius BP110S 電子天平。四、操作步驟1.木瓜乳的采集選取謝花坐果 60天以上的的木瓜果實， 用濕棉布小心檫凈表面，而后用牙簽，在果實的表面劃若干條深約1-2mm的傷口，此時便有大量的白色乳汁流出，用培養(yǎng)皿接在底下收集，片刻后收集的乳汁便會凝固（若天氣干燥可在割乳的前一天澆灌大量的水），稱取所收集乳汁的重量。2.木瓜蛋白酶的抽提往上述凝固的木瓜乳中加適量的0

38、.1mol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 7.2 ）在研缽中充分研磨，離心（10000rpm ， 10min ），取上清，量體積后放置備用。3. 酶活性的測定 ：先自定義酶活力單位（U）。（參照實驗二中對酶活力單位的定義）樣 品測 定步 驟（按從左到右的順序進行）酶液10%TCA激活劑1% 的酪蛋搖勻10%TCA（ mL）（ mL ）（ mL ）35白（ mL ）35（ mL）過濾或離對照管0.111.9保溫1反應(yīng)0心，測定濾反應(yīng)管（ 30.101.910min110min1液或上清的個）A275nm 值.4.蛋白含量的測定考馬斯亮蘭G-250 法，取 50 uL 的樣品液加入2.5mL 的考馬斯亮

39、蘭G-250 溶液，搖勻，放置 5 min 后，在 595nm 波長下測定吸光度，并根據(jù)標準曲線 （酶樣蛋白含量(mg/mL)= 1.674×595nmA - 0.0354 ）計算出蛋白含量。五、實驗結(jié)果與分析1. 計算所得酶樣的活力先要自定義酶活力單位（U）。 （參照實驗二中酶活力單位的定義）酶液的活力（U / mL酶液）。酶液的蛋白含量（mg 蛋白/ mL ）。比活力（ U / mg蛋白）。2. 計算酶得率（ U / g 木瓜乳） 。六、注意事項1. 選取謝花坐果 60-100 天左右的木瓜果實（果皮青綠色）來采集木瓜乳。2. 不能將果實摘取下來后，再來劃線采集木瓜乳。這是由于不

40、再有根壓的存在，而導(dǎo)致無木瓜乳流出。3. 若天氣過干旱，要在采乳前一天適當(dāng)澆水。.實 驗 六：殼聚糖凝膠顆粒固定化木瓜蛋白酶一、目的學(xué)習(xí)殼聚糖固定化木瓜蛋白酶的方法、掌握共價結(jié)合法固定化酶的原理和方法。二、原理甲殼素是由N-乙酰基 -D- 葡胺糖通過- (1,4)糖苷鍵聯(lián)結(jié)的直鏈狀多糖，甲殼素脫去分子中的乙?；娃D(zhuǎn)變成殼聚糖, 其基本組成基本單位是D-葡胺糖。殼聚糖是一種生物相溶性好、可生物降解、無毒易得的天然功能高分子材料，被廣泛用來作為固定化酶的載體。殼聚糖分子中D-葡胺糖的 -NH 2 可與雙功能試劑戊二醛的一個-CHO 縮合，戊二醛的另一個-CHO 與酶的游離氨基縮合，從而形成殼聚糖-

41、 戊二醛- 酶 結(jié)構(gòu)，即固定化酶。本實驗采用以戊二醛為雙功能試劑的載體交聯(lián)法固定化木瓜蛋白酶。三、材料、試劑和儀器1. 材料 ：殼聚糖，木 瓜蛋 白 酶 液。2. 試劑 ：（ 1 ） 1% 的冰醋酸溶液；（ 2 ） 甲醛（ 37%）；（ 3 ）1mol/L NaOH；（ 4 ）0.8%的戊二醛（用磷酸緩 沖 液 配 制 ）： 量取 32mL的 25 戊二醛，稀釋到1000mL ；（ 5 ）0.1mol / L磷 酸 緩 沖液 （ pH 7.2 ）（ 6 ）2 mol/L 的 NaOH3. 儀器 ：抽濾裝置，恒溫水浴震蕩器，冰箱，搖床等。四、實驗步驟1. 殼聚糖凝膠顆粒的制備稱取 0.5 克殼聚

42、糖充分溶解于35 mL1% 的冰醋酸溶液中，加入3.0mL 甲醛（ 37%）迅速混勻，.在 40水浴中靜置保溫100 min , 得到透明的凝膠，加小量蒸餾水將凝膠擠壓破碎，倒出并在研缽中進一步破碎成適當(dāng)大小凝膠顆粒，接著在燒杯中使其懸浮于100mL 蒸餾水中， 不斷地用2 mol/L的 NaOH將懸浮液的pH 值調(diào)至8.0 ，放置10min ，而后用蒸餾水在抽濾漏斗上洗滌凝膠顆粒數(shù)次，抽去多余水分，備用。2. 殼聚糖凝膠顆粒的活化取上述凝膠顆粒10 g ，加入 40mL 0.8% 的戊二醛， 室溫放置100min ，用 0.1mol / L磷酸緩沖液 （ pH7.2 ）洗滌凝膠顆粒3-4 次

43、，以除去多余的戊二醛，抽濾備用。3.固定化往上述的凝膠顆粒中加入15mL 木瓜蛋白酶液，4下放置2h，中間攪動數(shù)次，而后用0.1mol / L磷酸緩沖液（ pH 7.2 ）洗滌凝膠顆粒3-4 次，（注意：收集洗液，不要超過50mL ）以除去未固定的木瓜蛋白酶，即得固定化木瓜蛋白酶。4.酶活力測定首先要定義酶活性單位（U）。定義在當(dāng)前測定條件下，使測定體系在275nm波長下的吸光度每分鐘增加0.01 所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。（ 1）溶液酶活力測定與實驗五的酶活性測定方法相同。（ 2）殘留酶活力測定取 0.1mL 殘留液測酶活。殘留酶活力數(shù)（ U） A275/min收集液× 0.01× 0.）1 mL×V/ （ 10 min（ 3）固定化酶活力測定稱取 0.1g 固定化酶，加入2mL 激活劑。其余步驟與溶液酶活性測定方法相同。五、數(shù)據(jù)處理及計算固定