細菌鑒定中常用的理化生化反應

1、實驗日期：2017.11.1 實驗班級：生物技術 指導教師：張建麗 姓名：高熹 學號：1120152430 細菌鑒定中常用的理化生化反應一、實驗目的1)了解細菌生理生化反應原理2)通過細菌對不同含碳、氮化合物的分解利用情況了解細菌碳、氮代謝類型的多樣性。3)了解細菌在培養(yǎng)基中生長現(xiàn)象及其代謝產物在鑒別細菌中的意義。二、實驗原理1）糖（醇）類發(fā)酵實驗因細菌所含的酶不同，其發(fā)酵糖（醇）后的代謝產物亦不相同，即可產酸產氣，或產酸不產氣。酸的產生可利用培養(yǎng)基中溴甲酚紫的顏色變化進行判斷（pH5.2黃色6.8紫色），即當發(fā)酵產酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體產生可由發(fā)酵管內倒置的杜氏小管中有無氣泡來

2、判斷。2）甲基紅（Methyl red）實驗（MR實驗）大腸桿菌等許多細菌分解葡萄糖產生丙酮酸,丙酮酸可進一步分解成甲酸（或乙酸乳酸）,使培養(yǎng)基的pH降低到4.2以下,此時加入甲基紅指示劑，呈現(xiàn)紅色 。產氣桿菌等分解葡萄糖產生丙酮酸,培養(yǎng)基的pH在6.2以上, 故此時加入甲基紅指示劑,呈現(xiàn)黃色。 3）伏-普(Voges-Proskauer)氏實驗(V.P.實驗)4）靛基質(吲哚)實驗大腸桿菌等能分解蛋白質中的色氨酸,產生靛基質(吲哚),靛基質與對二甲基氨基苯甲醛結合形成玫瑰色靛基質(紅色化合物)。5）硫化氫實驗某些細菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸半胱氨酸等),產生硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽,形

3、成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵.為硫化氫實驗。6）明膠液化實驗某些細菌具有膠原酶,使明膠被分解,失去凝固能力,呈現(xiàn)液體狀態(tài),為明膠實驗陽性。7）淀粉水解實驗細菌不能直接利用淀粉,須經淀粉酶將淀粉水解為小分子糊精或進一步水解為葡萄糖(或麥芽糖)后被細菌吸收利用,細菌水解淀粉的過程可通過底物的變化來證明,即加碘液測定時，不再產生藍色。8）檸檬酸鹽利用實驗產氣桿菌等能以檸檬酸鈉為碳源進行生長。其分解檸檬酸鹽后產生碳酸鹽, 培養(yǎng)基呈堿性.使培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍指示劑由綠色變?yōu)樗{色.不能利用檸檬酸鹽為碳源的細菌,在該培養(yǎng)基上不生長,培養(yǎng)基不變色. 三、實驗試劑及器材實驗儀器和用具：恒溫培養(yǎng)箱、試管、無菌平皿

4、、杜氏小管、接種環(huán),酒精燈；微生物材料：大腸桿菌,變形桿菌,枯草桿菌,產氣桿菌斜面；試劑：甲基紅試劑、V.P試劑、吲哚試劑 格里斯試劑（A、B）、盧戈氏碘液；培養(yǎng)基：葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（糖類發(fā)酵實驗）葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（甲基紅和V.P.實驗）胰蛋白水培養(yǎng)基（吲哚實驗）檸檬酸鐵銨或醋酸鉛的半固體培養(yǎng)基（硫化氫實驗）明膠培養(yǎng)基（明膠液化實驗）淀粉培養(yǎng)基（淀粉水解實驗）檸檬酸鈉斜面培養(yǎng)基（檸檬酸鹽利用實驗）硝酸鹽培養(yǎng)基（硝酸鹽利用實驗）。四、實驗步驟1）糖（醇）類發(fā)酵實驗1. 編號： 在試管上標明培養(yǎng)基名稱,所接種的菌名和組號.2. 接種： 取3 支葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基, 1 支接種大腸桿菌，1

5、支接種變形桿菌,留1 支不接種，作為對照.3. 乳糖發(fā)酵試驗接種方法同葡萄糖發(fā)酵試驗。將已接種好的培養(yǎng)基置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.4. 結果觀察:若細菌能發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖，可使培養(yǎng)基的pH 降低, 培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(為黃色),若發(fā)酵糖產酸產氣,不僅培養(yǎng)基呈黃色,且在倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有氣體（氣體占杜氏小管的10%以上）；若被測細菌不分解培養(yǎng)基中的糖,則培養(yǎng)基不發(fā)生變化。2）甲基紅實驗（MR 實驗）1. 取3 支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，標記同上。2. 取1 支接種大腸桿菌，1 支接種產氣桿菌,1 支不接種，作為對照。37培養(yǎng)48h，加甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察結果。3. 結果：呈現(xiàn)

6、紅色者為陽性, 呈現(xiàn)黃色者為陰性。3）伏-普實驗(V.P.實驗)取3 支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，1 支接種大腸桿菌，1 支接種產氣桿菌，1支留作對照。37培養(yǎng)48h 取出,加入40% KOH 5-10 滴,然后再加入等量的5%-萘酚溶液,用力振蕩,再放入37培養(yǎng)箱中保溫15-30min 加快反應速度.若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色,為伏-普反應陽性。4）靛基質(吲哚)實驗取3 支胰蛋白胨水培養(yǎng)基，1 支接種大腸桿菌，1 支接種產氣桿菌，1 支留作對照。37培養(yǎng)24-48h 后, 沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面, 觀察結果.呈現(xiàn)玫瑰紅色為陽性,不變色為陰性。5）硫化氫實驗取3 支醋酸鐵或檸檬酸鐵半固體培養(yǎng)

7、基，采用穿刺接種法，1 支接種大腸桿菌，1 支接種變形桿,1 支作對照。37培養(yǎng)24h 觀察結果,若有黑色沉淀線出現(xiàn)為陽性。6）明膠液化實驗取3 支營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基，用穿刺接種方法，1 支接種大腸桿菌，1 支接種枯草桿菌，1 支作對照。37培養(yǎng)48h 后，將明膠培養(yǎng)基輕輕放入4冰箱30 min,觀察明膠的液化情況。若明膠不凝固者，表明其已被細菌液化,是為陽性結果。7）淀粉水解實驗1. 將冷卻到50的淀粉培養(yǎng)基以無菌操作制成平板。2. 用接種環(huán)取少許枯草桿菌劃線接種在平板的一邊,再取少許大腸桿菌劃線接種在平板的另一邊。3. 置37溫箱培養(yǎng)24h。4. 打開培養(yǎng)皿, 將少量盧戈氏碘液滴加于平板上，輕

8、輕搖動,使碘液均勻鋪滿整個平板.如菌苔有透明圈出現(xiàn),表明淀粉已被水解.透明圈的大小,說明該菌水解淀粉能力的大小。8）檸檬酸鹽利用實驗取3 支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基，1 支接種大腸桿菌，1 支接種產氣桿菌，1 支作對照。37培養(yǎng)24 h 觀察結果.培養(yǎng)基變深藍色者為陽性.培養(yǎng)基不變色,則繼續(xù)培養(yǎng)5-7 天,培養(yǎng)基仍不變色者為陰性。9）硝酸鹽還原實驗取3 支硝酸鹽培養(yǎng)基，1 支接種大腸桿菌，1 支接種枯草桿菌，1 支作對照。37培養(yǎng)18-96h,每天吸取培養(yǎng)物2ml 加格里斯試劑A 液和B 液1 滴,出現(xiàn)粉紅色,玫瑰色,橙色或棕色為陽性.如無陽性反應,可加入1-2 滴二苯胺試劑,如培養(yǎng)液呈藍色,則表示

9、培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽存在,而無亞硝酸鹽存在為陰性.否則,表示硝酸鹽和新形成的亞硝酸鹽存在,而無亞硝酸鹽存在為陰性.否則,表示硝酸鹽和新形成的亞硝酸鹽都還原成其它物質,仍按硝酸鹽還原陽性處理。五、實驗結果及分析（一）糖（醇）類發(fā)酵實驗：37培養(yǎng)24h，葡萄糖（圖一）：大腸桿菌：產酸產氣；變形桿菌：產酸產氣。乳糖（圖二）：大腸桿菌：產酸產氣；變形桿菌：無明顯變化圖一 圖二 圖三 圖四（二）甲基紅實驗（圖三）：37培養(yǎng)48h，加甲基紅指示劑數(shù)滴，大腸桿菌：紅色（陽性）；產氣桿菌：黃色（陰性）（三）V.P.實驗（圖四）：37培養(yǎng)48 h取出,加入40% KOH 5-10滴,然后再加入等量的5%-萘酚溶液

10、,用力振蕩,再放入37培養(yǎng)箱中保溫15-30min。產氣桿菌：培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色（陽性）；大腸桿菌：無明顯變化（陰性）（四）靛基質(吲哚)實驗（圖五）：37培養(yǎng)24-48h后, 沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面。大腸桿菌：呈現(xiàn)淺紅色；產氣桿菌：呈現(xiàn)淺紅色。 圖五 圖六 圖七 （五）硫化氫實驗（圖六）：37培養(yǎng)24h，變形桿菌：有黑色沉淀出現(xiàn)（陽性）；大腸桿菌：無明顯變化（陰性）。（六）明膠液化實驗（圖七）：37培養(yǎng)48h后, 將明膠培養(yǎng)基輕輕放入4冰箱30 min,觀察明膠的液化情況?？莶菅挎邨U菌：明膠液化（陽性）；大腸桿菌：明膠不液化（陰性）（七）淀粉水解實驗（圖八）：37溫箱培養(yǎng)24h，打

11、開平皿, 將少量盧戈氏碘液滴加于平板上，輕輕搖動,使碘液均勻鋪滿整個平板?？莶菅挎邨U菌和大腸桿菌周圍都有透明圈出現(xiàn)，枯草桿菌周圍透明圈大于大腸桿菌周圍透明圈，證明枯草芽孢桿菌水解淀粉能力更強。（八）檸檬酸鹽利用實驗（圖九）：37培養(yǎng)24 h，產氣桿菌：培養(yǎng)基變深藍色（陽性）；大腸桿菌：培養(yǎng)基不變色（陰性） 圖八 圖九 圖十 圖十一（九）硝酸鹽還原實驗：37培養(yǎng)18-96h,每天吸取培養(yǎng)物2ml加格里斯試劑A液和B液1滴。24h后（圖十）：大腸桿菌和枯草桿菌加入試劑后均呈現(xiàn)橙色（陽性）；48h后（圖十一）：大腸桿菌和枯草桿菌加入試劑后均呈現(xiàn)橙色（陽性）六、注意事項1.實驗時,同時以未接種細菌的培養(yǎng)基作對照.因為亞硝酸鹽在自然界分布很廣,容易污染試劑.另外,硝酸鹽不純或保管不妥,也可能含有亞硝酸鹽。2.繁殖迅速而還原硝酸鹽能力強的細菌,如果培養(yǎng)時間過久,可能將亞硝酸鹽全部分解成為氨氣和氮氣,這樣可出現(xiàn)假陽性反應,故須每天進行實驗。七、思考題1、在吲哚實驗和硫化氫實驗中細菌各分解何種氨基酸?吲哚實驗：細菌分解色氨酸。因為某些細菌含有色氨酸酶，能將色氨酸分解成吲哚，加入吲哚試劑后起顏色反應。