病理切片的制作過(guò)程

1、精選文檔1.7.1 修整組織將手術(shù)切取的乳腺腫瘤切成一個(gè)平整面，各組織塊不宜太大，以便固定劑穿透和組織脫水等操作，通常以10 mm×10 mm×3mm或5mm×5mm×3mm為宜。找到不同的部位切取2塊，以備后用。1.7.2 組織洗滌 組織經(jīng)修整后，組織中的福爾馬林等必須沖洗干凈，尤其是含有重金屬的物質(zhì)存在。因?yàn)闅埩粼诮M織中的福爾馬林，有的不利于染色，有的產(chǎn)生沉淀或結(jié)晶影響觀察，所以組織修整后應(yīng)沖洗12h左右。1.7.3 組織脫水組織經(jīng)洗滌后，組織中含有大量水分，由于水與石蠟不能互溶，所以必須將組織中的水分除去。80%乙醇溶液：2h95%乙醇溶液:1h9

2、5%乙醇溶液:1h100%乙醇溶液:30min100%乙醇溶液:30min1.7.4 組織透明由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過(guò)二甲苯以過(guò)渡。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時(shí)，光線可以透過(guò)，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。二甲苯：30min二甲苯：10min1.7.5 組織浸蠟浸蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達(dá)到飽和程度以便組織包埋。浸蠟時(shí)間根據(jù)組織的透蠟時(shí)間較長(zhǎng)，需3h左右。浸蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，并保持箱內(nèi)溫度在55左右，注意溫度不要過(guò)高，以免組織發(fā)脆。石蠟：1h石蠟：1h。石蠟：1h1.7.6 組織包埋將經(jīng)過(guò)透蠟的組織連同熔

3、化的石蠟，一起倒入容器內(nèi)，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蠟塊的過(guò)程。包埋時(shí)，將紙盒放在溫箱旁邊，用鑷子夾取組織平放于紙盒底部，再用溫鑷子輕輕撥動(dòng)組織，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，沿壁倒入包埋用的紙盒中，速度要慢。待石蠟?zāi)蹋s30min）后放入冰箱保鮮層內(nèi)以備后用。包埋時(shí)應(yīng)根據(jù)組織材料、切片厚度、氣候條件等因素，選擇不同熔點(diǎn)的石蠟，新的石蠟一般要熬頓幾次，以免石蠟固定后有氣泡，影響切片。用于包埋的石蠟的熔點(diǎn)在5060之間。1.7.7 組織切片（1）從冰箱里拿出蠟塊，進(jìn)行修快（2）將已固定和修好的石蠟塊臺(tái)木裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上。（3）將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。（4）搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石

4、蠟塊與刀口貼近，但不可超過(guò)刀口。（5）調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。（6）調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，先調(diào)約為25um，待切平后改為5um。（7）一切調(diào)整好后方可以開(kāi)始切片。此時(shí)右手搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40-60r/min。（8）切成的蠟帶到10-20cm長(zhǎng)時(shí)，右手用另一支毛筆輕輕地將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。（9）感覺(jué)效果較好的蠟片一小段，用單面刀片切取，再放入約43的水浴鍋中展片，觀察切片是否良好。（10）切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用

5、氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機(jī)擦拭干凈妥為保存。1.7.8 貼片（1） 取清潔的載玻片一片，滴一滴粘片劑于玻片中央，然后用洗凈的手指加以涂抹，便成均勻薄層。（2） 然后用載玻片直接去濾已經(jīng)展開(kāi)的蠟片，將蠟片貼在均勻的粘片劑薄層上。注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，一端便于后面的染色步驟，另一端便于粘貼標(biāo)簽。1.7.9 烘片把載玻片擺好片位置，放在平盤(pán)上置于60溫箱烘干，經(jīng)過(guò)5小時(shí)干燥后即可取出存放于切片盒待染。1.7.10 脫蠟染色液多數(shù)為水溶液，因此，染色前必須將蠟脫去，使切片中的材料由有機(jī)相進(jìn)入到水相。一般采用二甲苯脫蠟，逐級(jí)復(fù)水與脫水浸蠟過(guò)程正好相反，但是，由

6、于蠟片較薄，所需時(shí)間比脫水浸蠟要短的多。（1）石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟10min；（2）石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟10min；1.7.11 滲水放入100%、95%、80%等各級(jí)酒精溶液中浸泡，再放入蒸餾水中，使水滲進(jìn)切片組織。（1）無(wú)水乙醇浸泡1min；（2）無(wú)水乙醇浸泡1min；（3）95%乙醇浸泡2min；（4）95%乙醇浸泡2min；（5）80%乙醇浸泡2min；（6）自來(lái)水洗2min；1.7.12 染色切片放入蘇木精中染色約7min。染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)。室溫高時(shí)促進(jìn)染色，染色時(shí)間可短些，否則可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，冬季室溫低時(shí)可放入恒溫箱中染色。1.7.13 水洗

7、用自來(lái)水流水沖洗約2min。沖洗過(guò)程中使切片顏色發(fā)藍(lán)，此操作要注意流水不能過(guò)大，以防切片脫落，并可以隨時(shí)用顯微鏡檢查見(jiàn)顏色變藍(lán)為止。1.7.14 分化就是將細(xì)胞質(zhì)著的色褪去，使細(xì)胞核著色更加鮮明，也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液（鹽酸1份+70%乙醇100份）中褪色，見(jiàn)切片變紅，顏色較淺即可，約數(shù)秒至數(shù)十秒鐘。這一步驟是H.E.染色成敗的關(guān)鍵，如分化不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致染色不勻，或深或淺，得到的切片染色效果差。如果染色適中，可取消此步驟。本次實(shí)驗(yàn)操作在0.5%鹽酸乙醇中浸泡30s；1.7.15 漂洗切片再放入自來(lái)水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。低倍鏡檢查見(jiàn)細(xì)胞核呈藍(lán)色、結(jié)構(gòu)清楚；細(xì)胞質(zhì)或結(jié)締組織纖維成分無(wú)色為標(biāo)

8、準(zhǔn)。然后放入蒸餾水中漂洗一次2min。1.7.16 反藍(lán)在飽和碳酸鋰中浸泡2min；再用自來(lái)水洗2min；1.7.17 復(fù)染用0.5%伊紅乙醇液對(duì)比染色25min。伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡程度應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡程度相配合，如果細(xì)胞核染色較濃，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對(duì)比。反之，如果細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細(xì)胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時(shí)不易褪色。本次操作伊紅染色6min；1.7.18 逐級(jí)脫水（1）80%乙醇脫水30s；（2）90%乙醇脫水30s；（3）95%乙醇脫水1min；（4）95%乙醇脫水1min；（5）無(wú)水乙醇脫水2min；

9、（6）無(wú)水乙醇脫水2min；1.7.19透明將經(jīng)過(guò)脫水后的切片放入純二甲苯、中各35min。二甲苯應(yīng)盡量保持無(wú)水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無(wú)水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說(shuō)明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。本次操作為：（1）二甲苯5min；（2）二甲苯10min；1.7.20 封藏：中性樹(shù)膠封存切片經(jīng)染色、脫水、透明后，即可用封藏劑將其封藏起來(lái)，目的是永久保存切片，便于鏡檢。常用的封藏劑一類為干性封藏劑如中性樹(shù)膠、加拿大樹(shù)膠等，另一類為濕性封藏劑如甘油明膠等。如果切片是經(jīng)二甲苯透明，則用樹(shù)膠作為封藏劑，樹(shù)膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠度。如果切片是直

10、接從水中或水溶液中取出，則常用甘油明膠作為封藏劑，可用于短期保存標(biāo)本。封藏的方法：封片前應(yīng)根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透明后，按照下列方法進(jìn)行封藏。在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹(shù)膠（千萬(wàn)不能待二甲苯干燥后再進(jìn)行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹(shù)膠從蓋玻片邊緣補(bǔ)足。如膠液過(guò)多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹(shù)膠。1.7.21鏡檢在光鏡下觀察染色結(jié)果，細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。組織切片過(guò)程中的注意事項(xiàng) 1）固定組織所用的固定液要充足,至少相當(dāng)于標(biāo)本總體積的5倍以上，標(biāo)本容器及其口徑有適當(dāng)大小，使標(biāo)本能原形進(jìn)行固定，避免使標(biāo)本遭受擠壓。 2）組織塊透明在制片中是很重要的環(huán)節(jié)，如果組織不能透明，其原因可能有脫水未盡、組織太厚、透明時(shí)間不夠以及與某些組織本身性質(zhì)有關(guān)等。所以從多方面考慮，盡可能使組織達(dá)到透明目的，通常根據(jù)透明時(shí)間與眼觀相結(jié)合判斷透明程度。 3）凡是陳舊、腐敗或干枯的組織不易制成好切片，所以制片過(guò)程中要保護(hù)好組織。 4）固定失時(shí)或固定不當(dāng)?shù)慕M織，染色時(shí)常出現(xiàn)核染色質(zhì)著色淺、輪廓不清，出現(xiàn)程度