切片實驗理論教程11

1、顯微技術(shù)簡介Gerald Karp,2010分辨率分辨率：指分辨物體間最小間隔的能力。指分辨物體間最小間隔的能力。R=0.61/NA其中其中為入射光線波長；為入射光線波長；NA為鏡口率為鏡口率 sin/2，n=介質(zhì)折射率；介質(zhì)折射率；=鏡口角鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角）（樣品對物鏡鏡口的張角） 。思考：思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？如何提高顯微鏡的分辨能力？肉眼光學顯微鏡透射電鏡分辨率0.2mm0.2m0.2nm應用范圍可觀察頭發(fā)絲、雙面刀刀刃的厚度可觀察細胞的結(jié)構(gòu)(最大有效倍數(shù):1000)可觀察細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu),分辨DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子、單個金屬原子（放大倍數(shù)可達百萬倍）觀察石蠟切片和

2、半薄切片觀察超薄切片 幾種介質(zhì)的折射率幾種介質(zhì)的折射率顯微鏡顯微鏡分辨本領(lǐng)分辨本領(lǐng)光源光源透鏡透鏡真空真空成像原理成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光可見光（400-700） 紫外光紫外光（約（約200nm)電子束電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空不要求真空不要求真空要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差和透射形成明暗反差電子波性電子波性De Broglie波波

3、1924年，德布羅意提出了運動著的微觀粒子（如中子、電子、離年，德布羅意提出了運動著的微觀粒子（如中子、電子、離子等）也具有波粒二象性假說子等）也具有波粒二象性假說-運動著的微觀粒子也伴隨著一個波運動著的微觀粒子也伴隨著一個波-物物質(zhì)波或德布羅意波。質(zhì)波或德布羅意波。 靜電透鏡：與一定形狀的光學介質(zhì)界面（如玻璃凸透鏡的旋轉(zhuǎn)對靜電透鏡：與一定形狀的光學介質(zhì)界面（如玻璃凸透鏡的旋轉(zhuǎn)對稱彎曲折射界面）可以使光線聚焦成像相似，一定形狀的等電位曲面稱彎曲折射界面）可以使光線聚焦成像相似，一定形狀的等電位曲面族也可使電子束聚焦成像，產(chǎn)生這種旋轉(zhuǎn)對稱等電位曲面族的電極裝族也可使電子束聚焦成像，產(chǎn)生這種旋轉(zhuǎn)對

4、稱等電位曲面族的電極裝置即為靜電透鏡。置即為靜電透鏡。一、光學顯微鏡術(shù)一、光學顯微鏡術(shù)光學顯微鏡 (L.M) Hooke (1665) 用光學顯微鏡觀察軟木的結(jié)構(gòu)，首次建立了Cell的名詞。鏡下結(jié)構(gòu)稱光鏡（light microscope LM)結(jié)構(gòu)； 放大倍數(shù)1000倍； 分辨率0.2m； 組織制成薄片，以利光線通過。顯微鏡顯微鏡主體主體 CCD CCD 或或數(shù)碼相機數(shù)碼相機調(diào)節(jié)座調(diào)節(jié)座物鏡轉(zhuǎn)換架物鏡轉(zhuǎn)換架物鏡物鏡目鏡目鏡載物臺載物臺聚光鏡聚光鏡（濾光片）（濾光片）光源開關(guān)光源開關(guān)（濾光片）（濾光片）成像透鏡成像透鏡 反射鏡反射鏡或分束鏡或分束鏡生物切片生物切片計算機計算機圖象采集卡圖象采集

5、卡視頻信號線視頻信號線1.石蠟切片術(shù)石蠟切片術(shù) (paraffin sectioning)石蠟切片法 石蠟切片法是以石蠟作包埋劑，用旋轉(zhuǎn)切片機將材料切成薄片，經(jīng)一系列處理制成永久制片的方法。在研究植物的細胞、組織、胚胎以及形態(tài)等方面石蠟切片法是最理想的制片方法。 制片過程（1）取材（1.0cm） 固定(甲醛） 酒精脫水（低-高） 透明（二甲苯） 浸蠟包埋 切片（510 um ） 展片； （2）脫蠟（二甲苯） 酒精（高-低） 水 蘇木精-伊紅染色 酒精脫水（低-高） 透明（二甲苯） 封片（樹膠） 取材取材 根據(jù)不同的實驗目的，選擇相應的材料，材料要求新鮮、準確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。

6、 所采集材料應立即放入固定劑，并編號，注明采集時間、地點、名稱、組織部位，所取組織塊要大小適當，即要能說明問題，又要考慮固定劑的穿透能力。 一般組織學取材稍大，細胞學取材稍小，植物組織取材稍小，動物組織取材要稍大。取材的基本要求 (1)動作迅速，取材后快速放入固定液中；(2)體積要小，根和莖一般直徑5mm，切取成5-10mm小段；葉片一般取過中脈處，切成2-5mm寬、5-8mm長。在切材料時，必須注意刀片與中軸成直角，兩切面平行，否則制成的切片細胞是斜的。 雌、雄蕊一般不需分割(3)減小損傷，切割器械鋒利，操作輕，避免牽拉、挫傷與擠壓組織。(4)低溫操作，最好在低溫(04)下進行，降低酶的活性

7、。所用器具和固定液都應預冷。 (5)取材部位要準確。需要找到細胞分裂相，一般在晴天的早晨9：00-10：00時取材，此時植物細胞分裂活動較明顯。固定固定 固定是制片極為關(guān)鍵的一個步驟，制片質(zhì)量的優(yōu)劣。除與材料的新鮮程度有關(guān)外，還取決于最初的固定是否適當和完全。割取組織塊后，應立即進行固定。將已切好的材料盡快地浸入相當于材料10-15倍體積的固定液中。借助固定液的作用，使細胞的新陳代謝瞬時停止，并保持細胞或組織的形態(tài)構(gòu)造及其內(nèi)含物的狀態(tài)不發(fā)生變化。從而達到使組織變硬從而便于切片、增強內(nèi)含物的折光度、令細胞易于著色的目的，同時具有防腐作用。以新鮮配制固定液效果較好。固定的時間依材料的種類、性質(zhì)、大

8、小等而定。材料固定完畢，保存于加蓋的容器內(nèi)，貼上標簽。 良好的固定劑，應是穿透力強，使細胞立刻致死，原生質(zhì)全部凝固；不發(fā)生任何變形，增強折光率，并且不妨礙染色。 固定的目的和作用在于：防止組織自溶和腐?。皇辜毎麅?nèi)的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來從而保存細胞的各種組成成分使其保持與生活時相近似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；因沉淀及凝固的關(guān)系，使細胞內(nèi)不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學上的差別使原來在生活情況下看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰易見，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細胞各部易于染色；固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化而不易變形，有利于操作。 固定的注意事項 (1)固定的材料越新鮮

9、越好。因此，采集或割取后須立 即投入預先準備好的固定液中進行固定，切勿耽誤。 (2)材料大小以直徑不超過5mm為宜，材料與固定液的比例為 1:20。 (3)根據(jù)材料的性質(zhì)和制片的目的選擇固定液。 (4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物質(zhì)，則可用含有酒精的固定液固定。 (5)含有氣泡的材料投入團定液后，材料不會下沉，故須將氣泡抽出使材料下沉。最簡易的抽氣方法是將材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽動幾次。也小用抽氣裝置進行抽氣。 (6)固定時，要防止材料變形。 (7)外有被膜，而內(nèi)部站構(gòu)又極易松散的器官，應將整個器官投入固定液22h后，再將其修成小塊材料繼續(xù)則定。 (8)含

10、行粘液、污物或血液的材料需用生理鹽水洗凈后再行固定。 (9)材料投入固定液后須經(jīng)常搖晃。 (10) 容器外需貼標簽。 常用的固定液福爾馬林醋酸酒精混合固定液（FAA液） 是植物制片技術(shù)中較為良好的固定液和保存液。除單細胞和絲狀藻類外，均可用此液固定也通用于昆蟲和甲殼類的固定。 FAA液配方： 福爾馬林 5m1 冰醋酸 5m1 50或70酒精 90m1 一般固定根、莖、葉、花藥、子房組織切片。 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，防止材料收縮； 加入5%甘油可防固定液蒸發(fā)和材料變硬 預染色 脫水脫水 脫水是用一種即能與水又能與透明液混合的液體來逐漸置換樣品中游離的水。 現(xiàn)采用的脫水劑一般是丙酮或

11、乙醇進行梯度脫水，脫水的時間，可根據(jù)組織的類型，大小而定。 脫水的過程：一般是30%乙醇50%乙醇70%乙醇80%90%100% 100% 脫水應逐步而不應跨越太大進行，否則將引起組織強烈的收縮或變形，在經(jīng)無水乙醇處理時，應保證試劑的純度。無水酒精往往會含有水分，因此最好能檢測一下試劑的純度?？梢杂靡后w比重計來測定，也可以將幾毫升酒精滴入幾毫升二甲苯或甲苯， 如果混合液出現(xiàn)混濁就表示酒精中至少含有2的水分。 透明透明 透明是用一種即能與乙醇又能與包埋介質(zhì)互溶的液體來置換樣品中的乙醇，從而為最終的包埋創(chuàng)造一個有利的條件。 現(xiàn)采用的透明劑一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。 其過程為： 1/3二甲苯+2/

12、3乙醇混合液1/2二甲苯+1/2乙醇混合液2/3二甲苯+1/3乙醇混合液二甲苯二甲苯 二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強，溶解石蠟量大，又易揮發(fā)的優(yōu)點，其缺點是易使組織收縮，變硬，變脆，因此透明時間應根據(jù)組織塊大小及質(zhì)地酌情而定。 滲蠟滲蠟 將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，不斷提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置換了組織塊中的透明劑，便于今后的包理與切片。 石蠟有液態(tài)與固態(tài)二種，滲蠟要在恒定溫箱（60c）中進行，以保證石蠟處于液態(tài)中。 包埋包埋 樣品經(jīng)石蠟滲透后，其內(nèi)部間隙已完全被石蠟占據(jù)，此時還需要用同種硬度的石蠟 包埋成蠟塊以利于后邊的切片，包埋可用相同的器具，也可

13、折疊一牛皮紙盒。 將液態(tài)石蠟緩緩倒入紙盒中，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入紙盒，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢。 至此，一塊組織已完成前處理過程，可以切片，前邊的步驟看來既無高深的理論，又無復雜的技術(shù)，一切看似簡單，但一步做不到都會造成整個制片的前功盡棄。我們可以看到： 水和酒精可以相溶。 酒精和二甲苯相溶。 二甲苯和石蠟可以相溶。 因為以上相鄰步驟所使用的液體均可以互溶，所以保證每一步驟液體能置換完全。 水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蠟不能相溶，所以如果有一個步驟的處理不徹底，殘留的液體帶到下一個步驟將不能互溶，最終帶到滲蠟步驟中，成為細小的空洞，以至不能成為質(zhì)地致密的石蠟塊，也就切不

14、成良好的切片。切片切片修塊： 切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周圍的石蠟相等。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺上，以便于固定在切片機上。切片：一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動切片機，切片的蠟片連成一長條蠟帶。切下的蠟帶放在一干凈黑紙上。貼片：用小刀根據(jù)需要切成數(shù)段，分別用粘片劑貼在干凈載玻片上。在恒溫展片臺上展平，烘干。 貼片貼片指用黏貼劑把切片平鋪貼在載玻片上，以便于染色和觀察。常用的粘片劑有下列二種：(1) 明膠黏片劑(2) 蛋清黏片劑 1: 1的蛋清與甘油 在干凈的載玻片上涂粘片劑、加水2-3滴，將檢查過的蠟帶放置其上，并將載玻片移至燙片箱上

15、，溫度為40口左右。干片，40口烘箱烘干2天。染料、染色液染料必須具備兩個條件： 要具有顏色 和被染物體之間具有親和力。 如果只有顏色而與被染物體之間無親和力，那只能是顏料或合色物質(zhì)，而不是染料。染料的顏色和親和力都是由分子結(jié)構(gòu)決定的，即由產(chǎn)生顏色的發(fā)色團和與組織產(chǎn)生親和力的助色團所決定。 發(fā)色團：能使染料分子產(chǎn)生顏色的原子團稱為發(fā)色團，也就是能吸收一定波長的光線并因之而呈現(xiàn)顏色的化學結(jié)構(gòu)。 助色團：能使染料對織物纖維或組織成分產(chǎn)生親和力的原子團稱為助色團，也就是使化合物具有成鹽性質(zhì)的原子團。 染色染色染色劑的分類 根據(jù)來源分 (l)天然染色劑 此類染色劑是從動、植物體中提取的，為天然產(chǎn)物，產(chǎn)

16、量少。目前常用的有蘇木精、洋紅、地衣紅和靛藍等。其中最常用的為蘇木精和洋紅。 (2)合成染色劑 全是由芳香環(huán)或具有芳香性的雜環(huán)化合物所構(gòu)成。最早是由煤焦油蒸餾產(chǎn)物合成而得的，所以又稱為煤焦油染料。 除上述兩類外，在生物染色中還使用一些無機化合物，如硝酸銀、氯化金、鋨酸等。 根據(jù)染色劑的化學性質(zhì)分 堿性染色劑、酸性染色劑和中性染色劑。 堿性、酸性和中性染色劑都是由一種酸和一種堿所構(gòu)成的鹽類。 堿性染色劑和酸性染色劑的主要區(qū)別，就在于染色劑的主要有色部分是陽離子還是陰離子。若染色劑電離后，其分子的主要部分成陽離子為堿性染色劑若電離后，其分子的主要部分為陰離子即為酸性染色劑。 名詞： 1、嗜堿性：細

17、胞和組織的酸性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)與堿性染料（如蘇木精）親合力強，稱嗜堿性。 2、嗜酸性：堿性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)與酸性染料（如伊紅）親合力強，稱嗜酸性。 3、中性：若與兩種染料的親合力均不強的。 4、親銀性：銀染法中有些組織結(jié)構(gòu)可直接使硝酸銀還原而顯示，稱此為親銀性。 5、嗜銀性：有些結(jié)構(gòu)無直接還原作用，需加入還原劑方能顯色，稱此為嗜銀性。 6、異染性：有些組織成分如結(jié)締組織和軟骨基質(zhì)中的糖氨多糖，當用甲苯胺藍等堿性染料染色后呈紫紅色，這種現(xiàn)象稱為異染性。根據(jù)用途分 (l)細胞核染色劑 用于細胞核的染色劑有天然染色劑的蘇木精、洋紅以及合成染色劑中的番紅、結(jié)品紫、硫堇、甲苯胺藍、甲基綠、美藍、孔雀綠和焦油紫等。

18、(2)細胞質(zhì)染色劑 用于細胞質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的曙紅、亮綠、橘黃G、酸性品紅、苦味酸和水溶性苯胺藍等。 （3）脂質(zhì)染色劑 用于顯示脂質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的蘇丹III、蘇丹Iv、硫酸尼羅藍及油紅等。 細胞壁的染料酸性品紅 番紅 固綠 甲苯胺藍 蘇木精 結(jié)晶紫 亮綠 蘇丹IV細胞核染料（堿性） 堿性品紅 蘇木精 洋紅 番紅 地衣紅 結(jié)晶紫 甲苯胺藍細胞質(zhì)染料（酸性） 酸性品紅 曙紅 固綠 苦味酸 伊紅各種熒光染料染色原則：先用堿性染料染再用酸性染料染染色原理 有關(guān)染色的理論至今是一個并末完全清楚的很復雜的問題。目前一般還是從物理和化學的作用來解釋各種組織或細胞的染色現(xiàn)象。染色的物理作用

19、此理論認為組織細胞的染色是以物理作用為基礎的，主要是依靠下列三種物理作用的一種或全部，使染色劑進入組織或細胞內(nèi)。 (1)毛細管作用及滲透作用，但染色劑與組織細胞沒有牢固的結(jié)合 (2)吸收作用，又稱溶解學說。這種學說認為組織細胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。組織吸收染色劑，作牢固的結(jié)合。組織的著色與溶液的顏色相同，但不一定和干燥染色劑的顏色相同。 例如，品紅溶液為紅色，所染組織也為紅色，而干燥的品紅則為綠色。蘇丹類染色劑使脂質(zhì)著色，是一種溶解現(xiàn)象。因為蘇丹類染色劑在脂質(zhì)中的溶解度大于在酒精等溶劑中的溶解度。當蘇丹類的酒精溶液與組織細胞中的脂質(zhì)接觸時染色劑就從酒精中溶解到脂質(zhì)中，從而使其著色。

20、 (3)吸附作用 吸附作用是固體物質(zhì)的特性，即較大的物體能從周圍溶液(染液)中吸附一些小顆粒(化合物或離子)到自身的特性。細胞中各種蛋白質(zhì)或膠體有不同的吸附面，因此能選擇性地吸收不同的離子，即某種蛋白質(zhì)對某種染色劑有吸附作用,而對別種染色劑無吸附作用，這就可以解釋鑒別染色現(xiàn)象。 染色的化學作用 化學作用的主要理論根據(jù)是染色劑的性質(zhì)可分為酸性、堿性和中性染色劑，而動、植物的細胞內(nèi)般也可區(qū)分為酸性(陰離子)和堿性(陽離子)部分。當堿性染色劑溶液中的有色部分成為陽離子時，就能與細胞的陰離子(酸件部分)較牢固地結(jié)合，當酸性染色劑溶液中的有色部分成為陰離子時，就能與細胞內(nèi)的陽離子(堿性部分)較牢固地結(jié)合

21、。 例如，細胞核，尤其是核內(nèi)的染色質(zhì)，主要由核酸組成，是酸性的組成成分故和堿性染色劑(蘇木精)的親和力很強，易于著色。細胞質(zhì)含堿性物質(zhì)，故和酸性染色劑(曙紅)的親和力很大，易于著色。所以，在蘇木精曙紅(H.E)染色中，細胞核被堿性染色劑蘇木精所染，細胞質(zhì)被酸性染色劑曙紅所染。這也就是細胞核是嗜堿性的，細胞質(zhì)是嗜酸性的。除染色質(zhì)外，粘液和軟骨的基質(zhì)等都是嗜堿性的，細胞質(zhì)內(nèi)含的某些顆粒也為嗜酸性。須注意的是嗜堿性和嗜酸性是相對而不是絕對的，若細胞在堿性染色劑溶液中停留過久，則細胞質(zhì)也可染上堿性染色劑的顏色。某些細胞(如血細胞）具有特殊性質(zhì)，能和中性染色劑發(fā)生親和力而結(jié)合。 由此可見，細胞各成分的染

22、色強弱是與細胞成分及染色劑的性質(zhì)有密切關(guān)系：兩者之間的親和力強，染色就深；親和力弱或無，染色也就淺或無。 但是，染色的實際情況是極為復雜的，組織細胞的染色作用，還隨所用溶液的pH值而變動。 染色劑和染色液的配制 Deiafield氏蘇木精 蘇木精 4g 無水酒精 25ml 10銨明礬(硫酸鋁銨)水溶液 400m1 配制時先將蘇木精溶于無水酒精，待先全溶解后加入10銨明礬水溶液，充分攪動混合后，注入細口瓶內(nèi)，瓶口用紗布封住。然后將瓶置于溫暖有光處34天后過濾，濾后再加入100 m1甘油和100ml甲醇，混合均勻后，瓶口仍用紗布封口，再置于光線充足處12月使之成熟。待顏色變成紫褐色時即為成熟。成熟

23、后過濾，塞緊瓶口置于陰涼處貯存， 可長期保存，多年不壞。此液著色力較強，染數(shù)分鐘即可。也可用染液l份加蒸餾水35份稀釋后使用，染色時間需延長一至數(shù)小時。此液染細胞核及嗜堿顆粒效果良好。染植物細胞的纖維壁比用其它任何染液著色更好。 切片可用不同方法，使其干燥，然后進行染色。因為每一張載片上粘貼的是蠟帶，因此必須先用二甲苯去除石蠟再用酒精去除二甲苯，再進入水中，才能染色，染色的方法很多，要根據(jù)每張標本要求顯示的目的選擇不同的染劑，最常用的是蘇木精-伊紅染色（簡稱 H.E 染色）。蘇木精使細胞核顯深紫色，伊紅使細胞質(zhì)顯粉紅色，以此顯示清晰的細胞形態(tài)和核的大小，位置，染色后再根據(jù)制片的基本原理，使帶水

24、的載片經(jīng)歷脫水透明步驟最后用樹膠封片。蘇木精蘇木精（hematoxylin）：）：細胞核和胞質(zhì)內(nèi)的嗜細胞核和胞質(zhì)內(nèi)的嗜 堿性物質(zhì)著藍紫色堿性物質(zhì)著藍紫色 。 伊紅伊紅（eosin）：）：細胞質(zhì)基質(zhì)和間質(zhì)內(nèi)的膠細胞質(zhì)基質(zhì)和間質(zhì)內(nèi)的膠 原纖維等著紅色。原纖維等著紅色。 H.EH.EH.E染色：蘇木精（染色：蘇木精（HematoxylinHematoxylin）伊紅（）伊紅（EosinEosin）染色）染色堿性染料堿性染料將嗜堿性物質(zhì)（本將嗜堿性物質(zhì)（本身酸性）染成藍色身酸性）染成藍色酸性染料酸性染料將嗜酸性物質(zhì)（本將嗜酸性物質(zhì)（本身堿性）染成紅色身堿性）染成紅色細胞核中的細胞核中的DNADNA、R

25、NARNA細胞質(zhì)中的細胞質(zhì)中的RNARNA細胞質(zhì)、膜性結(jié)構(gòu)細胞質(zhì)、膜性結(jié)構(gòu)（線粒體、溶酶體、（線粒體、溶酶體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）染色方法染色方法現(xiàn)現(xiàn) 象象番紅固綠對染法番紅固綠對染法木質(zhì)化的細胞壁及細胞核木質(zhì)化的細胞壁及細胞核紅紅纖維素的細胞壁及細胞壁纖維素的細胞壁及細胞壁綠綠鐵礬蘇木精法鐵礬蘇木精法細胞一般結(jié)構(gòu)及細胞分裂時期細胞一般結(jié)構(gòu)及細胞分裂時期的優(yōu)良染劑，細胞分裂時期的的優(yōu)良染劑，細胞分裂時期的染色體染成染色體染成黑色黑色高碘酸席夫反應法高碘酸席夫反應法（PAS法）法）植物組織染成不同程度的紅色，植物組織染成不同程度的紅色，可將纖維素細胞壁及淀粉粒染可將纖維素細胞壁及淀粉粒染成成

26、紅色紅色天然染料天然染料 1、蘇木精（、蘇木精（Hematoxylin） 蘇木精是從南美的蘇木（蘇木精是從南美的蘇木（Haematoxylon campechianum）干枝中用乙醚浸制出來的一種色素，是最常用的染）干枝中用乙醚浸制出來的一種色素，是最常用的染料之料之 一。蘇木精不能直接染色，必須暴露在通氣的地方，使他變成氧化蘇木精（又叫蘇木素）后才能使用，這叫做一。蘇木精不能直接染色，必須暴露在通氣的地方，使他變成氧化蘇木精（又叫蘇木素）后才能使用，這叫做“成熟成熟”。蘇木精的。蘇木精的“成熟成熟”過程需時較長，配置后時間愈久，染色力愈強。被染材料必須經(jīng)金屬鹽作媒劑作用后才有著色力。所以在配

27、制蘇木精染劑時都要過程需時較長，配置后時間愈久，染色力愈強。被染材料必須經(jīng)金屬鹽作媒劑作用后才有著色力。所以在配制蘇木精染劑時都要用媒染劑。常用的媒染劑有硫酸鋁按、鉀明礬和鐵明礬等。蘇木精是淡黃色到銹紫色的結(jié)晶體，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染細胞用媒染劑。常用的媒染劑有硫酸鋁按、鉀明礬和鐵明礬等。蘇木精是淡黃色到銹紫色的結(jié)晶體，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染細胞核的優(yōu)良材料，他能把細胞中不同的結(jié)構(gòu)分化出各種不同的顏色。分化時組織所染的顏色因處理的情況而異，用酸性溶液（如鹽酸核的優(yōu)良材料，他能把細胞中不同的結(jié)構(gòu)分化出各種不同的顏色。分化時組織所染的顏色因處理的情況而異，用酸性溶液（如鹽酸酒

28、精）酒精）分化后呈紅色，水洗后仍恢復青藍色，用堿性溶液（如氨水）分化后呈藍色，水洗后呈藍黑色。分化后呈紅色，水洗后仍恢復青藍色，用堿性溶液（如氨水）分化后呈藍色，水洗后呈藍黑色。 2、洋紅（、洋紅（Carmine） 洋紅又叫胭脂紅或卡紅。一種熱帶產(chǎn)的雌性胭脂蟲干燥后，磨成粉末，提取出胭脂紅，再用明礬處理，除去其中雜洋紅又叫胭脂紅或卡紅。一種熱帶產(chǎn)的雌性胭脂蟲干燥后，磨成粉末，提取出胭脂紅，再用明礬處理，除去其中雜質(zhì)，就制成洋紅。單純的洋紅不能染色，要經(jīng)酸性或堿性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，堿性溶液有氨水、硼質(zhì)，就制成洋紅。單純的洋紅不能染色，要經(jīng)酸性或堿性溶液溶解后才能

29、染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，堿性溶液有氨水、硼砂等。洋紅使細胞核的優(yōu)良染料，染色的標本不易褪色。用作切片或組織塊染都適宜，尤其適宜于小型材料的整體染色。用洋紅配成的溶砂等。洋紅使細胞核的優(yōu)良染料，染色的標本不易褪色。用作切片或組織塊染都適宜，尤其適宜于小型材料的整體染色。用洋紅配成的溶液染色后能保持幾年。洋紅溶液出現(xiàn)渾濁時要過濾后再用。液染色后能保持幾年。洋紅溶液出現(xiàn)渾濁時要過濾后再用。 3、靛藍洋紅（、靛藍洋紅（Indigo carmine） 是由木藍（是由木藍（Indigofera）提出的靛藍（）提出的靛藍（Indigo）加上亞硫酸鈉而成。為藍色酸性染料，作為細胞質(zhì)的染色）加上亞

30、硫酸鈉而成。為藍色酸性染料，作為細胞質(zhì)的染色劑。常與苦味酸合成苦味酸靛藍洋紅（劑。常與苦味酸合成苦味酸靛藍洋紅（picro-indigo-carmine），呈綠色，可與堿性品紅作對比染色。），呈綠色，可與堿性品紅作對比染色。 4、地衣紅（、地衣紅（Orcein） 是由地衣（是由地衣（Lecanora parella）中取得的染料，可在酸性或堿性溶液中染色。植物細胞學中應用較多，尤其對于某些）中取得的染料，可在酸性或堿性溶液中染色。植物細胞學中應用較多，尤其對于某些植物的染色體染色，效果比醋酸洋紅更好。配制方法與洋紅相似，通常也多溶入醋酸中（植物的染色體染色，效果比醋酸洋紅更好。配制方法與洋紅相

31、似，通常也多溶入醋酸中（2.2）染色?，F(xiàn)在已多用其人工合成染料。）染色?，F(xiàn)在已多用其人工合成染料。人工染料人工染料 人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，種類很多，應用極廣。它的缺點是經(jīng)日光照射容易褪色，苯胺藍、亮綠、甲基綠等更易褪色。在制人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，種類很多，應用極廣。它的缺點是經(jīng)日光照射容易褪色，苯胺藍、亮綠、甲基綠等更易褪色。在制片中注意掌握酸堿度，并避免日光直射，也能經(jīng)幾年不褪色。片中注意掌握酸堿度，并避免日光直射，也能經(jīng)幾年不褪色。1、酸性品紅（、酸性品紅（Acid fuchsin） 酸性品紅是酸性染料，呈紅色粉末狀，能容于水，略溶于酒精（酸性品紅是酸性染料，呈紅色

32、粉末狀，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。是良好的細胞制染色劑，在動物）。是良好的細胞制染色劑，在動物制片上應用很廣，在植物制片上用來染皮層、髓部等薄壁細胞和纖維素壁。它跟甲基綠同染，能顯示線粒體。組織切片在染色前先浸在帶制片上應用很廣，在植物制片上用來染皮層、髓部等薄壁細胞和纖維素壁。它跟甲基綠同染，能顯示線粒體。組織切片在染色前先浸在帶酸性的水中，可增強它的染色力。酸性品紅容易跟堿起作用，所以染色過度，易在自來水中褪色。酸性的水中，可增強它的染色力。酸性品紅容易跟堿起作用，所以染色過度，易在自來水中褪色。 2、剛果紅（、剛果紅（Congo red） 剛果紅是酸性染料，呈棗紅色粉末狀，能溶于

33、水喝酒精，遇酸呈藍色。它能作染料，也用作指示劑。它在植物剛果紅是酸性染料，呈棗紅色粉末狀，能溶于水喝酒精，遇酸呈藍色。它能作染料，也用作指示劑。它在植物制片中常作為蘇木精或其他細胞染料的襯墊劑。用來染細胞質(zhì)時，能把膠制或纖維素染成紅色。在動物組織制片中用來染神經(jīng)軸、彈性纖制片中常作為蘇木精或其他細胞染料的襯墊劑。用來染細胞質(zhì)時，能把膠制或纖維素染成紅色。在動物組織制片中用來染神經(jīng)軸、彈性纖維、胚胎材料等。剛果紅可以跟蘇木靜作二重染色，也可用作類淀粉染色，由于它能溶于水和酒精，所以洗滌和脫水處理要迅速。維、胚胎材料等。剛果紅可以跟蘇木靜作二重染色，也可用作類淀粉染色，由于它能溶于水和酒精，所以洗

34、滌和脫水處理要迅速。 3、甲基藍（、甲基藍（Methyl blue） 甲基藍是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基藍在動植物的制片技術(shù)方面應用極廣。它跟伊紅合用能染神經(jīng)細甲基藍是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基藍在動植物的制片技術(shù)方面應用極廣。它跟伊紅合用能染神經(jīng)細胞，也是細菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生動物的活體染色劑。甲基藍極易氧化，因此用它染色后不能長久保存。胞，也是細菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生動物的活體染色劑。甲基藍極易氧化，因此用它染色后不能長久保存。 4、固綠（、固綠（Fast green） 固綠是酸性染料，能溶于水（溶解度為固綠是酸性染料，能溶于水（溶解度為4

35、%）和酒精（溶解度為）和酒精（溶解度為9%）。固綠是一種染含有漿質(zhì)的纖維素細胞組織）。固綠是一種染含有漿質(zhì)的纖維素細胞組織的染色劑，在染細胞和植物組織上應用極廣。它和蘇木精、番紅并列為植物組織學上三中最常用的染料。的染色劑，在染細胞和植物組織上應用極廣。它和蘇木精、番紅并列為植物組織學上三中最常用的染料。5苯胺藍（苯胺藍（Aniline blue） 是一種混合酸性染料，平常所用很難有一定的標準。此染料一般很難溶于水，也不易溶于酒精（是一種混合酸性染料，平常所用很難有一定的標準。此染料一般很難溶于水，也不易溶于酒精（1.5）。植物制片）。植物制片中可與番紅合用，作為組織染色；也可作藻類植物染色。

36、因為這種染料的成分很不一致，染色效果不易掌握。中可與番紅合用，作為組織染色；也可作藻類植物染色。因為這種染料的成分很不一致，染色效果不易掌握。6、蘇丹、蘇丹 （Sudan ） 蘇丹蘇丹是弱酸性染料，不溶解于水，呈紅色粉末狀，易溶于脂肪和酒精（溶解度為是弱酸性染料，不溶解于水，呈紅色粉末狀，易溶于脂肪和酒精（溶解度為0.15%）。常用）。常用70酒精中的飽和溶酒精中的飽和溶液。蘇丹液。蘇丹是脂肪染色劑。是脂肪染色劑。7、蘇丹、蘇丹 （Sudan ） 蘇丹蘇丹是弱酸性染料，也是很好的染脂肪染料，現(xiàn)在多用以代替蘇丹是弱酸性染料，也是很好的染脂肪染料，現(xiàn)在多用以代替蘇丹，可染樹脂、乳汁管、蠟質(zhì)以及角質(zhì)

37、等結(jié)構(gòu)，也，可染樹脂、乳汁管、蠟質(zhì)以及角質(zhì)等結(jié)構(gòu)，也可使葉綠體染成暗紅色。可使葉綠體染成暗紅色。8、伊紅（、伊紅（Eosin） 這類染料種類很多。常用的伊紅這類染料種類很多。常用的伊紅Y，是酸性染料，呈紅色帶藍的小結(jié)晶或棕色粉末狀，溶于水（，是酸性染料，呈紅色帶藍的小結(jié)晶或棕色粉末狀，溶于水（15攝氏度是溶解度達攝氏度是溶解度達44%）和）和酒精（溶于無水酒精的溶解度為酒精（溶于無水酒精的溶解度為2%）。伊紅在動物制片中廣泛應用，是很好的細胞質(zhì)染料，常用作蘇木精的襯染劑。）。伊紅在動物制片中廣泛應用，是很好的細胞質(zhì)染料，常用作蘇木精的襯染劑。9、堿性品（復）紅（、堿性品（復）紅（Basic f

38、uchsin） 堿性品紅是堿性染料，呈暗紅色粉末或結(jié)晶狀，能溶于水（溶解度堿性品紅是堿性染料，呈暗紅色粉末或結(jié)晶狀，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度）和酒精（溶解度8%）。堿性品紅）。堿性品紅在生物學制片中用途很廣，可用來染色膠原纖維、彈性纖維、嗜復紅性顆粒和中樞神經(jīng)組織的核質(zhì)。在生物學制片中用來染維管束植物的木在生物學制片中用途很廣，可用來染色膠原纖維、彈性纖維、嗜復紅性顆粒和中樞神經(jīng)組織的核質(zhì)。在生物學制片中用來染維管束植物的木質(zhì)化壁，又作為原球藻、輪藻的整體染色。在細菌學制片中，長用來鑒別結(jié)核桿菌。在爾根氏反應中用作組織化學試劑，已核查脫氧核糖核質(zhì)化壁，又作為原球藻、輪藻的整體染色。

39、在細菌學制片中，長用來鑒別結(jié)核桿菌。在爾根氏反應中用作組織化學試劑，已核查脫氧核糖核酸。酸。 10、結(jié)晶紫（、結(jié)晶紫（Crystal violet） 結(jié)晶紫是堿性染料，能溶于水（溶解度結(jié)晶紫是堿性染料，能溶于水（溶解度9%）和酒精（溶解度）和酒精（溶解度8.75%）。結(jié)晶紫在細胞學、組織學和細菌學等方面）。結(jié)晶紫在細胞學、組織學和細菌學等方面應用極廣，是一種優(yōu)良的染色劑。它是細胞核染色常用的，用來顯示染色體的中心體，并可染淀粉、纖維蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)等。凡是用番紅和應用極廣，是一種優(yōu)良的染色劑。它是細胞核染色常用的，用來顯示染色體的中心體，并可染淀粉、纖維蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)等。凡是用番紅和蘇木精或其他

40、染料染細胞核不能成功時，用它能得到良好的結(jié)果。用番紅和結(jié)晶紫作染色體的二重染色，染色體染成紅色，紡錘絲染成紫色，蘇木精或其他染料染細胞核不能成功時，用它能得到良好的結(jié)果。用番紅和結(jié)晶紫作染色體的二重染色，染色體染成紅色，紡錘絲染成紫色，所以也是一種顯示細胞分裂的優(yōu)良染色劑。用結(jié)晶紫染纖毛，效果也很好。用結(jié)晶紫染色的切片，缺點是不易長久保存。所以也是一種顯示細胞分裂的優(yōu)良染色劑。用結(jié)晶紫染纖毛，效果也很好。用結(jié)晶紫染色的切片，缺點是不易長久保存。11、龍膽紫、龍膽紫 （Gentian violet） 龍膽紫是混合的堿性染料，主要是結(jié)晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龍膽紫能跟結(jié)晶紫互相替用。醫(yī)藥上

41、用龍膽紫是混合的堿性染料，主要是結(jié)晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龍膽紫能跟結(jié)晶紫互相替用。醫(yī)藥上用的紫藥水，主要成分是甲基紫，需要時能代替龍膽紫和結(jié)晶紫。的紫藥水，主要成分是甲基紫，需要時能代替龍膽紫和結(jié)晶紫。12、中性紅（、中性紅（Neutral red） 中性紅是弱堿性染料，呈紅色粉末狀，能溶于水（溶解度中性紅是弱堿性染料，呈紅色粉末狀，能溶于水（溶解度4%）和酒精（溶解度）和酒精（溶解度1.8%）。它的堿性溶液中呈現(xiàn)黃色，）。它的堿性溶液中呈現(xiàn)黃色，在強堿性溶液中呈藍色，而在弱酸性溶液中呈紅色，所以能用作指示劑。中性紅無毒，常做活體染色的染料，用來染原生動物和顯示動植物在強堿性溶液中呈

42、藍色，而在弱酸性溶液中呈紅色，所以能用作指示劑。中性紅無毒，常做活體染色的染料，用來染原生動物和顯示動植物組織中活細胞的內(nèi)含物等。陳久的中性紅水溶液，用作顯示尼爾體的常用染料。組織中活細胞的內(nèi)含物等。陳久的中性紅水溶液，用作顯示尼爾體的常用染料。13、番紅（、番紅（Safranin） 番紅是堿性染料，能溶于水和酒精。番紅是細胞學和動植物組織學生常用的染料，能染細胞核、染色體和植物蛋白質(zhì)，示番紅是堿性染料，能溶于水和酒精。番紅是細胞學和動植物組織學生常用的染料，能染細胞核、染色體和植物蛋白質(zhì)，示維管束植物木質(zhì)化、木栓化和角質(zhì)化的組織，還能染孢子囊。維管束植物木質(zhì)化、木栓化和角質(zhì)化的組織，還能染孢

43、子囊。14、亞甲藍或美藍（、亞甲藍或美藍（Methylene blue） 亞甲藍或美藍是堿性染料，呈藍色粉末狀，能溶于水（溶解度亞甲藍或美藍是堿性染料，呈藍色粉末狀，能溶于水（溶解度9.5%）和酒精（溶解度）和酒精（溶解度6%）。亞甲藍是動）。亞甲藍是動物學和細胞學染色上十分重要的細胞核染料，其優(yōu)點是染色不會過深。物學和細胞學染色上十分重要的細胞核染料，其優(yōu)點是染色不會過深。15、甲基綠（、甲基綠（methyl green） 甲基綠是堿性染料。它是綠色粉末狀，能溶于水（溶解度甲基綠是堿性染料。它是綠色粉末狀，能溶于水（溶解度8%）和酒精（溶解度）和酒精（溶解度3%）。甲基綠是最有價值的細胞和）

44、。甲基綠是最有價值的細胞和染色劑，細胞學上常用來染染色質(zhì)，跟酸性品紅一起可作植物木質(zhì)部的染色。染色劑，細胞學上常用來染染色質(zhì)，跟酸性品紅一起可作植物木質(zhì)部的染色。16、甲苯胺藍是常用的人工合成染料的一種、甲苯胺藍是常用的人工合成染料的一種,屬于醌亞胺染料類屬于醌亞胺染料類,這類染料一般含有兩個發(fā)色團這類染料一般含有兩個發(fā)色團,一個是胺基一個是胺基,一個是醌型苯環(huán)一個是醌型苯環(huán),來構(gòu)成色原顯色。染來構(gòu)成色原顯色。染料除有發(fā)色團外料除有發(fā)色團外,還要有能使色原對組織及其他被染物產(chǎn)生親和力的原子團即助色。助色團能促使染料產(chǎn)生電離成鹽類還要有能使色原對組織及其他被染物產(chǎn)生親和力的原子團即助色。助色團能

45、促使染料產(chǎn)生電離成鹽類,幫助發(fā)色團對組織產(chǎn)生幫助發(fā)色團對組織產(chǎn)生染色力染色力, 使切片上的組織細胞著色。甲苯胺藍不僅含有兩個發(fā)色團使切片上的組織細胞著色。甲苯胺藍不僅含有兩個發(fā)色團,還含有兩個助色團還含有兩個助色團,為鹼性染料為鹼性染料,甲苯胺藍中的陽離子有染色作用甲苯胺藍中的陽離子有染色作用,組織細胞的組織細胞的酸性物質(zhì)與其中的陽離子相結(jié)合而被染色?？扇炯毎耸怪仕{色；肥大細胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)遇到甲苯胺藍可呈異染酸性物質(zhì)與其中的陽離子相結(jié)合而被染色?？扇炯毎耸怪仕{色；肥大細胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)遇到甲苯胺藍可呈異染性紫紅色，性紫紅色， 封藏封藏 封藏于中

46、性樹膠中，使材料能在顯微鏡下清晰地顯示出來，并能長期保存。 方法：將含材料的載玻片放在吸水紙上（切片一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（必須在二甲苯干燥前進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍微傾斜使其左側(cè)與封藏劑接觸，然后再緩慢地放下，避免產(chǎn)生氣泡。 韭菜根橫切面韭菜根橫切面女貞莖橫切女貞莖橫切面（皮孔）面（皮孔）南瓜莖橫切面局部南瓜莖橫切面局部2、半薄切片技術(shù)、半薄切片技術(shù)觀察細胞最常用的方法是先制作切片，然后用顯微鏡觀察與攝影。以下介紹用低粘性Spurr樹脂包埋植物材料，用半/超薄切片機切片的方法。2.1半薄切片主要步驟半薄切片主要步驟取材取材固定固定漂洗、脫水漂洗、脫水

47、滲透、包埋滲透、包埋半薄切片半薄切片半薄切片染色半薄切片染色每一步都是關(guān)每一步都是關(guān)鍵鍵,任何任何環(huán)節(jié)的環(huán)節(jié)的疏忽疏忽都會導致都會導致制片的制片的失敗失敗2.2 常用固定劑常用固定劑 (1)四氧化鋨四氧化鋨 (OsO4)- OSMIUM TETRAOXIDE 強氧化劑，與氮原子有較強的親和力，可較好的固定強氧化劑，與氮原子有較強的親和力，可較好的固定脂肪、脂肪、蛋白質(zhì)、磷酸脂蛋白蛋白質(zhì)、磷酸脂蛋白；固定變性固定變性DNA及核蛋白，及核蛋白，不能不能固定天然固定天然DNA、RNA及糖原；及糖原；具有具有固定固定和和電子染色電子染色雙重作用，樣品圖象反差較好；雙重作用，樣品圖象反差較好；酶的鈍化劑

48、，不適合細胞化學的固定；酶的鈍化劑，不適合細胞化學的固定；與乙醇與乙醇/醛類反應生產(chǎn)沉淀漂洗醛類反應生產(chǎn)沉淀漂洗分子較大分子較大,滲透速度緩慢滲透速度緩慢,但反應迅速但反應迅速,均勻均勻固定深度固定深度0.25；固定時間一般為固定時間一般為1-2小時小時,時間太長易使組織變脆時間太長易使組織變脆,切片困難；切片困難；鋨酸固定液常用濃度：鋨酸固定液常用濃度：12; 極易揮發(fā)，對粘膜、角膜毒性極大極易揮發(fā)，對粘膜、角膜毒性極大,操作要十分小心操作要十分小心!(2)戊二醛戊二醛 ( C5H8O2)-glutaraldehyde 有效保存組織有效保存組織細微結(jié)構(gòu)細微結(jié)構(gòu),對對蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的固定效果好；

49、的固定效果好；滲透力強滲透力強,滲透速度快滲透速度快,較好的固定較好的固定糖原糖原、核蛋白核蛋白、微管微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和和細胞基質(zhì)細胞基質(zhì)、有絲分裂的紡錘絲有絲分裂的紡錘絲及及胞飲小泡胞飲小泡等；等；保存某些保存某些酶的活力酶的活力,較好保存較好保存抗原抗原,適于細胞化學研究；適于細胞化學研究；對組織和細胞的對組織和細胞的穿透力穿透力比四氧化鋨強，均勻固定深比四氧化鋨強，均勻固定深度度:0.51mm ,04可長時間固定可長時間固定(幾周甚至幾周甚至12個月個月)不會使組織變脆，可用于遠離實驗室的取材不會使組織變脆，可用于遠離實驗室的取材;缺點缺點:不能不能保存脂肪，磷脂固定效果差，對細胞膜的

50、顯示保存脂肪，磷脂固定效果差，對細胞膜的顯示較差，沒有電子染色作用。較差，沒有電子染色作用。 (3)甲醛甲醛-Formaldehyde 滲透組織的能力比戊二醛強，對于致密組織滲透組織的能力比戊二醛強，對于致密組織（種子）固定作用好；（種子）固定作用好；細胞精細結(jié)構(gòu)保存質(zhì)量不如戊二醛，但酶活細胞精細結(jié)構(gòu)保存質(zhì)量不如戊二醛，但酶活性的保存優(yōu)于戊二醛；性的保存優(yōu)于戊二醛；缺點缺點：不能較好的固定細胞基質(zhì)，脫水后大：不能較好的固定細胞基質(zhì)，脫水后大部分細胞基質(zhì)將丟失；部分細胞基質(zhì)將丟失；常用常用多聚甲醛戊二醛多聚甲醛戊二醛的混合固定液。的混合固定液。(4)高錳酸鉀高錳酸鉀強氧化劑，較好固定強氧化劑，較

51、好固定脂蛋白脂蛋白;對對神經(jīng)髓鞘神經(jīng)髓鞘、葉綠體葉綠體及其他各種及其他各種膜結(jié)膜結(jié)構(gòu)構(gòu)的研究均可作為固定劑；的研究均可作為固定劑；只用于某些常用固定劑難以固定的植只用于某些常用固定劑難以固定的植物和酵母樣品，且一般不需要用鋨酸物和酵母樣品，且一般不需要用鋨酸后固定后固定.2.3漂洗漂洗漂洗的目的漂洗的目的:組織固定后脫水前的漂洗組織固定后脫水前的漂洗: 清除殘留固定劑清除殘留固定劑,減小固定劑和脫水劑之間減小固定劑和脫水劑之間的反應，避免沉淀物干擾超微結(jié)構(gòu)的觀察的反應，避免沉淀物干擾超微結(jié)構(gòu)的觀察.雙重固定中雙重固定中,在鋨酸固定前的漂洗在鋨酸固定前的漂洗: 避免鋨酸與戊二醛反應生成細小而致密

52、的避免鋨酸與戊二醛反應生成細小而致密的餓沉淀，破壞細胞結(jié)構(gòu)餓沉淀，破壞細胞結(jié)構(gòu).常常 用用 緩沖液緩沖液優(yōu)優(yōu) 點點缺缺 點點 pH磷酸鹽磷酸鹽緩沖液緩沖液對細胞無毒性作用對細胞無毒性作用,緩沖能力強緩沖能力強固定時易產(chǎn)生固定時易產(chǎn)生沉淀沉淀,易長細菌易長細菌植物材植物材料一般料一般6.87.2二甲砷二甲砷酸鹽緩酸鹽緩沖液沖液不易長細菌不易長細菌,與低與低濃度鈣質(zhì)濃度鈣質(zhì)1-3mM不發(fā)生沉淀反應不發(fā)生沉淀反應有毒有毒(通風櫥通風櫥)醋酸醋酸巴比妥巴比妥緩沖液緩沖液固定時不產(chǎn)生沉淀固定時不產(chǎn)生沉淀易長細菌易長細菌,只適只適于配鋨酸固定于配鋨酸固定液液,不適合配醛不適合配醛類類(緩沖失效緩沖失效)二

53、甲基砷酸鈉緩沖液配制： 此液配制比較簡單，比較穩(wěn)定，能保存，不易被細菌污染；但有一定的毒性，配制時要小心，應在防護罩內(nèi)進行配制。盡量不使試劑與皮膚直接接觸，避免呼吸道吸入。另外，由于二甲砷酸鹽不像磷酸鹽那樣會和鉛試劑起反應產(chǎn)生沉淀，因此在細胞化學中使用普遍。常用濃度為0.1mol/L。配方如下：A液（0.4mol/L 二甲砷酸鈉貯存液）： Na(CH3)2ASO23H2O 8.65g 加雙蒸水至100 mLB液(0.2mol/L 鹽酸溶液)： HCl(36%-38%) 1mL: 加雙蒸水到60 mL 取25mL A液、3-4mL B液混合，測pH，可用B液調(diào)整pH值到7.2左右，再加雙蒸水到5

54、0mL，配成的二甲砷酸鈉濃度為0.2mol/L。在配制固定液時也應稀釋到0.1mol/L。最后配成的固定液中加1-3 mmol/L的鈣離子，可使結(jié)構(gòu)保存更好。 多聚甲醛戊二醛固定液配制： 取2g多聚甲醛粉末溶于21mL蒸餾水，65下不斷攪拌，加13滴1N氫氧化鈉，使溶液透明，冷卻后加25%戊二醛4mL，加二甲基砷酸鈉緩沖液（0.2mol/L，pH7.2）使總體積到50mL，并加25mg無水氯化鈣。混合液的pH為7.2。本液對微管有良好的保存作用。 后固定液：1OsO4溶液 OsO4：0.5g，0.1mol/L二甲砷酸鈉緩沖液：50mL OsO4一般為0.5或1克安瓶中封閉包裝，配制時剝?nèi)ド虡耍?/p>

55、用自來水洗凈，放洗滌液中泡412小時后用水沖洗，在安瓶上劃痕，用蒸餾水洗凈，投入茶色瓶中，加緩沖液，用玻璃棒在瓶中搗碎，輕輕搖動放冰箱中，48小時后完全溶解。此藥蒸氣對人眼、角膜、鼻腔和口腔粘膜有固定作用，用時特別小心，在通風櫥內(nèi)操作?？ㄖZ固定液卡諾固定液 12純酒精15ml30ml 氯仿5ml 冰醋酸5ml1ml滲透迅速，固定根尖和花藥只需滲透迅速，固定根尖和花藥只需30-60分鐘，分鐘，但固定時間不能太久，一般不超過一天但固定時間不能太久，一般不超過一天Spurr樹脂是由四種試劑按比例配制而成(表1)表表1 Spurr1 Spurr樹脂常用的配方樹脂常用的配方其中可塑劑的用量調(diào)節(jié)包埋塊的硬

56、度。其中可塑劑的用量調(diào)節(jié)包埋塊的硬度。2. Spurr2. Spurr樹脂的配制樹脂的配制 配制時，盛樹脂的燒杯放在電子天平上，按表中試劑的序順，邊滴入試劑邊稱量，每加入一種試劑要充分攪拌后再加另一種試劑。 盛樹脂的燒杯要烘干，樹脂配制好后，盛樹脂的燒杯要用塑料紙封口，防止樹脂吸濕。樹脂要隨配隨用，配制好樹脂只能在冰箱中存放2天。 通常每一個樣品需要用45ml樹脂，按樣品數(shù)計算總量，分二次配制，一次在浸滲開始時配制，另一次在最后一次更換純樹脂時配制1. 1.材料的固定材料的固定固定是制片的第一步，它的主要目的是將植物細胞迅速殺死及固定。固定劑都是蛋白質(zhì)凝固劑。凝固性固定劑：凝固性固定劑：破壞結(jié)

57、構(gòu)。破壞結(jié)構(gòu)。甲醇、乙醇、甲醇、乙醇、丙酮、三氯醋酸、氯仿等丙酮、三氯醋酸、氯仿等非凝固性固定劑：非凝固性固定劑：破壞結(jié)構(gòu)少。破壞結(jié)構(gòu)少。戊二醛、戊二醛、甲醛、鋨酸、醋酸、重酪酸鉀等甲醛、鋨酸、醋酸、重酪酸鉀等戊二醛：戊二醛：最常用的固定劑，還原劑。它能與蛋白質(zhì)分最常用的固定劑，還原劑。它能與蛋白質(zhì)分子的氨基和肽鍵交連，保持細胞結(jié)構(gòu)和某些酶活性。子的氨基和肽鍵交連，保持細胞結(jié)構(gòu)和某些酶活性。鋨酸：鋨酸：很好的固定劑，強氧化劑。不但能固定蛋白質(zhì)，很好的固定劑，強氧化劑。不但能固定蛋白質(zhì)，還能對脂類固定，因而能固定膜結(jié)構(gòu)。還能對脂類固定，因而能固定膜結(jié)構(gòu)。吸去管瓶中的前固定液，加入12ml緩沖液于

58、管瓶，將管瓶放在振蕩機上低速振蕩，10min后吸去緩沖液。共清洗3次，每次10min。清洗后，管瓶中加入0.5ml后固定液。振蕩固定3h左右，使固定材料逐漸變黑。后固定過程也可在冰箱中進行(即過夜)。根據(jù)固定樣本數(shù)根據(jù)固定樣本數(shù)編寫管瓶號碼。編寫管瓶號碼。用雙面刀片將植物材用雙面刀片將植物材料切成料切成1mm1mm厚的薄片，把薄片放入盛有厚的薄片，把薄片放入盛有1 12ml2ml前固定液的管瓶中，固定時要將管瓶前固定液的管瓶中，固定時要將管瓶蓋蓋緊。將管瓶放在振蕩機上低速振蕩蓋蓋緊。將管瓶放在振蕩機上低速振蕩3h3h左右左右。2. 2.脫水脫水所謂脫水，就是用乙醇或丙酮等有機溶劑浸漬已固定的材

59、料，逐步除去樣品中的水分。(1)用吸管吸去管瓶中的后固定液，用緩沖液或重蒸水清冼管瓶和固定的材料三次，每次10min。(2)用20%、40%、60%、80%、90%、95%的乙醇分別浸漬固定的材料，每種濃度處理2030min。(3)100%乙醇浸漬材料3次，每次30min。3.3.置換置換 指一種溶劑更換另一種溶劑的過程。 (1)在管瓶中加入2ml無水乙醇和1ml環(huán)氧丙烷(alc:PO7:3)，處理材料10min。(2)向管瓶中追加1ml環(huán)氧丙烷(使alc:PO5:5)，處理材料10min。(3)向管瓶中再追加2ml環(huán)氧丙烷(使alc:PO3:7)，處理材料10min。(4)傾倒出管瓶中的無水

60、乙醇和環(huán)氧丙烷混合液，加入純環(huán)氧丙烷3次，每次10min。在置換過程中管瓶要蓋緊蓋子，一防環(huán)氧丙烷揮發(fā)使樣品干燥，二除空氣中濕氣進入有機溶液。4. 4.浸透浸透 指樹脂替換有機溶劑的過程。 (1)在管瓶中加入1ml環(huán)氧丙烷，向內(nèi)滴入1滴Spurr樹脂，將管瓶放在振蕩機上低速振蕩12h。(2)向管瓶中追加1至數(shù)滴Spurr樹脂，使Spurr樹脂的濃度逐漸提高，每滴加一次Spurr樹脂，振蕩12h，共滴加0.3ml左右的樹脂，使樹脂濃度達到25%左右。(3)用吸管吸去管瓶中0.50.8ml的環(huán)氧丙烷和Spurr樹脂的混合液，然后加入純Spurr樹脂0.5ml，使樹脂濃度達到50%60%左右，振蕩2