免疫比濁法檢測免疫球蛋白

1、免疫比濁法檢測免疫球蛋白免疫學系免疫學系 實驗原理實驗原理免疫濁度法是可溶性抗原、抗體在液相中免疫濁度法是可溶性抗原、抗體在液相中特異結合，產生一定大小的復合物，形成特異結合，產生一定大小的復合物，形成光的折射或吸收，光的折射或吸收，測定這種折射或吸收后測定這種折射或吸收后的透射光或散射光的透射光或散射光作為計算單位。作為計算單位。免免疫疫比比濁濁法法分分類類當一束光當一束光線通過溶線通過溶液受到光液受到光散射和光散射和光吸收兩個吸收兩個因素的影因素的影響而使光響而使光的強度減的強度減弱弱 透射比濁法和散射比濁法光路透射比濁法和散射比濁法光路檢測器檢測器A檢測器檢測器B IC I0 I I 透

2、射比濁法透射比濁法 散射比濁法散射比濁法（一）（一）基本原理基本原理v 是個極其簡單的方法。在抗原過量情況下，與待測是個極其簡單的方法。在抗原過量情況下，與待測樣品中相應的樣品中相應的IgIg發(fā)生抗原發(fā)生抗原- -抗體反應，形成可溶性復合抗體反應，形成可溶性復合物，使反應介質的濁度發(fā)生改變。物，使反應介質的濁度發(fā)生改變。v 測量方法利用分光光度計測量被吸收的量。讀數以測量方法利用分光光度計測量被吸收的量。讀數以吸收單位（吸收單位（A A）或）或ODOD值表示，值表示，A A值反映了入射光和透射光值反映了入射光和透射光的比率。待測物中的比率。待測物中IgIg含量可通過標準曲線計算得出。含量可通過

3、標準曲線計算得出。v 待測樣品中的抗原含量與吸光度呈正比，而與透射待測樣品中的抗原含量與吸光度呈正比，而與透射光呈反比。光呈反比。v 反應在反應在PEGPEG的作用下，加速復合物的形成。的作用下，加速復合物的形成。 透射比濁法測定原理光光 源源誘誘導導劑劑樣品光電計濾光片光源透射比濁法測定原理透射比濁法的缺陷：(1)溶液中存在的抗原抗體復合物分子應足夠大，分子太小則阻擋不了光線的通過。(2)溶液中的抗原抗體復合物的數量要足夠多。如果數量太小，溶液濁度變化太小，對光通量影響不大。(3) 透射比濁是依據透射光減弱的原理來定量的，因此只能測定抗原抗體反應的第二階段，檢測仍需抗原抗體溫育反應時間，檢測

4、時間較長。光通量是每單位時間到達、離開或通過曲面光通量是每單位時間到達、離開或通過曲面的的光能數量光能數量 散射比濁法散射比濁法在入射光的在入射光的一定角度一定角度檢測粒子發(fā)出的散檢測粒子發(fā)出的散射光，射光，散射光的強度與散射光的強度與ICIC的含量呈正比的含量呈正比。散射比濁法測定原理增增 加加 散散 透透 率率 : 660nm 測測 定定 散散 射射 光光聚集聚集形成形成誘導劑誘導劑檢測器 (LED)光電計樣品100 %0 %時間散射光強度（一）（一）基本原理基本原理 是測定抗原抗體結合反應的動態(tài)過程。是測定抗原抗體結合反應的動態(tài)過程。 所謂速率，是在所謂速率，是在單位時間內單位時間內抗原

5、抗體結合形成抗原抗體結合形成 復合物的速度。將各單位時間內形成復合物的復合物的速度。將各單位時間內形成復合物的 速率及測定的散射信號連接在一起，即是動態(tài)速率及測定的散射信號連接在一起，即是動態(tài) 的速率比濁分析。的速率比濁分析。 當儀器測定到某一時當儀器測定到某一時 間內形成速率下降時，間內形成速率下降時， 即出現即出現速率峰速率峰，該峰，該峰 值的高低，即代表所值的高低，即代表所 測抗原的量。測抗原的量。CONCENTRATIONRATE在速率峰基礎上完成的標準曲線在速率峰基礎上完成的標準曲線方法評價：方法評價： 敏感度高敏感度高 快速快速( (不必達平衡）不必達平衡） 抗原抗體結合的動態(tài)測定

6、，理論上測定不抗原抗體結合的動態(tài)測定，理論上測定不受本底散射信號的影響受本底散射信號的影響 可檢測微量樣品可檢測微量樣品2.2.終點散射比濁法終點散射比濁法讓抗原抗體作用一定時間，使其反應讓抗原抗體作用一定時間，使其反應達到平衡達到平衡后，后，測定其測定其ICIC形成的量。形成的量。ICIC的濁度不再受時間的影響的濁度不再受時間的影響，但，但反應反應ICIC聚合產生絮狀沉淀之前，進行濁度測定。聚合產生絮狀沉淀之前，進行濁度測定。散射比濁法散射比濁法的缺陷的缺陷(1)(1)因為是一次性測定光吸收值，沒有考慮每一個因為是一次性測定光吸收值，沒有考慮每一個待測樣本的吸收和散射效果，可測定結果不準待測

7、樣本的吸收和散射效果，可測定結果不準確確(2)(2)測定的仍是抗原抗體反應的第二階段，不適測定的仍是抗原抗體反應的第二階段，不適合快速檢測。合快速檢測。(3) (3) 終點法存在反應本底終點法存在反應本底，測定樣本的含量越低，測定樣本的含量越低本底比例越大，故在微量測定時，本底的干擾本底比例越大，故在微量測定時，本底的干擾是影響準確測定的重要因素。是影響準確測定的重要因素。 影響免疫比濁測定的因素1 1、抗原抗體比例、抗原抗體比例2 2、抗體的質量、抗體的質量 抗體的特異性、效價、親和力抗體的特異性、效價、親和力3 3、反應的溶液、反應的溶液4 4、增濁劑的使用、增濁劑的使用1 1、透射比濁操

8、作簡便，適用于普通的自動生化分析儀、透射比濁操作簡便，適用于普通的自動生化分析儀和普通的分光光度計，幾乎所有的實驗室均能開展。不和普通的分光光度計，幾乎所有的實驗室均能開展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測的周期較長。，檢測的周期較長。2 2、散射比濁的優(yōu)點是靈敏度、精密度均較高，檢測快、散射比濁的優(yōu)點是靈敏度、精密度均較高，檢測快速。其缺點是需特定的分析儀器，試劑價格高。速。其缺點是需特定的分析儀器，試劑價格高。透射比濁法和散射比濁法優(yōu)缺點比較透射比濁法和散射比濁法優(yōu)缺點比較免疫濁度法測定中應注意的問題免疫濁度法測定中應

9、注意的問題1 1、偽濁度的影響、偽濁度的影響 偽濁度形成原因很復雜，主要是抗血清含有非特偽濁度形成原因很復雜，主要是抗血清含有非特異性的交叉反應性雜抗體成分；增濁劑濃度和反應時間異性的交叉反應性雜抗體成分；增濁劑濃度和反應時間掌握不當；樣品本身的濁度處理不當；試劑的污染和變掌握不當；樣品本身的濁度處理不當；試劑的污染和變質；器材尤其是比色杯等不夠清潔等因素。質；器材尤其是比色杯等不夠清潔等因素。2 2、非特異性散射光的影響、非特異性散射光的影響 免疫濁度法經常受內源性光散射的干擾，為避免這免疫濁度法經常受內源性光散射的干擾，為避免這些非特異性光散射的影響，應用透射比濁法時需保證抗些非特異性光散

10、射的影響，應用透射比濁法時需保證抗體組分在體組分在3 3以下，散射比濁法需保證在以下，散射比濁法需保證在 0.50.5以下。以下。 本實驗中應用聚乙二醇的生理特性本實驗中應用聚乙二醇的生理特性 聚乙二醇是聚乙二醇是中性、無毒中性、無毒且具有獨特理化性質和良好的且具有獨特理化性質和良好的生物相溶性的高分子聚合物，生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇即聚乙二醇即PEGPEG具有高具有高度的親水性度的親水性，在水溶液中有較大的水動力學體積，并，在水溶液中有較大的水動力學體積，并且且沒有免疫原性沒有免疫原性。當藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時，。當藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時，可以將其優(yōu)良性質賦予修飾后的藥物分子，可以將其優(yōu)良性質賦予修飾后的藥物分子，改變它們改變它們在水溶液中的生物分配行為和溶解性在水溶液中的生物分配行為和溶解性，在其修飾的藥，在其修飾的藥物周圍產生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟物周圍產生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快消除，并使藥物能被免疫系統(tǒng)的細胞識的代謝中很快消除，并