淀粉酶的麩曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)

1、實(shí)驗(yàn)二 淀粉酶的麩曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)孟坤鵬 學(xué)號(hào)：201213410310542012級(jí) 生物技術(shù)專(zhuān)業(yè) 三班1組摘要：目的：運(yùn)用麩曲固態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)淀粉酶。步驟：孢子懸液的制備，將孢子懸液濃度控制在107個(gè)/ml左右，然后在麩曲固態(tài)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，待其顏色由白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色，背面無(wú)色時(shí)，表明發(fā)酵完成。用蒸餾水將酶與培養(yǎng)基一起溶解離心取上清后及得到酶粗品，運(yùn)用硫酸銨鹽析法進(jìn)行酶的提純，最后進(jìn)行酶活力的測(cè)定。關(guān)鍵詞 固態(tài)發(fā)酵 淀粉酶 硫酸銨鹽析法引言 米曲霉是一類(lèi)產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等。在淀粉酶的作用下將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低

2、分子唐磊，如麥芽糖、葡萄糖等。真菌因其獨(dú)特的生長(zhǎng)、繁殖特點(diǎn)對(duì)生長(zhǎng)條件的適應(yīng)性已成為非常優(yōu)異的農(nóng)業(yè)加工副產(chǎn)物（麩皮）的降解菌和酶制劑生產(chǎn)菌。淀粉是植物最主要的貯藏多糖，也是人和動(dòng)物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉酶屬于水解酶類(lèi)，是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷鍵水解的一類(lèi)酶的統(tǒng)稱(chēng)。此類(lèi)酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。淀粉經(jīng)淀粉酶作用后生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質(zhì)而被機(jī)體利用。固態(tài)發(fā)酵法是微生物在沒(méi)有或基本沒(méi)有游離水的固態(tài)基質(zhì)上的發(fā)酵方式方法，固態(tài)基質(zhì)中氣、液、固三相并存，即多孔性的固態(tài)基質(zhì)中含有水和水不溶性物質(zhì)。硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)，高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可

3、與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)以麩皮為主要的發(fā)酵基質(zhì)，豆粉餅為氮源，將米曲霉接種于富含淀粉的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶。其中，氮源是合成淀粉酶的原料，而淀粉可以誘導(dǎo)產(chǎn)量的增加，利用鹽析沉淀法對(duì)粗酶進(jìn)行分離純化。酶活力測(cè)定：淀粉在淀粉酶的隨機(jī)作用下可以被分解為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，淀粉酶催化產(chǎn)生的還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑 菌種：米曲霉（實(shí)驗(yàn)室提供） 試劑：（1）75乙醇 （2）1L PBS緩沖液配方：pH7.4；磷酸二氫鉀(KH2PO4)：

4、0.27g；磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：1.42g；氯化鈉(NaCl)：8g； 氯化鉀(KCl)0.2g；加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L。 （3） 1%淀粉溶液（稱(chēng)取1克可溶性淀粉，溶于100ml pH5.5檸檬酸緩沖液）； pH5.6的檸檬緩沖液： A液（稱(chēng)取檸檬酸20.01克，溶解后定容至1L） B液（稱(chēng)取檸檬酸鈉29.41克，溶解后定容至1L） 取A液5.5ml、B液14.5ml混勻即為pH5.5檸檬酸緩沖液； 3，5-二硝基水楊酸溶液（稱(chēng)取3，5-二硝基水楊酸1.00克，溶于20ml 1mol/L氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再加入

5、30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾 水稀釋至100ml，蓋緊瓶蓋保存）； 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（稱(chēng)取2克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，小心移入100ml容量瓶中定容）； 磷酸鹽緩沖液（PH6.8） 取0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液250 ml，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118 ml，用水稀釋定容至1000 ml搖勻，即得。 1.2實(shí)驗(yàn)器械 設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、離心機(jī)、水浴裝置，高壓蒸汽滅菌鍋，電子天平、電爐、無(wú)菌操作臺(tái)、721可見(jiàn)光分光光度計(jì) 器皿：試管15個(gè)、玻璃棒2個(gè)、酒精燈1個(gè)、稱(chēng)量紙、膠頭滴管1個(gè)、4個(gè)250ml錐形瓶、精密pH試紙、細(xì)胞計(jì)數(shù)板1個(gè)、蓋玻片3個(gè)、陶瓷缸1個(gè)，1ml移液管2個(gè)

6、、2ml移液管2個(gè)、培養(yǎng)皿8個(gè)、離心管8個(gè)、100ml燒杯2個(gè)、500ml燒杯2個(gè)、1000ml燒杯2個(gè)、膠皮手套1雙、50ml容量瓶1個(gè)、100ml容量瓶2個(gè)、比色皿4個(gè)、10ml量筒1個(gè)、棉繩和報(bào)紙、紗布、棉花、涂布棒1個(gè)、試管架一個(gè)、洗耳球兩個(gè).等1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1孢子懸液的制備1取包子顆粒溶于無(wú)菌水中制得濃度為107個(gè)/ml孢子懸液 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)以確定每毫升孢子數(shù)，方法2： （1）視待測(cè)菌懸液濃度，加無(wú)菌水適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄐ泵嬉话阆♂?00倍），以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。 （2）取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。 （3）將菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)

7、兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過(guò)多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿(mǎn)計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計(jì)數(shù)區(qū)上（不要使計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺(tái)沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計(jì)數(shù)區(qū)深度的升高），然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。 （4）靜置片刻，使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板上，不再隨液體漂移。將血球計(jì)數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺(tái)上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時(shí)應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。 （5）計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)是由16個(gè)大方格組成，按對(duì)角線(xiàn)方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格（即100小格）

8、的菌數(shù)。如果是25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)大方格外，還需數(shù)中央1個(gè)大方格的菌數(shù)（即80個(gè)小格）。為了保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計(jì)數(shù)和漏記，在計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)沉降在格線(xiàn)上的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如菌體位于大方格的雙線(xiàn)上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線(xiàn)不數(shù)下線(xiàn)，數(shù)左線(xiàn)不數(shù)右線(xiàn)，以減少誤差。即位于本格上線(xiàn)和左線(xiàn)上的細(xì)胞計(jì)入本格，本格的下線(xiàn)和右線(xiàn)上的細(xì)胞按規(guī)定計(jì)入相應(yīng)的格中。見(jiàn)右圖：即本格中計(jì)數(shù)細(xì)胞為3個(gè)。（6）每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2-3次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過(guò)大，否則應(yīng)重新操作），按公式計(jì)算出每mL（g）菌懸液所含細(xì)胞數(shù)量。 16格25格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=100小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/100400100

9、00稀釋倍數(shù)25格16格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=80小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/8040010000稀釋倍數(shù)1.3.2制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基（麩曲）制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基（麩曲）配方3：（培養(yǎng)皿） 麩皮8g 豆粉餅2g K2HPO43H2O 0.3% MgSO47H2O 0.1% (NH4)2SO4 1% 水 10ml 自然pH配制方法： 依次稱(chēng)取配方的無(wú)機(jī)藥品，并依次溶解混合，再加入豆粉餅，最后加入麩皮攪拌均勻。分裝到8個(gè)培養(yǎng)基中，壓實(shí)按勻。分裝完成后完成后，高壓滅菌鍋121 滅菌20min。 （三）接種 每個(gè)培養(yǎng)基接1ml（具體量按計(jì)數(shù)結(jié)果來(lái)，大概每個(gè)培養(yǎng)基接107個(gè)）孢子懸液，并用涂布棒涂布均勻

10、。（無(wú)菌操作） 培養(yǎng) 放在恒溫培養(yǎng)箱中30恒溫培養(yǎng)72h（具體時(shí)間根據(jù)米曲霉的生長(zhǎng)狀態(tài)。最佳形態(tài)1.3.3酶的提取分離和純化1、粗酶液的提取4 在發(fā)酵結(jié)束后，在培養(yǎng)基加蒸餾水100ml，搗碎并攪拌均勻，40水浴浸提1h，用無(wú)菌紗布過(guò)濾（或抽濾），然后在5000r/min條件下離心20min,取上清液作為粗酶液。2、淀粉酶的初步分離純化（鹽析沉淀法）硫酸銨鹽析 1）發(fā)酵液上清裝至1支燒杯中。 2）加硫酸銨至燒杯中，對(duì)照25硫酸銨飽和度配置表，使其飽和度60%。在加硫酸銨時(shí)需緩慢的加入，同時(shí)不斷的輕柔攪拌（否則局部濃度過(guò)高會(huì)使酶失活）使硫酸銨完全溶解； 3）室溫靜置2h，出現(xiàn)白色沉淀4）離心，得到

11、沉淀，再用PBS緩沖液沖洗2次，并離心，得到較純的酶。（飽和硫酸銨的配制方法：見(jiàn)附錄一）1.3.4酶活力的測(cè)定5 1.3.4.1、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作取7支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按表1加入試劑：試 劑管 號(hào)123456麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）0.10.20.30.40.50.6蒸餾水（mL）0.90.8070.60.50.4在 50水浴中預(yù)熱 3min 后，加入 2mL 濃度為 1%的淀粉溶液在 50水浴中反應(yīng) 5min，立即加入已在沸水浴中預(yù)熱的 4mL3,5-二硝基水楊酸試劑，搖勻后放入沸水浴中反應(yīng)10min另取 1 支 25mL 的試管，加入 1mL 蒸餾水，同法操作，作空白實(shí)驗(yàn)。在波長(zhǎng)

12、 500nm 處測(cè)定溶液的吸光度6，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)1.3.4.2、淀粉酶液的制備吸取上述制備的淀粉酶10mg，放入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于淀粉酶總活力的測(cè)定。1.3.4.3、酶活力的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)采用的方法是：取樣液，用 pH 6.8的磷酸鹽緩沖液稀釋 5 倍。取稀釋后的酶液 1mL，在 50的水浴中預(yù)熱 3min，立即加入 2mL 1%的淀粉溶液，在 50的水浴中反應(yīng) 5min，立即加入已在沸水浴中預(yù)熱的 4mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，搖勻后放入沸水浴中反應(yīng) 10min，在波長(zhǎng) 500nm 處分別測(cè)定各自的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

13、曲線(xiàn)酶的濃度。本實(shí)驗(yàn)規(guī)定：50時(shí) 5min 內(nèi)水解淀粉釋放 1mg 麥芽糖所需的酶量為 1 個(gè)酶活力單位(U)。計(jì)算酶活力公式為：酶活力單位(U)=C酶V酶n酶式中：C酶酶液中麥芽糖的濃度； V酶提取酶液的總體積； n酶酶液的稀釋倍數(shù)。2. 結(jié)果與分析2.1粗酶液反應(yīng)后吸光度值吸光度值10.02320.02230.024平均值0.0232.2提純后酶液反應(yīng)的吸光度值圖中指針?biāo)笧樘峒兒蟮拿肝舛戎?0.03720.03630.038平均值0.037酶活力單位(U)=C酶V酶n酶=0.165671=1.15922.3固態(tài)發(fā)酵過(guò)程固態(tài)培養(yǎng)第一天固態(tài)培養(yǎng)第二天固態(tài)培養(yǎng)第三天2.4結(jié)果分析通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

14、可知在50時(shí) 5min 內(nèi)水解淀粉釋放 1mg 麥芽糖所需的酶量為 1 個(gè)酶活力單位(U)。其大小為1.1592.此次測(cè)得的酶的活力過(guò)小。其可能原因如下：（1）當(dāng)我們培養(yǎng)基培養(yǎng)到第三天時(shí)通過(guò)照片可以看出，酶還沒(méi)有長(zhǎng)成熟，仍處于生長(zhǎng)階段，所以分泌的淀粉酶可能導(dǎo)致活性不高；（2)在酶提純時(shí)所得到的純酶過(guò)少，在5min內(nèi)不能發(fā)揮很大的作用;（3)硫酸銨鹽析法時(shí)，硫酸銨濃度的控制沒(méi)有經(jīng)過(guò)很好的探究實(shí)驗(yàn)，只是根據(jù)所查文獻(xiàn)配的，所以可能不是最佳的濃度，所以得到的純酶少。3. 思考題3.1酶活力測(cè)定時(shí)為什么要保溫 5min？答;50為淀粉酶反應(yīng)的最適溫度，保溫五分鐘能夠使酶充分與淀粉發(fā)生反應(yīng)。使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確。3.2要使本實(shí)驗(yàn)更精確應(yīng)如何優(yōu)化？ 答：（1）本次實(shí)驗(yàn)中菌種涂布可以更均勻一點(diǎn)； （2）酶活力測(cè)定時(shí)準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，在時(shí)間到達(dá)前要做好下一步準(zhǔn)備，減少誤差； （3）酶活力測(cè)定提前將酶液和淀粉溶液預(yù)熱至50度，避免溫度變化的影響 （4）本次實(shí)驗(yàn)未測(cè)含水率，下次要考慮實(shí)驗(yàn)室條件，及時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)方案做出調(diào)整。 （5）提前做好硫酸銨鹽析法最適濃度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)，使提純達(dá)到更好的純度。 （6）固態(tài)培養(yǎng)時(shí)嚴(yán)格要求：待其顏色由白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色，背面無(wú)色時(shí)，表明發(fā)酵完成。然后再制作孢子懸液。4. 參考文獻(xiàn)1 賀勝英, 王玉雙, 楊云娟等