液相問題解答

1、流動(dòng)相使用前為什么要脫氣？ 流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會(huì)造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。在線真空脫氣法：

2、Agilent1100LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)， 在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。為什么溶劑和樣品要過濾? 溶劑和樣品過濾非常重要，它會(huì)對色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對分析結(jié)果的影響。色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。樣品過濾頭的類型：30mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。13

3、mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格,材料為纖維素。3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格。處理樣品體積為7l。濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機(jī)溶劑。流動(dòng)相： 1、 流動(dòng)相應(yīng)選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過濾后使用，過濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；

4、2、 水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換（一般不超過2天），防止長菌變質(zhì)； 3、 使用雙泵時(shí)，最好不要有機(jī)相與水相直接調(diào)用，這樣可能造成管路氣泡，最好我們根據(jù)自己的需要配制一定濃度的有機(jī)相與水相的混合溶液，再與水相混合調(diào)用4、換流動(dòng)相后，要purge樣品：1、 采用過濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；2、 用流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱的溶劑制備樣品溶液，若為反相柱，則極性比流動(dòng)相大；若為正相柱，則極性比流動(dòng)相小，盡量用流動(dòng)相制備樣品液； 手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的35倍；色譜柱： 1、 使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，如pH值范圍、流動(dòng)相類型等；2、

5、 使用符合要求的流動(dòng)相； 3、 使用保護(hù)柱； 4、 如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。 5、 色譜柱在不使用時(shí)，應(yīng)用甲醇或乙氰沖洗，取下后緊密封閉兩端保存； 6、 不要高壓沖洗柱子； 7、 不要在高溫下長時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱，使用硅膠柱時(shí)還要特別小心流動(dòng)相的PH范圍在28之間；使用過程中注意輕拿輕放。8、上柱時(shí)我們要注意柱子的方向，千萬不要裝反了高效液相色譜法的分類及其分離原理高效液相色譜法分為：液-固色譜法、液-液色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法。1.液-固色譜法（液-固吸附色譜法）固定相是固體吸附劑，它是根據(jù)物質(zhì)在固定相

6、上的吸附作用不同來進(jìn)行分配的。液-固色譜法的作用機(jī)制吸附劑：一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，其表面常存在分散的吸附中心點(diǎn)。流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子X（液相）被流動(dòng)相S帶入色譜柱后，在隨載液流動(dòng)的過程中，發(fā)生如下交換反應(yīng)：X（液相）+nS（吸附）<=>X（吸附）+nS（液相）其作用機(jī)制是溶質(zhì)分子X（液相）和溶劑分子S（液相）對吸附劑活性表面的競爭吸附。吸附反應(yīng)的平衡常數(shù)K為：K值較小：溶劑分子吸附力很強(qiáng)，被吸附的溶質(zhì)分子很少，先流出色譜柱。K值較大：表示該組分分子的吸附能力較強(qiáng)，后流出色譜柱。發(fā)生在吸附劑表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色譜分離的基礎(chǔ)。液-固色譜法的吸附劑和流動(dòng)相常用的液-固色譜

7、吸附劑：薄膜型硅膠、全多孔型硅膠、薄膜型氧化鋁、全多孔型氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。一般規(guī)律：對于固定相而言，非極性分子與極性吸附劑（如硅膠、氧化銅）之間的作用力很弱，分配比k較小，保留時(shí)間較短；但極性分子與極性吸附劑之間的作用力很強(qiáng)，分配比k大，保留時(shí)間長。對流動(dòng)相的基本要求：試樣要能夠溶于流動(dòng)相中流動(dòng)相粘度較小流動(dòng)相不能影響試樣的檢測常用的流動(dòng)相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。液-固色譜法的應(yīng)用常用于分離極性不同的化合物、含有不同類型或不；數(shù)量官能團(tuán)的有機(jī)化合物，以及有機(jī)化合物的不同的異構(gòu)體；但液-固色譜法不宜用于分離同系物，因?yàn)橐?固色譜對不同相對分子質(zhì)量的同系物選擇性不高。2.

8、液-液色譜法（液-液分配色譜法）將液體固定液涂漬在擔(dān)體上作為固定相。液-液色譜法的作用機(jī)制溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配時(shí)，在固定液中溶解度較小的組分較難進(jìn)入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定液中溶解度較大的組分容易進(jìn)入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達(dá)到分離的目的。液-液色譜法與液-液萃取法的基本原理相同，均服從分配定律：K=C固/C液K值大的組分，保留時(shí)間長，后流出色譜柱。正相色譜和反相色譜正相分配色譜用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑（如苯、正己烷等）作流動(dòng)相。反相分配色譜用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑（如水、甲醇、己腈等）作流動(dòng)相。一般地，正相色譜是固定液的極性大于流動(dòng)相的極性，而反

9、相色譜是固定相的極性小于流動(dòng)相的極性。正相色譜適宜于分離極性化合物，反相色譜則適宜于分離非極性或弱極性化合物。液-液色譜法的固定相常用的固定液為有機(jī)液體，如極性的，氧二丙腈（ODPN），非極性的十八烷（ODS）和異二十烷（SQ）等。缺點(diǎn)：涂漬固定液容易被流動(dòng)相沖掉。采用化學(xué)鍵合固定相則可以避免上述缺點(diǎn)。使固定濃與擔(dān)體之間形成化學(xué)鍵，例如在硅膠表面利用硅烷化反應(yīng)：形成Si-O-Si-C型鍵，把固定液的分子結(jié)合到擔(dān)體表面上。優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相無液坑，液層薄，傳質(zhì)速度快，無固定液的流失。固定液上可以結(jié)合不同的官能團(tuán)，改善分離效能。固定液不會(huì)溶于流動(dòng)相，有利于進(jìn)行梯度洗提。液-液色譜法的應(yīng)用液-液色

10、譜法既能分離極性化合物，又能分離非極性化合物，如烷烴、烯烴、芳烴、稠環(huán)、染料、留族等化合物。化合物中取代基的數(shù)目或性質(zhì)不同，或化合物的相對分子質(zhì)量不同，均可以用液-液色譜進(jìn)行分離。3.離子交換色譜法原理：離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的被測離子進(jìn)行可逆交換，由于被測離子在交換劑上具有不同的親和力（作用力）而被分離。離子交換色譜法的作用機(jī)制聚合物的分子骨架上連接著活性基團(tuán)，如：-SO3-，-N（CH3）3+等。為了保持離子交換樹脂的電中性，活性基團(tuán)上帶有電荷數(shù)相同但正、負(fù)號(hào)相反的離子X，稱為反離子?；钚曰鶊F(tuán)上的反離子可以與流動(dòng)相中具有相同電荷的被測離子發(fā)生交

11、換： 離子交換色譜的分配過程是交換與洗脫過程。交換達(dá)到平衡時(shí)： K值越大，保留時(shí)間越長。溶劑和固定相兩種類型：多孔性樹脂與薄殼型樹脂。多孔性樹脂：極小的球型離子交換樹脂，能分離復(fù)雜樣品，進(jìn)樣量較大；缺點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度不高，不能耐受壓力。薄殼型離子交換樹脂：在玻璃微球上涂以薄層的離子交換樹脂，這種樹脂柱效高，當(dāng)流動(dòng)相成分發(fā)生變化時(shí)，不會(huì)膨脹或壓縮；缺點(diǎn)是但柱子容量小，進(jìn)樣量不宜太多。離子交換色譜法的應(yīng)用主要用來分離離子或可離解的化合物，凡是在流動(dòng)相中能夠電離的物質(zhì)都可以用離子交換色譜法進(jìn)行分離。廣泛地應(yīng)用于：無機(jī)離子、有機(jī)化合物和生物物質(zhì)(如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等)的分離。4.凝膚色譜法（空間排阻色

12、譜法）凝膠是一種多孔性的高分子聚合體，表面布滿孔隙，能被流動(dòng)相浸潤，吸附性很小。凝膠色譜法的分離機(jī)制是根據(jù)分子的體積大小和形狀不同而達(dá)到分離目的。凝膠色譜法的作用機(jī)制體積大于凝膠孔隙的分子，由于不能進(jìn)入孔隙而被排阻，直接從表面流過，先流出色譜柱；小分子可以滲入大大小小的凝膠孔隙中而完全不受排阻，然后又從孔隙中出來隨載液流動(dòng)，后流出色譜柱；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介乎上述兩種情況之間。凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進(jìn)行分離的一種色譜分析方法。凝膠色譜法的固定相軟質(zhì)凝膠、半硬質(zhì)凝膠和硬質(zhì)凝膠三種。凝膠色譜法的應(yīng)用特點(diǎn)保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，適宜于分離相對分

13、子質(zhì)量大的化合物，相對分子質(zhì)量在4008×105的任何類型的化合物。保留時(shí)間短，色譜峰窄，容易檢測。固定相與溶質(zhì)分子間的作用力極弱，趁于零，柱的壽命長。不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上時(shí)才能得到分離高效液相色譜的類型（一）吸附色譜在吸附色譜中，樣品的極性官能團(tuán)牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非極性烴基幾乎不予保留。所以，要清楚地辨別極性功能團(tuán)的種類、數(shù)量和位置。通常，樣品能用吸附色譜分離的應(yīng)是能溶解于有機(jī)溶劑并是非離子型的，強(qiáng)離子樣品是不適宜的。吸附色譜所使用的流動(dòng)相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎(chǔ)，按照樣品的極性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的濃度為或

14、更少一些。如有可能，可進(jìn)一步減小百分?jǐn)?shù)。因?yàn)楦邼舛鹊拇紩?huì)減少填料的吸附活性，減弱吸附能力，并使重現(xiàn)困難。（二）分配色譜. 正相分配色譜正相分配色譜適用于不溶于水而溶于有機(jī)溶劑且?guī)в袠O性基團(tuán)的樣品，但正相分配色譜不適合于離子型物質(zhì)。.反相分配色譜這種方法目前應(yīng)用非常廣泛，應(yīng)用的范圍也很廣，在反相分配色譜中，樣品的非極性部分起保留作用。通過使用的流動(dòng)相是水甲醇和水乙腈，通過加入甲醇或乙腈的量的不同來調(diào)節(jié)分離，但如果樣品帶有離子型基團(tuán)，需要在流動(dòng)相中加入鹽或調(diào)節(jié)流動(dòng)相的值，例如，如果樣品有一個(gè) 基團(tuán)，使流動(dòng)相的值是偏向酸性的，由于抑制了基團(tuán)的電離而加強(qiáng)了保留。這個(gè)方法叫離子抑止法，如果樣品有強(qiáng)離子基

15、，有時(shí)候采用在流動(dòng)相中加入適當(dāng)抗衡離子以形成離子對的離子對法。在調(diào)節(jié)值中，保持值在填料說明書手冊中所規(guī)定的范圍內(nèi)，大多數(shù)化學(xué)鍵式的二氧化硅使用在-，然而，當(dāng)加入鹽以后，最好使其.-或更小的，多孔聚合物填料能應(yīng)用非常廣泛的值。（三）離子交換色譜這個(gè)方法是用填料的固定相的離子交換基團(tuán)和樣品的離子基團(tuán)之間的離子交換來分離樣品組分的，按照所交換的離子分成陽離子交換和陰離子交換。離子交換色譜使用于能溶于水的離子型物質(zhì)。在離子交換色譜中，流動(dòng)相的鹽的濃度、及鹽的種類等都對保留值有很大的影響。在高效液相色譜的離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。因?yàn)槁然飼?huì)腐蝕不銹鋼儀器，在高效液相色譜中不能使用或其

16、他的氯化物鹽類。根據(jù)測量波長有些鹽也不能使用，例如，醋酸吸收大約在，當(dāng)檢測處在短波端的時(shí)候，用醋酸作流動(dòng)相是不合適的。（四）凝膠色譜凝膠色譜不同于以上三種分離方法。凝膠色譜是根據(jù)分子大小用分子篩效應(yīng)來分離樣品組分的。這個(gè)方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。具有一定孔徑的多孔性合成聚合物經(jīng)常用作填料。因?yàn)樵跇悠分校〕叽绲姆肿由钌畹貪B透到微孔中，所以遲流出，而大尺寸的分子沒有滲透到微孔中，就很快流出。通常合成樹脂的分離使用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，叫做凝膠滲透色譜。凝膠色譜依樣品的性質(zhì)又可分為凝膠滲透和凝膠過濾。.凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜簡稱GPC。此一類的色譜，使用于有機(jī)性溶媒的樣品中，如PVC，PS，A

17、BS等等，而所用的洗脫液有THF等等。.凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜GFC。此一種類的層析法，使用于水溶媒的試劑中，如蛋白質(zhì)、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、緩沖液等等。凝膠的種類很多，按其原料來源可分為有機(jī)膠和無機(jī)膠。按其制備的方法又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據(jù)凝膠的強(qiáng)度又可分為軟膠、半硬膠和硬膠三大類。根據(jù)它對溶劑的適用范圍又可分為親水性、親油性和兩性凝膠等等。高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程(二) 基本概念和理論一、基本概念和術(shù)語1色譜圖和峰參數(shù)色譜圖(chromatogram)-樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線(elution prof

18、ile)?；€(base line)-經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測器測出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。噪音(noise)-基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過載、檢測器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)-基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會(huì)產(chǎn)生漂移。色譜峰(peak)-組分流經(jīng)檢測器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tail

19、ing peak)。前者少見。拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。中國藥典規(guī)定T應(yīng)為0.951.05。T0.95為前延峰，T1.05為拖尾峰。峰底-基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。峰高(peak height，h)-峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。峰寬（peak width，W)-峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W4半峰寬（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。Wh/22.355標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard devi

20、ation，)-正態(tài)分布曲線x±1時(shí)（拐點(diǎn)）的峰寬之半。正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。峰面積(peak area，A)-峰與峰底所包圍的面積。2定性參數(shù)（保留值）死時(shí)間(dead time，t0)-不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過色譜柱的時(shí)間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時(shí)間。死體積(dead volume，V0)-由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，V

21、m）、柱出口管路體積、檢測器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0F×t0（F為流速）保留時(shí)間(retention time，tR)-從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。保留體積(retention volume，VR)-從進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VRF×tR調(diào)整保留時(shí)間(adjusted retention time，t'R)-扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。也稱折合保留時(shí)間(reduced retention time)。在實(shí)驗(yàn)條件（溫度、固定

22、相等）一定時(shí)，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'RtRt0調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，V'R)-扣除死體積后的保留體積。 3柱效參數(shù)理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)-用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動(dòng)相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖?/p>

23、更易準(zhǔn)確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時(shí)的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用調(diào)整保留時(shí)間(t'R)計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。理論塔板高度(theoretical plate height，H)-每單位柱長的方差。實(shí)際應(yīng)用時(shí)往往用柱長L和理論塔板數(shù)計(jì)算。4相平衡參數(shù)分配系數(shù)(distribution coefficient，K)-在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。 分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)

24、，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。 在條件(流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(shí)(Cs、Cm很小)時(shí)，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。 在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯

25、留時(shí)間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的。容量因子(capacity factor，k)-化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的量之比。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。 容量因子的物理意義：表示一個(gè)組分在固定相中停留的時(shí)間（t'R）是不保留組分保留時(shí)間（t0）的幾倍。k0時(shí)，化合物全部存在于流動(dòng)相中，在固定

26、相中不保留，t'R0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時(shí)間越長。 容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)是：K取決于組分、流動(dòng)相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。選擇性因子(selectivity factor，)-相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。又稱為相對保留時(shí)間（美國藥典）。 要使兩組分得到分離，必須使1。與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)

27、性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。5分離參數(shù)分離度(resolution，R)-相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R。當(dāng)W1W2時(shí)，R。當(dāng)R1時(shí)，稱為4分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R1.5時(shí)，稱為6分離，裸露峰面積為99.7%。R1.5稱為完全分離。 中國藥典規(guī)定R應(yīng)大于1.5。 提高分離度有三種途徑：增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會(huì)延長保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加選擇性。當(dāng)1時(shí)，R0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動(dòng)相的組

28、成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。改變?nèi)萘恳蜃印＿@常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來實(shí)現(xiàn)。k2趨于0時(shí)，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時(shí)間延長，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在110范圍內(nèi)，最好為25，窄徑柱可更小些。高效液相色譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)一、色譜柱1.液相色譜柱的安裝液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的關(guān)鍵所在。(1)、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)： a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。 柱接頭采用低死體積結(jié)

29、構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是316英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化)。716英寸外螺紋與14英寸柱管(6.35mm)連接，中間放置壓壞用于密封。316英寸的內(nèi)螺紋與116英寸(1.57mm)的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在25mm長或其他固定尺寸)。 在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或?yàn)V網(wǎng))，用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失。空柱各組件均為3

30、16#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。 b、柱填料： 液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在310 m的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。 反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在310 m之間。(2)，色譜柱的安

31、裝： a、拆開柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。 b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。 c、 按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱)；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止，再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰14-12圈，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象，請用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰14圈，直至

32、不漏液為止。2、液相色譜柱的使用： 色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。(1)、樣品的前處理： a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。 b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。使用0.45m的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。(2)、流動(dòng)相的配制： 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)： a

33、、流動(dòng)相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。 b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。 c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。 d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。 e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。 f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。(3)、流動(dòng)相流速

34、的選擇：因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1mlmin，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8mlmin為佳。 當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。(4)、從HPLC色譜柱上去除樣品殘余物 因?yàn)闃悠分薪?jīng)常會(huì)含有能夠吸附在色譜柱固定相上的雜質(zhì)化合物，所以應(yīng)該經(jīng)常對色譜柱進(jìn)行清洗或沖洗。當(dāng)色譜柱在多次進(jìn)樣后顯示出柱效降低時(shí)，有必要采用適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相對色譜柱進(jìn)行處理，沖洗除去吸附在固定相

35、上的污染物和樣品殘余物。 方法如下： 將色譜柱從系統(tǒng)上取下，反向連接到輸液泵上。色譜柱出口不要連接到檢測器上，以免污染檢測器流動(dòng)池。 大多數(shù)的硅膠基質(zhì)色譜柱反相沖洗沒有問題，但是聚合物基質(zhì)色譜柱并不能如此操作，在反相沖洗色譜柱之前最后與色譜柱生產(chǎn)商確認(rèn)，反向沖洗流動(dòng)相流速不要太大。 沖洗溶劑的選擇要考慮分析的樣品和使用的流動(dòng)相條件，一般清洗流動(dòng)相強(qiáng)度應(yīng)該比流動(dòng)相更強(qiáng)，但是條件應(yīng)該盡可能的溫和。 A. 用適當(dāng)?shù)娜軇_洗色譜柱的鹽和強(qiáng)添加劑。 B. 用比分析流動(dòng)相更強(qiáng)的溶劑沖洗，該溶劑與流動(dòng)相組成相同但不含鹽和酸。 C. 如果認(rèn)為B布驟沒能完全清洗干凈色譜柱，可用100最強(qiáng)溶劑沖洗。 在清洗色譜柱

36、時(shí)，最好用與流動(dòng)相組成相同的溶劑，但是如果使用其他的溶劑，最重要的是要考慮到溶劑之間的互溶性，另外不要用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿。 3、色譜柱的保養(yǎng) 在正常情況下，色譜柱至少可以使用36個(gè)月，能完成數(shù)百次以上的分離。但是，若操作不慎，將使色譜柱很易損壞而不能使用。因此為了保持柱效、柱容量及滲透性，必須對色譜柱進(jìn)行仔細(xì)地保養(yǎng)。 1 色譜柱極易被微小的顆粒雜質(zhì)培塞，使操作壓力速升高而無法使用，因此必須將流動(dòng)相仔細(xì)地蒸餾或用0.45m孔徑的濾膜過濾。在流動(dòng)相組貯槽與色譜柱間，安裝0.45m孔徑的過濾器。在柱子上端接頭處裝上多孔過濾片，以防止固體顆粒進(jìn)入色譜柱中。在水溶液流動(dòng)相中，細(xì)菌容易生長，可能堵塞篩板加入0.

37、01NoHa能防止能防止細(xì)菌生長。2最好使用進(jìn)祥閥進(jìn)樣，以防止注射器進(jìn)樣時(shí)、注射隔膜碎屑堵塞柱子入口。3對硅膠基鍵合相填科，水溶液流動(dòng)相的PH值不得超出285的范圍，使溫度不宜過高。柱子在酸性或堿性條件下使用之后，。應(yīng)依次用水、甲醇清洗，對暫時(shí)不用而需要較長時(shí)間保存的柱子，要用純甲清洗，柱子兩端用金屬螺帽封閉，保存于干凈的有機(jī)溶劑中。 4 要防止色譜柱被振動(dòng)或撞擊，否則柱內(nèi)填料床層產(chǎn)生裂縫和空隙，會(huì)使色譜峰出現(xiàn)“駝峰”或“對峰”。 5要防止流動(dòng)相逆向流動(dòng)，否則將使固定相層位移，柱效下降。6使用保護(hù)柱。連續(xù)注射含有未被洗脫樣品時(shí)，會(huì)使柱效下降，保留值改變。為了延長柱壽命，在進(jìn)樣閥和分析柱間加上保

38、護(hù)柱，其長度一般為35cm，填充與分析柱性質(zhì)相似的表面多孔型固定相，因此可干法填裝。而且價(jià)廉、更換容易。實(shí)驗(yàn)表明，使用保護(hù)柱后，除了使擴(kuò)為零的組分的塔板數(shù)減少外，其柱效下降很少。4、色譜柱的再生一般情況下，硅膠和ODS等化學(xué)鍵合固定相再生是困難的。有時(shí)，采用下述方法可能提高校效。1 由于雜質(zhì)微粒等因素，使柱上端固定相變色，柱效下降。這時(shí)，可仔細(xì)地將變色部分除去(約3mm左右)，再補(bǔ)充新的固定香。2 當(dāng)色譜柱吸附未被洗脫成分時(shí)，柱效將明顯下降，可選擇合適的溶劑進(jìn)行洗凈。3 對離子交換樹脂柱，先經(jīng)1molL HCI相1mol NaOH溶液洗凈，再以12mol/L NaCl水溶液平衡，以超聲波發(fā)生器

39、進(jìn)行清洗，通?？色@良好的效果。4當(dāng)采用梯度洗脫時(shí)，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生?；€的各種問題 一、基線漂移原因 解決方法1、柱溫波動(dòng)。（即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。）控制好柱子和流動(dòng)相的溫度2、流動(dòng)相不均勻。（流動(dòng)相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。）使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用氦氣。3、流通池被污染或有氣體，用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用鹽酸）4、檢測器出

40、口阻塞。（高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線）取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。5、流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化，更改配比或流速。為避免這個(gè)問題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。6、柱平衡慢，特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)，用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10-20倍體積的新流動(dòng)相對柱子進(jìn)行沖洗。7、流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成，檢查流動(dòng)相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑8、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。 9、使用循環(huán)溶劑，但檢測器未調(diào)整。重新設(shè)定基線。當(dāng)檢測器動(dòng)力學(xué)范圍發(fā)生變化時(shí)，使用新的流動(dòng)相。10、檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處。將波長調(diào)整至最大吸收波長處二、基線噪音（規(guī)則的）原因 解決方法1、在