兒童肺炎支原體四種血清學(xué)檢測方法的比較

1、兒童肺炎支原體四種血清學(xué)檢測方法的比較 【摘要】 目的：通過對兒童肺炎支原體感染不同血清學(xué)方法檢測的結(jié)果比較，評價檢測方法對肺炎支原體感染的診斷價值。方法：選用我院兒科住院的肺炎患者395例，分別采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)、金標(biāo)滲濾法(DIM)檢測血清MPAbIgM，熒光定量PCR（FQPCR）檢測MPDNA和冷凝集試驗(CAT)。結(jié)果：395例小兒肺炎患者受檢樣品中,87例2歲以下患兒、124例3歲6歲患兒、184例7歲14歲患兒的陽性結(jié)果及總陽性率分別為冷凝集試驗：17例(19.5%)、36例(29.0%)、62例(33.7%)、29.1%；金標(biāo)滲濾法：31例(35.6%)、53例(42

2、.7%)、85例(46.2%)、42.8%；酶聯(lián)免疫法：33例(37.9%)、54例(43.5%)、86例(46.7%)、43.8%；熒光PCR法：35例(40.2%)、57例(47.0%)、88例(47.8%)、45.6%。結(jié)論：MPAbIgM是機(jī)體受肺炎支原體感染時最早出現(xiàn)的特異性抗體，血清MPAbIgM檢測具有操作簡便、檢出率與PCR法相當(dāng)、能早期診斷的優(yōu)點，特別是金標(biāo)滲濾法，所需時間最短，又不需要特殊儀器，最適用于一般醫(yī)院開展應(yīng)用。 【關(guān)鍵詞】 肺炎支原體；血清學(xué)；金標(biāo)滲濾；冷凝集；酶聯(lián)免疫；熒光定量PCR 肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)無細(xì)胞壁，最外層

3、為細(xì)胞膜，基本形態(tài)呈球形或絲形，長約2 m5 ，革蘭染色陰性，其基因組為環(huán)狀雙鏈DNA。是兒童肺炎和其他呼吸道感染的重要病因之一。近年來，已成為小兒肺炎常見的病原體1，由其引起的呼吸感染日趨增多2，MP感染可在任何年齡發(fā)生，尤其以5歲20歲 研究對象為2005年1月至2006年2月在我院兒科住院的肺炎患者395例，男性235例，女性160例，年齡30 d14歲。按年齡分組：2歲以下患兒87例、3歲6歲患兒124例、7歲14歲患兒184例。采集靜脈血于枸櫞酸鈉抗凝管1.0 ml，普通試管3.5 ml。普通試管分離的血清留0.5 ml于帶蓋的子彈頭試管，儲于-30冰箱集中用酶聯(lián)免疫法檢測MP抗體I

4、gM。冷凝集試驗、滴金免疫法測定MP抗體IgM于采血當(dāng)天檢測。熒光PCR法采樣咽拭子標(biāo)本，采集時以清晨為宜。用清水漱口，由檢查者用壓舌板輔助，將咽拭子越過舌根，達(dá)咽峽部的病變處，反復(fù)涂抹數(shù)次，取出時避免接觸舌及口腔黏膜等處，將取樣的咽拭子放入0.5 ml無菌的生理鹽水中充分漂洗，然后貼壁擠干丟棄，樣本-30保存后集中檢測。2 方法2.1 冷凝集試驗血清0.5 ml用0.85%生理鹽水作倍比稀釋至第9管,第10管用0.5 ml生理鹽水作陰性對照管。各加1%紅細(xì)胞懸液0.5 ml，混勻后置4冰箱1 h。取出后立即觀察結(jié)果。管底紅細(xì)胞凝集，輕搖不易散開，再放入37水浴箱10 min30 min，凝集

5、消失者為真陽性，并以該管的稀釋倍數(shù)為效價報告，按132以上或雙份效價4倍以上變化者為陽性，提示感染。2.2 金標(biāo)滲濾法檢測 MPAbIgM 試劑盒購自蘭波生物技術(shù)研究所。于效期內(nèi)按試劑盒說明書進(jìn)行操作和判斷結(jié)果。2.3 酶聯(lián)免疫法檢測MPAbIgM 試劑盒購自華美生物技術(shù)有限公司，儀器：伯樂1575洗板機(jī)、美國寶特EL311S酶標(biāo)儀。于效期內(nèi)按試劑盒說明書進(jìn)行操作和判斷結(jié)果。 2.4 熒光定量PCR法MP核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒購自深圳市匹基生物工程股份有限公司，儀器：大和LineGene熒光定量PCR檢測儀。樣本處理：取樣本100 l加入100 l DNA提取液，振蕩混勻。13 000 rpm

6、離心15 min,吸棄上清液（盡量不碰沉淀物）。加入50 l DNA提取液2，振蕩混勻。100干浴10 min,13000 rpm離心10 min，保留上清液備用。PCR反應(yīng)體系：MPPCR反應(yīng)液35.6 l+Taq酶0.4 l+UNG 0.06 l+樣品裂解物4 l。循環(huán)條件：37 5 min,94 1 min,95 5 s,60 40 s,40個循環(huán)，反應(yīng)體系設(shè)40 l。每次試驗均有陰性對照與陽性對照；按說明書操作；試劑有效期內(nèi)使用。3 結(jié)果 395例小兒肺炎患者M(jìn)P四種血清學(xué)檢測結(jié)果，見表1。表1 395例小兒肺炎患者M(jìn)P四種血清學(xué)檢測結(jié)果（略） 從表1中可看出，熒光PCR法檢出率最高，

7、酶聯(lián)免疫法與金標(biāo)滲濾法次之，冷凝集試驗檢出率最低。在冷凝集試驗檢出的115例陽性病例中，有2例其他三種方法都檢測為陰性，這可能與檢測方法是非特異性有關(guān)。金標(biāo)滲濾法與酶聯(lián)免疫法檢出的陽性標(biāo)本熒光定量PCR法也都檢出。熒光定量PCR法檢出的陽性中有1例其他三種方法都檢測為陰性，這可能由于生殖支原體感染與MP的感染有血清學(xué)的交叉反應(yīng)從而引起假陽性，也可能是由于污染造成的假陽性。4 討論 大量臨床資料表明MP是急性呼吸道感染的常見病原體。它可引起呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎、支氣管炎乃至肺膿腫、肺大泡及胸膜炎，并且可引起多系統(tǒng)損害4。MP已越來越受到人們的關(guān)注。MPAbIgM是機(jī)體受MP感染時最早出現(xiàn)的

8、特異性抗體，它于發(fā)病后1周左右檢出，10 d30 d達(dá)到高峰，12周16周轉(zhuǎn)陰，檢測MPAbIgM可以早期診斷、早期治療可明顯縮短MP感染病程。 目前，用于檢測MP感染的實驗診斷方法有MP培養(yǎng)分離、冷凝集試驗、酶聯(lián)免疫法、金標(biāo)滲濾法及PCR等。相比較而言，培養(yǎng)分離MP雖然對診斷和鑒別有決定性意義，但其檢出率較低，在臨床上推廣應(yīng)用有困難，冷凝集試驗由于是非特異性方法，容易漏檢，檢出率低，熒光定量PCR雖然檢出率高，但操作繁瑣，需昂貴設(shè)備，不易普及，酶聯(lián)免疫法檢出率雖與PCR法檢出率相當(dāng)，但也需要洗板機(jī)、酶標(biāo)儀設(shè)備，而且所需時間較長，只有金標(biāo)滲濾法無需儀器設(shè)備，簡便快捷，檢出率與酶聯(lián)免疫法、PCR法相當(dāng)，最適宜一般醫(yī)院開展應(yīng)用，若同時檢測MPAbIgM和MPAbIgG則可進(jìn)一步提高診斷率?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Davis SF.Concurrent outbreaks of pertussis and Mycoplasma pneumonia infectionJ.Clin Infect Dis，1995，20:621.2王學(xué)枋，王曉紅，趙國呂.小兒肺炎支原體96例臨床分析J.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997，24（6）:523.3包瑛.肺炎支原體肺炎的研究進(jìn)展J.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2002，(10)：3538.4Chu CS, Braun SR, Yarbr