滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激神經(jīng)元損傷的愛惜作用及機(jī)制研究

1、滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激神經(jīng)元損傷的愛惜作用及機(jī)制研究戰(zhàn)麗彬，鐘軍華，路小光，隋華，韋巍【關(guān)鍵詞】內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；衣霉素；葡萄糖調(diào)劑蛋白78;凋亡增進(jìn)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白；小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum,ER)普遍存在于真核細(xì)胞中，是蛋白質(zhì)合成、折疊、運(yùn)輸和細(xì)胞內(nèi)鈣離子貯存的要緊場所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子紊亂和未折疊蛋白質(zhì)蓄積可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress,ERS),發(fā)生具有愛惜作用的未折疊蛋白反映(unfoldedproteinresponse,UPR)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激直接阻礙應(yīng)激細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸，如修復(fù)、損傷或凋亡。神經(jīng)系統(tǒng)許

2、多疾病與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。最近的研究說明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號傳導(dǎo)途徑可能與阿爾茨海默病(Alzheimerdisease,AD)的發(fā)病有關(guān)。本研究觀看滋補(bǔ)脾陰方藥(ZibuPiyinRecipe,ZBPYR)含藥血清對由N糖鏈抑制劑衣霉素(tunicamycin,Tm)引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的阻礙，以探討其神經(jīng)愛惜機(jī)制。1材料與方式實驗藥物滋補(bǔ)脾陰方藥由清朝吳澄不居集中資成湯加味而成，由紅參30g,山藥15g,茯苓15g,白芍15g,丹參12g,白扁豆15g,蓮肉20g,石菖蒲10g,遠(yuǎn)志10g,檀香g,橘紅9g,甘草9g組成，均購自大連醫(yī)藥集團(tuán)藥材公司。中藥常規(guī)水煎，每毫升中藥液含生藥g,4&

3、#176;C保留備用。要緊試劑和儀器達(dá)爾伯克改良伊格爾培育基(Dulbecco'smodifiedeagle'smedium,DMEM)和胎牛血清,Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶和TRIReagent,Sigma公司產(chǎn)品；Tm,星形胞菌素(staurosporine,STS),日本W(wǎng)ako公司產(chǎn)品;細(xì)胞毒性檢測試劑盒,Roche公司產(chǎn)品；RNaseOUT和Oligo(dt),Invitrogen公司產(chǎn)品。二氧化碳恒溫培育箱，ThermoForma公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(jī),Sigma公司產(chǎn)品；UV754紫外分光光度計，上海分析儀器總廠產(chǎn)品；溫度梯度PCR擴(kuò)增儀，ThermoHy

4、baid公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國BI0TEKTM公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，UVP公司產(chǎn)品。中藥血清制備取健康雄性SD大鼠(220250g)12只，隨機(jī)分為對照組和ZBPYR組，每組6只。適應(yīng)飼養(yǎng)3d后，ZBPYR組給予滋補(bǔ)脾陰方藥灌胃，10ml/kg體質(zhì)量，此劑量灌胃2次/d,持續(xù)3d；對照組給予等體積生理鹽水灌胃。于末次給藥后lh腹主動脈取血,靜置2h,2000r/min,4離心15min分離血清,離心半徑為cm,56,30min滅活。Um濾膜過濾除菌，一20保留備用。Neuro2a細(xì)胞的培育小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞Neuro2a細(xì)胞株由日本北海道大學(xué)藥學(xué)部野村靖幸教授惠贈。細(xì)胞常規(guī)蘇醒后加入培育液

5、于5%CO二、37培育箱培育。細(xì)胞單層長滿后用終濃度為%胰蛋白酶37條件下消化3min,以1：3傳代。培育液含90%DMEM、10%胎牛血清和1%雙抗。細(xì)胞長至第三代能夠利用。乳酸脫氫酶釋放實驗Neuro2a細(xì)胞接種后分為對照組、10%空白血清組、5%ZBPYR組、10%ZBPYR組、15%ZBPYR組、Tm(5Ug/ml)組、10%空白血清+Tm(5Ug/ml)組、5%ZBPYR+Tm(5Ug/ml)組、10%ZBPYR+Tm(5Ug/ml)組、15%ZBPYR+Tm(5Ug/ml)組。細(xì)胞單層長至70%時按以上分組給予相應(yīng)刺激。刺激后細(xì)胞放入5%C0二、37培育箱繼續(xù)培育48h后用乳酸脫氫

6、酶(lactatedehydrogenase,LDH)釋放實驗檢測LDH泄漏率。LDH實驗步驟按試劑盒說明執(zhí)行。LDH泄漏率為細(xì)胞上清中LDH活性與細(xì)胞總的LDH活性比值。LDH活性測定用酶標(biāo)儀于490nm處檢測。另外Neuro2a細(xì)胞接種后分為對照組、STS(Umol/L)組、10%空白血清+STS(Umol/L)組、15%ZBPYR+STS(Umol/L)組，待細(xì)胞單層長至70%時按以上分組給予相應(yīng)刺激。刺激后細(xì)胞放入5%C0二、37培育箱繼續(xù)培育48h后檢測LDH泄漏率。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒从硨嶒灧纸M同前。細(xì)胞單層長至90%時按以上分組給予相應(yīng)刺激。細(xì)胞放入5%C0二、37°C培

7、育箱繼續(xù)培育6h。總RXA的提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒从场?1)搜集細(xì)胞用TRIReagent提取總RNA。用紫外分光光度計測定A260/A280,計算RNA濃度。(2)逆轉(zhuǎn)錄反映。反映體系為20ulo取2ug總RXA,加二乙基焦磷酰胺(diethylpyrocarbonate,DEPC)水至整體積為9U1,力口UlOligo(dt)1218引物混合后，置.70變性10min。然后加入以下成份：5X第一鏈緩沖液口1、10mmol/LdNTP2UKmol/LDTT2U1、RNase抑制劑U1和逆轉(zhuǎn)錄酶Ul,混合使反映整體系為20Hlo放入46反映h,70變性15min,冰上5min后進(jìn)行擴(kuò)增。(3

8、)PCR反映。在mlPCR管中加入U1逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、sdH209口1、10mmol/LdNTPUl、10XPCR緩沖液口1、聚合酶上游引物(20Umol/L)UK下游引物(20Umol/L)Hl,總反映體系為12ulo(4)PCR產(chǎn)物觀看。PCR產(chǎn)物經(jīng)40%丙烯酰胺凝膠電泳后，EB染色15min,用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照及圖像分析,然后計算待測基因與內(nèi)標(biāo)磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehydephosphatedehydrogenase,GAPDH)吸光度的比值。PCR反映擴(kuò)增參數(shù)如下：葡萄糖調(diào)劑蛋白78(glucoseregulatedprotein78,GRP78),945min,941

9、min,551min,72C1min,循環(huán)22圈，725min；凋亡增進(jìn)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/EBPhomologousprotein,CHOP),945min,941min,60lmin,721min,循環(huán)25圈，725min；GAPDH,945min,9440s,5830s,7240s,循環(huán)28圈，725mine引物序列見表1。表1引物序列（略）Table1Sequenceoftheprimers統(tǒng)計學(xué)方式每組實驗重復(fù)4次,圖像分析采納LabWorks專業(yè)圖像分析軟件。數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行分析，兩組間不同比較采納t查驗。2結(jié)果LDH釋放實驗檢測ZBPYR含藥

10、血清對Tm刺激Neuro2a后LDH泄漏率的阻礙各濃度含藥血清和10%空白血清組與對照組相較，LDH泄漏率不同沒有統(tǒng)計學(xué)意義,說明血清對Neuro2a細(xì)胞沒有毒性作用;Tm（5Ug/ml）組與對照組相較，LDH泄漏率明顯升高，不同有統(tǒng)計學(xué)意義（P）;10%空白血清預(yù)處置組LDH泄漏率與Tm組相較，不同無統(tǒng)計學(xué)意義；而各濃度ZBPYR含藥血清預(yù)處置組與Tm組相較，LDH泄漏率下降明顯，不同有統(tǒng)計學(xué)意義（POo10%藥物血清預(yù)處置組與10%空白血清預(yù)處置組相較，不同有統(tǒng)計學(xué)意義（P）。見圖1。RTPCR方式觀看ZBPYR含藥血清對Tm刺激Neuro2a后GRP78mRNA表達(dá)的阻礙各濃度含藥血清和

11、10%空白血清組與對照組相較，GRP78mRXA表達(dá)不同無統(tǒng)計學(xué)意義，說明血清對Neuro2a細(xì)胞GRP78mRNA表達(dá)沒有阻礙；Tm(5Hg/ml)組與對照組相較,GRP78mRXA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<而加入血清預(yù)處置lh后再加入濃度為5Ug/mlTm各組與Tm(5Hg/ml)組相較，GRP78mRNA表達(dá)明顯下降(P<,其中ZBPYR含藥血清預(yù)處置組GRP78mRNA表達(dá)較空白血清預(yù)處置組GRP78mRA表達(dá)下降加倍明顯(P<。見圖2。RTPCR方式觀看ZBPYR含藥血清對Tm刺激Neuro2a后CHOPmRNA表達(dá)的阻礙各濃度含藥血清組與對照組相較，CHOPmRXA表達(dá)不

12、同無統(tǒng)計學(xué)意義，說明血清對Neuro2a細(xì)胞CHOPmRXA表達(dá)沒有阻礙；Tm(5Ug/ml)組與對照組相較，CHOPmRNA表達(dá)增強(qiáng)(P<)；10%空白血清預(yù)處置組與Tm(5Ug/ml)組相較，CHOPmRXA表達(dá)不同無統(tǒng)計學(xué)意義；而各濃度ZBPYR含藥血清預(yù)處置組CHOPmRXA表達(dá)與Tm(5Ug/ml)組相較，不同有統(tǒng)計學(xué)意義(PO；10%藥物血清預(yù)處置組與10%空白血清預(yù)處置組相較，CHOPmRXA表達(dá)不同有統(tǒng)計學(xué)意義(PV)。見圖2。圖1LDH檢測Tm刺激細(xì)胞后各組細(xì)胞LDH泄漏率(略)Figure 1 LDHleakagefromeachgrouptreatedbyTm*P&

13、lt;,vsnormalcontrolgroup;AP<,AAP<,vsTmtreatedgroup;AP<,vs10%controlserumtreatedgroup(n=4foreachgroup).圖2RTPCR法觀看Tm刺激各組細(xì)胞后GRP78和CHOPmRNA表達(dá)(略)Figure 2 ExpressionsofGRP78andCHOPmRNAsindifferentgroupstreatedbyTm(RTPCR)ResultsofRTPCRelectrophoresisfromeachgroupandvaluesofI0Dfromeachgroup(n=4fore

14、achgroup).*P<,vsnormalcontrolgroup;AP<,vsTmtreatedgroup;AP<,vs10%controlserumtreatedgroup.LDH釋放實驗檢測STS刺激Neuro2a后LDH泄漏率的轉(zhuǎn)變STSUmol/L組與對照組比，LDH泄漏率升高(P<)；而加入15%空白血清預(yù)處置組與STS組相較，LDH泄漏率下降(PO；15%ZBPYR含藥血清預(yù)處置組與STS組相較，LDH泄漏率下降(P<)；15%ZBPYR含藥血清預(yù)處置組與15%空白血清預(yù)處置組相較LDH泄漏率下降加倍明顯(POo見圖3o圖3LDH檢測STS刺激細(xì)胞

15、后各組細(xì)胞LDH泄漏率（略）Figure 3 LDHleakagefromeachgrouptreatedbySTS*P<,vsnormalcontrolgroup;AP<,AAP<,vsSTStreatedgroup;AP<,vs15%controlserumtreatedgroup(n二4foreachgroup).3討論ERS是細(xì)胞的一種應(yīng)激反映進(jìn)程，糖饑餓、鈣平穩(wěn)紊亂、糖基化抑制和二硫鍵合成減少等情形下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微環(huán)境發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的折疊受到阻礙，致使大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，由此引發(fā)一系列以分子伴侶和折疊酶表達(dá)上調(diào)為標(biāo)志的應(yīng)答反映，稱為未折

16、疊蛋白反映(unfoldedproteinresponse,UPR)o通過UPR細(xì)胞才能在應(yīng)激情形下存活。分子伴侶GRP78與凋亡增進(jìn)因子CHOP是ERS時表達(dá)增多的兩種分子，被看做是ERS的標(biāo)志，在ERS中起著不同的作用。其中GRP78能愛惜細(xì)胞，而CHOP那么是增進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此通過藥物干與后研究它們的表達(dá)情形能夠進(jìn)一步了解藥物對ERS的作用。AD是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，病理特點為淀粉樣蛋白的沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、tau蛋白異樣磷酸化和區(qū)域選擇性神經(jīng)元死亡loAD與基因突變有關(guān)，要緊有編碼淀粉樣蛋白前體基因(amyloidproteinprecursor,APP)和早老素(presen

17、ilin,PS)基因，這些基因都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)。AD相關(guān)的早老素突變，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反映而且通過改變APP的蛋白水解加工作用而部份地增強(qiáng)對應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡的易損性。PS1突變通過細(xì)胞表而有活性的鈣離子流入的直接減少，不依托APP,并間接地通過APP處置作用和淀粉樣肽的產(chǎn)生增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放來解除對神經(jīng)元鈣離子穩(wěn)態(tài)的操縱。這種鈣離子穩(wěn)態(tài)的干擾將改變APP的加工，過量生成B淀粉樣蛋白142(amyloid8protein142,API42),同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣失衡,激活鈣蛋白激酶，切割內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的caspase12,從而激活caspase12介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性凋亡途徑，最終形成AD的病理轉(zhuǎn)變2o除鈣離子失

18、調(diào)，PS突變下調(diào)UPR并增強(qiáng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的易損性30PS1突變還誘導(dǎo)了一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)的凋亡前因子CHOP的表達(dá)41PS是Y分泌酶復(fù)合物的一部份，與B分泌酶一路，裂解APP產(chǎn)生AB,而且PS突變增加總A13和AB142的產(chǎn)生。AB能直接引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子釋放而且誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和神經(jīng)毒性5。因此，在AD中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是引發(fā)和調(diào)劑神經(jīng)元死亡的一個要緊事件?，F(xiàn)有研究顯示在AD神經(jīng)元死亡中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑和線粒體損傷的凋亡途徑彼此阻礙，起著調(diào)控凋亡級聯(lián)反映的作用6o中醫(yī)以為人體的生長、發(fā)育和衰老與“腎”緊密相關(guān)?！澳I精虛衰”是衰老的要緊緣故。同時又以為“脾胃為血氣陰陽之根蒂”，“

19、脾胃既和,其人壽；脾胃不和，其人天”，因此也重視服侍脾胃精氣在延年中的作用:7L老年癡呆發(fā)病于老年期。老年期脾胃氣衰，飲食減少，脾虛那么化源不足，腦髓失養(yǎng)，神機(jī)失調(diào)而發(fā)為本病。因此脾虛是老年性癡呆的大體病機(jī)，脾的功能衰退在老年性癡呆發(fā)病進(jìn)程中起著主導(dǎo)作用，并貫穿于全進(jìn)程8。脾的生理功能是脾之陰陽一起作用的結(jié)果。脾陰是指存在于脾臟的陰液(包括血、津液和水谷精微等)和脾的物質(zhì)形態(tài)及其滋潤濡養(yǎng)功能。由于脾與大腦關(guān)系緊密，脾陰虧虛嚴(yán)峻阻礙大腦的意識、學(xué)習(xí)、思維、經(jīng)歷和情緒等功能，致使一系列與腦相關(guān)的精神意識病證如意識不清、學(xué)習(xí)經(jīng)歷能力下降和情緒失常等。因此，滋補(bǔ)脾陰應(yīng)當(dāng)是防治老年癡呆的一個重要方法。滋

20、補(bǔ)脾陰方藥由清朝吳澄不居集中資成湯加味而成，以人參補(bǔ)脾益氣生津，山藥益胃補(bǔ)脾養(yǎng)陰，白芍養(yǎng)陰緩急，丹參活血養(yǎng)血益陰，茯苓健脾安神益智等，共奏健脾益陰之效。本組以往的研究顯示，滋補(bǔ)脾陰方藥能通過改善老齡大鼠腦細(xì)胞線粒體膜Na+K+ATP酶、Ca2+Mg2+ATP酶活性，調(diào)劑膜磷脂代謝障礙和修飾膜的作用9,和延緩興奮性氨基酸受體N甲基D門冬氨酸(NmethylDasparticacid,XMDA)受體、Y氨基丁酸(gammaaminobutyricacid,GABA)受體染色陽性神經(jīng)元在衰老進(jìn)程中喪失，同時抑制神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)

21、的表達(dá),起到神經(jīng)愛惜、延緩腦衰老的作用10。本實驗中Tm刺激Neuro2a細(xì)胞LDH釋放實驗結(jié)果說明，在加入滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清預(yù)愛惜后，能夠明顯降低Tm刺激細(xì)胞后的LDH泄漏率，結(jié)合RTPCR觀看到滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清預(yù)處置后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78及CHOPmRNA的表達(dá)受到抑制，兩種實驗結(jié)果的同步性能夠推斷滋補(bǔ)脾陰方藥具有抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。STS刺激Neuro2a細(xì)胞LDH釋放實驗結(jié)果說明，加入滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清預(yù)處置后，能夠明顯降低STS刺激細(xì)胞后的LDH泄漏率(STS是線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)劑)。因此說明滋補(bǔ)脾陰方藥同時具有愛惜線粒體損傷的作用。以上的研究結(jié)果為滋補(bǔ)脾陰方藥應(yīng)用

22、于臨床防治AD提供了依據(jù)。AD是一種常見的神經(jīng)退行性病變，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無有效的醫(yī)治手腕，對社會和人們的生活造成嚴(yán)峻的負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)有的研究說明，神經(jīng)元的凋亡在AD的發(fā)病進(jìn)程中起著重要的作用。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑和線粒體損傷的凋亡途徑己被證明在AD的發(fā)病進(jìn)程中起著協(xié)同作用。咱們的實驗證明，滋補(bǔ)脾陰方藥對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑和線粒體損傷的凋亡途徑具有雙重作用，因此有助于AD的防治，加當(dāng)中藥醫(yī)治有著毒副作用低、經(jīng)濟(jì)實惠的優(yōu)勢,更易于為人們所同意?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 MattsonMP.PathwaystowardsandawayfromAlzheimer'sdisease.Nature.200

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