急性經(jīng)口毒性試驗

1、急性經(jīng)口毒性試驗急性經(jīng)口毒性試驗Acute Oral Toxicity Test一、實驗內(nèi)容一、實驗內(nèi)容 1、動物的稱重、編號、隨機分組；、動物的稱重、編號、隨機分組； 2、受試物的配制（等容量稀釋）；、受試物的配制（等容量稀釋）； 3、小鼠灌胃染毒操作技術(shù)；、小鼠灌胃染毒操作技術(shù)； 4、急性毒性反應觀察；、急性毒性反應觀察； 5、LD50（機率單位法機率單位法）的計算和毒性分級。）的計算和毒性分級。二、材料和試劑二、材料和試劑1、實驗動物、實驗動物 選用健康成年小鼠（選用健康成年小鼠（1822g）。試驗前要對動物飼）。試驗前要對動物飼養(yǎng)養(yǎng)觀察觀察37天，以適應飼養(yǎng)環(huán)境，并淘汰不健康或體天，以

2、適應飼養(yǎng)環(huán)境，并淘汰不健康或體重不符合要求的動物；重不符合要求的動物；2、器材、器材 動物秤，動物秤，注射器，灌胃針，體重稱，吸管，吸球，注射器，灌胃針，體重稱，吸管，吸球，容量瓶，燒杯，棉棒，試劑瓶；容量瓶，燒杯，棉棒，試劑瓶；3、試劑、試劑 DDV（80g/100ml），苦味酸，蒸餾水。），苦味酸，蒸餾水。三、操作步驟三、操作步驟（一）實驗動物與分組（一）實驗動物與分組 首選健康成年小鼠首選健康成年小鼠(1822g)和大鼠和大鼠(180220g)，也可選用其它敏感動物。同性別，也可選用其它敏感動物。同性別實驗動物個體間體重相差不得超過平均實驗動物個體間體重相差不得超過平均體重體重的的10%

3、。 本次試驗取體重本次試驗取體重1822g的小鼠，試驗時，將小的小鼠，試驗時，將小鼠稱體重、編號、按鼠稱體重、編號、按隨機分組隨機分組原則，將實驗動物原則，將實驗動物分成分成5組，每組組，每組8只只。動物編號動物編號染色法染色法126397854（二）劑量選擇（二）劑量選擇 首先了解受試化學物的化學結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，查首先了解受試化學物的化學結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，查閱與受試化學物結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)相近似的其它化閱與受試化學物結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)相近似的其它化學物毒性資料（學物毒性資料（LD50），以此值作為受試化學物），以此值作為受試化學物的預期毒性中值，即的預期毒性中值，即中間劑量組中間劑量組。 上下各推上下

4、各推12個劑量組，進行預試驗。個劑量組，進行預試驗。 注意，動物種系和給藥途徑相同的毒性資料才可注意，動物種系和給藥途徑相同的毒性資料才可用作預期毒性中值。用作預期毒性中值。 LD0 、 LD01 、 LD100 。 各劑量組的各劑量組的間距間距可根據(jù)可根據(jù)LD50計算方法要求按計算方法要求按等比等比級數(shù)或等差級數(shù)級數(shù)或等差級數(shù)安排。安排。 本實驗用本實驗用機率單位法機率單位法計算計算LD50，要求按，要求按等比級數(shù)等比級數(shù)排列，常用排列，常用1：0.8，如敵敵畏的最高劑量為，如敵敵畏的最高劑量為125mg/kg，其次劑量組為，其次劑量組為125mg/kg0.8=100mg/kg，依次類推為，

5、依次類推為80、64和和51.2mg/kg五個劑量組。五個劑量組。（三）受試化學物配制與稀釋（三）受試化學物配制與稀釋1、溶劑、溶劑 水溶性受試化學物以蒸餾水為溶劑配制成溶液，水溶性受試化學物以蒸餾水為溶劑配制成溶液，脂溶性受試化學物以吐溫脂溶性受試化學物以吐溫-80、二甲基亞砜、植、二甲基亞砜、植物油、淀粉等配制成混懸液。物油、淀粉等配制成混懸液。2、受試物的配制、受試物的配制 （等容量稀釋）（等容量稀釋） 根據(jù)計算結(jié)果精確量取需要的受試物的量，稀釋根據(jù)計算結(jié)果精確量取需要的受試物的量，稀釋成需要的濃度。成需要的濃度。配制步驟配制步驟 取取1.5625ml DDV，用水稀釋至，用水稀釋至10

6、0ml，濃度為，濃度為12.5mg/ml，為（，為（1）液；）液； ?。ㄈ。?）液）液80ml，稀釋至，稀釋至100ml，濃度為，濃度為10mg/ml，為（為（2）液；）液； ?。ㄈ。?）液）液80ml，稀釋至，稀釋至100ml，濃度為，濃度為8mg/ml，為（為（3）液；）液； ?。ㄈ。?）液）液80ml，稀釋至，稀釋至100ml，濃度為，濃度為6.4mg/ml，為（，為（4）液；）液； ?。ㄈ。?）液）液80ml，稀釋至，稀釋至100ml，濃度為，濃度為5.12mg/ml。 按按10ml/kg體重經(jīng)口灌胃小鼠，則染毒劑量分別為體重經(jīng)口灌胃小鼠，則染毒劑量分別為125、100、80、64、5

7、1.2mg/kg。（四）灌胃（四）灌胃1、灌胃量、灌胃量 實驗試驗前實驗動物應實驗試驗前實驗動物應禁食禁食（一般（一般1216h），），不限制飲水不限制飲水。然后對各組動物用經(jīng)口灌胃法。然后對各組動物用經(jīng)口灌胃法一次一次染毒染毒。一次灌胃液體積為。一次灌胃液體積為小鼠小鼠0.21ml，大鼠，大鼠14ml，豚鼠，豚鼠l5ml，染毒后繼續(xù)禁食，染毒后繼續(xù)禁食34h。 各劑量組動物給予受試物的體積均為各劑量組動物給予受試物的體積均為10ml/kg。 不同體重小鼠灌胃容量計算：不同體重小鼠灌胃容量計算： 小鼠灌胃容量小鼠灌胃容量V(ml)=體重體重(g)10(ml/kg) =體重體重(g)10ml/1

8、000g2、灌胃操作、灌胃操作 小鼠、大鼠灌胃法：左手拇指和食指捏住小鼠頭部兩小鼠、大鼠灌胃法：左手拇指和食指捏住小鼠頭部兩耳后皮膚，無名指或小指將尾部緊壓在手上，使小鼠耳后皮膚，無名指或小指將尾部緊壓在手上，使小鼠腹部向上，盡量使其體位垂直，注意使動物的上消化腹部向上，盡量使其體位垂直，注意使動物的上消化道固定成一直線。右手持連著灌胃針的注射器，將灌道固定成一直線。右手持連著灌胃針的注射器，將灌胃針由動物口腔側(cè)插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑入胃針由動物口腔側(cè)插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑入食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動探索，一旦感覺阻食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動探索，一旦感覺阻力消失，即深入至

9、胃部，隨后將受試物溶液注入。如力消失，即深入至胃部，隨后將受試物溶液注入。如遇動物掙扎，應停止進針或?qū)⑨槹纬?，千萬不能強行遇動物掙扎，應停止進針或?qū)⑨槹纬觯f不能強行插入，以免穿破食管，甚至誤入氣管，導致動物立即插入，以免穿破食管，甚至誤入氣管，導致動物立即死亡。死亡。 一般進針深度小鼠一般進針深度小鼠2.54cm，大鼠或豚鼠，大鼠或豚鼠46cm。（五）實驗觀察（五）實驗觀察 實驗動物灌胃后應詳細實驗動物灌胃后應詳細觀察并記錄觀察并記錄染毒過程和觀染毒過程和觀察期內(nèi)的動物的中毒和死亡情況。察期內(nèi)的動物的中毒和死亡情況。 高劑量組動物的死亡常很快發(fā)生，染毒后應即刻高劑量組動物的死亡常很快發(fā)生，

10、染毒后應即刻密切觀察。密切觀察。 觀察和記錄觀察和記錄中毒體征及出現(xiàn)的時間、死亡時間及中毒體征及出現(xiàn)的時間、死亡時間及死亡前的特征死亡前的特征。 根據(jù)觀察情況分析根據(jù)觀察情況分析中毒特點和毒作用靶器官中毒特點和毒作用靶器官。 觀察期（觀察期（14天）結(jié)束后，處死存活動物并進行大天）結(jié)束后，處死存活動物并進行大體解剖，如有必要，進行病理組織學檢查。體解剖，如有必要，進行病理組織學檢查。三、三、LD50計算計算可采用多種方法測定可采用多種方法測定LD50，有，有機率單位法機率單位法、霍恩、霍恩氏法、寇氏法氏法、寇氏法等，機率單位法數(shù)字基礎(chǔ)較好，能等，機率單位法數(shù)字基礎(chǔ)較好，能計算出任何反應率水平的

11、劑量，且實驗計算出任何反應率水平的劑量，且實驗2-5組均組均可?？伞C率單位法要求機率單位法要求： 1、劑量按等比級數(shù)排列，相鄰兩劑量組間的比值、劑量按等比級數(shù)排列，相鄰兩劑量組間的比值常用常用0.8； 2、各實驗組動物數(shù)相等。、各實驗組動物數(shù)相等。機率單位法計算公式（五個劑量組時）機率單位法計算公式（五個劑量組時）X3-為第三個組的劑量對數(shù)為第三個組的劑量對數(shù)(X3=log80，80mg/kg)i-為相鄰兩組劑量比值（以高劑量組為分子）的對數(shù)為相鄰兩組劑量比值（以高劑量組為分子）的對數(shù)(i=log(1/0.8)y-為死亡率相應的機率單位（查表）為死亡率相應的機率單位（查表）1、2、3、4、5

12、為小劑量組到大劑量組的順序。為小劑量組到大劑量組的順序。yK-為為50%死亡率時所相當?shù)姆磻实臋C率單位，計算死亡率時所相當?shù)姆磻实臋C率單位，計算LD50時，時，yK=5.0LD50=log-110i(yk-y)2(y5-y1)+(y4-y2)+X3WyyyyyykyyiSx22415215)()(2)(50)(210)yy()yy(2)yyk( i10X2415），（的可信限05. 0p)S96. 1X(logLDX150四、結(jié)果評價四、結(jié)果評價 根據(jù)實驗動物中毒體征、死亡時間和特征、根據(jù)實驗動物中毒體征、死亡時間和特征、LD50，按受試物種類按受試物種類急性毒性分級急性毒性分級標準進行評定，判斷標準進行評定，判斷該受試物的毒性大小及毒性特征。該受試物的毒性大小及毒性特征。急性經(jīng)口毒性分級標準（急性經(jīng)口毒性分級標準（WHO）級別級別經(jīng)口經(jīng)口LD50（mg/kg）劇毒劇毒5高毒高毒550中毒中毒50500低毒低毒5005000微毒微毒5000五、作業(yè)五、作業(yè) 實驗報告實驗報告六、注意事項六、注意事項1、灌胃時操作要熟練，以免損傷食道或誤入氣管、灌胃時操作要熟練，以免損傷食道或誤入氣管2、正確捉拿動物，防止咬傷且避免動物損傷、正確捉拿動物，防止咬傷且避免動物損傷3、灌入量計算和操作要準確，否則影響結(jié)果、灌入量計算和