急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

1、急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)Acute Oral Toxicity Test一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1、動(dòng)物的稱重、編號(hào)、隨機(jī)分組；、動(dòng)物的稱重、編號(hào)、隨機(jī)分組； 2、受試物的配制（等容量稀釋）；、受試物的配制（等容量稀釋）； 3、小鼠灌胃染毒操作技術(shù)；、小鼠灌胃染毒操作技術(shù)； 4、急性毒性反應(yīng)觀察；、急性毒性反應(yīng)觀察； 5、LD50（機(jī)率單位法機(jī)率單位法）的計(jì)算和毒性分級(jí)。）的計(jì)算和毒性分級(jí)。二、材料和試劑二、材料和試劑1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康成年小鼠（選用健康成年小鼠（1822g）。試驗(yàn)前要對(duì)動(dòng)物飼）。試驗(yàn)前要對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)養(yǎng)觀察觀察37天，以適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境，并淘汰不健康或體天，以

2、適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境，并淘汰不健康或體重不符合要求的動(dòng)物；重不符合要求的動(dòng)物；2、器材、器材 動(dòng)物秤，動(dòng)物秤，注射器，灌胃針，體重稱，吸管，吸球，注射器，灌胃針，體重稱，吸管，吸球，容量瓶，燒杯，棉棒，試劑瓶；容量瓶，燒杯，棉棒，試劑瓶；3、試劑、試劑 DDV（80g/100ml），苦味酸，蒸餾水。），苦味酸，蒸餾水。三、操作步驟三、操作步驟（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 首選健康成年小鼠首選健康成年小鼠(1822g)和大鼠和大鼠(180220g)，也可選用其它敏感動(dòng)物。同性別，也可選用其它敏感動(dòng)物。同性別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間體重相差不得超過平均實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間體重相差不得超過平均體重體重的的10%

3、。 本次試驗(yàn)取體重本次試驗(yàn)取體重1822g的小鼠，試驗(yàn)時(shí)，將小的小鼠，試驗(yàn)時(shí)，將小鼠稱體重、編號(hào)、按鼠稱體重、編號(hào)、按隨機(jī)分組隨機(jī)分組原則，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原則，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成分成5組，每組組，每組8只只。動(dòng)物編號(hào)動(dòng)物編號(hào)染色法染色法126397854（二）劑量選擇（二）劑量選擇 首先了解受試化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，查首先了解受試化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，查閱與受試化學(xué)物結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)相近似的其它化閱與受試化學(xué)物結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)相近似的其它化學(xué)物毒性資料（學(xué)物毒性資料（LD50），以此值作為受試化學(xué)物），以此值作為受試化學(xué)物的預(yù)期毒性中值，即的預(yù)期毒性中值，即中間劑量組中間劑量組。 上下各推上下

4、各推12個(gè)劑量組，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。個(gè)劑量組，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。 注意，動(dòng)物種系和給藥途徑相同的毒性資料才可注意，動(dòng)物種系和給藥途徑相同的毒性資料才可用作預(yù)期毒性中值。用作預(yù)期毒性中值。 LD0 、 LD01 、 LD100 。 各劑量組的各劑量組的間距間距可根據(jù)可根據(jù)LD50計(jì)算方法要求按計(jì)算方法要求按等比等比級(jí)數(shù)或等差級(jí)數(shù)級(jí)數(shù)或等差級(jí)數(shù)安排。安排。 本實(shí)驗(yàn)用本實(shí)驗(yàn)用機(jī)率單位法機(jī)率單位法計(jì)算計(jì)算LD50，要求按，要求按等比級(jí)數(shù)等比級(jí)數(shù)排列，常用排列，常用1：0.8，如敵敵畏的最高劑量為，如敵敵畏的最高劑量為125mg/kg，其次劑量組為，其次劑量組為125mg/kg0.8=100mg/kg，依次類推為，

5、依次類推為80、64和和51.2mg/kg五個(gè)劑量組。五個(gè)劑量組。（三）受試化學(xué)物配制與稀釋（三）受試化學(xué)物配制與稀釋1、溶劑、溶劑 水溶性受試化學(xué)物以蒸餾水為溶劑配制成溶液，水溶性受試化學(xué)物以蒸餾水為溶劑配制成溶液，脂溶性受試化學(xué)物以吐溫脂溶性受試化學(xué)物以吐溫-80、二甲基亞砜、植、二甲基亞砜、植物油、淀粉等配制成混懸液。物油、淀粉等配制成混懸液。2、受試物的配制、受試物的配制 （等容量稀釋）（等容量稀釋） 根據(jù)計(jì)算結(jié)果精確量取需要的受試物的量，稀釋根據(jù)計(jì)算結(jié)果精確量取需要的受試物的量，稀釋成需要的濃度。成需要的濃度。配制步驟配制步驟 取取1.5625ml DDV，用水稀釋至，用水稀釋至10

6、0ml，濃度為，濃度為12.5mg/ml，為（，為（1）液；）液； 取（?。?）液）液80ml，稀釋至，稀釋至100ml，濃度為，濃度為10mg/ml，為（為（2）液；）液； ?。ㄈ。?）液）液80ml，稀釋至，稀釋至100ml，濃度為，濃度為8mg/ml，為（為（3）液；）液； ?。ㄈ。?）液）液80ml，稀釋至，稀釋至100ml，濃度為，濃度為6.4mg/ml，為（，為（4）液；）液； ?。ㄈ。?）液）液80ml，稀釋至，稀釋至100ml，濃度為，濃度為5.12mg/ml。 按按10ml/kg體重經(jīng)口灌胃小鼠，則染毒劑量分別為體重經(jīng)口灌胃小鼠，則染毒劑量分別為125、100、80、64、5

7、1.2mg/kg。（四）灌胃（四）灌胃1、灌胃量、灌胃量 實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)禁食禁食（一般（一般1216h），），不限制飲水不限制飲水。然后對(duì)各組動(dòng)物用經(jīng)口灌胃法。然后對(duì)各組動(dòng)物用經(jīng)口灌胃法一次一次染毒染毒。一次灌胃液體積為。一次灌胃液體積為小鼠小鼠0.21ml，大鼠，大鼠14ml，豚鼠，豚鼠l5ml，染毒后繼續(xù)禁食，染毒后繼續(xù)禁食34h。 各劑量組動(dòng)物給予受試物的體積均為各劑量組動(dòng)物給予受試物的體積均為10ml/kg。 不同體重小鼠灌胃容量計(jì)算：不同體重小鼠灌胃容量計(jì)算： 小鼠灌胃容量小鼠灌胃容量V(ml)=體重體重(g)10(ml/kg) =體重體重(g)10ml/1

8、000g2、灌胃操作、灌胃操作 小鼠、大鼠灌胃法：左手拇指和食指捏住小鼠頭部?jī)尚∈蟆⒋笫蠊辔阜ǎ鹤笫帜粗负褪持改笞⌒∈箢^部?jī)啥笃つw，無名指或小指將尾部緊壓在手上，使小鼠耳后皮膚，無名指或小指將尾部緊壓在手上，使小鼠腹部向上，盡量使其體位垂直，注意使動(dòng)物的上消化腹部向上，盡量使其體位垂直，注意使動(dòng)物的上消化道固定成一直線。右手持連著灌胃針的注射器，將灌道固定成一直線。右手持連著灌胃針的注射器，將灌胃針由動(dòng)物口腔側(cè)插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑入胃針由動(dòng)物口腔側(cè)插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑入食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動(dòng)探索，一旦感覺阻食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動(dòng)探索，一旦感覺阻力消失，即深入至

9、胃部，隨后將受試物溶液注入。如力消失，即深入至胃部，隨后將受試物溶液注入。如遇動(dòng)物掙扎，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬觯f不能強(qiáng)行遇動(dòng)物掙扎，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬觯f不能強(qiáng)行插入，以免穿破食管，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動(dòng)物立即插入，以免穿破食管，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動(dòng)物立即死亡。死亡。 一般進(jìn)針深度小鼠一般進(jìn)針深度小鼠2.54cm，大鼠或豚鼠，大鼠或豚鼠46cm。（五）實(shí)驗(yàn)觀察（五）實(shí)驗(yàn)觀察 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃后應(yīng)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃后應(yīng)詳細(xì)觀察并記錄觀察并記錄染毒過程和觀染毒過程和觀察期內(nèi)的動(dòng)物的中毒和死亡情況。察期內(nèi)的動(dòng)物的中毒和死亡情況。 高劑量組動(dòng)物的死亡常很快發(fā)生，染毒后應(yīng)即刻高劑量組動(dòng)物的死亡常很快發(fā)生，

10、染毒后應(yīng)即刻密切觀察。密切觀察。 觀察和記錄觀察和記錄中毒體征及出現(xiàn)的時(shí)間、死亡時(shí)間及中毒體征及出現(xiàn)的時(shí)間、死亡時(shí)間及死亡前的特征死亡前的特征。 根據(jù)觀察情況分析根據(jù)觀察情況分析中毒特點(diǎn)和毒作用靶器官中毒特點(diǎn)和毒作用靶器官。 觀察期（觀察期（14天）結(jié)束后，處死存活動(dòng)物并進(jìn)行大天）結(jié)束后，處死存活動(dòng)物并進(jìn)行大體解剖，如有必要，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。體解剖，如有必要，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。三、三、LD50計(jì)算計(jì)算可采用多種方法測(cè)定可采用多種方法測(cè)定LD50，有，有機(jī)率單位法機(jī)率單位法、霍恩、霍恩氏法、寇氏法氏法、寇氏法等，機(jī)率單位法數(shù)字基礎(chǔ)較好，能等，機(jī)率單位法數(shù)字基礎(chǔ)較好，能計(jì)算出任何反應(yīng)率水平的

11、劑量，且實(shí)驗(yàn)計(jì)算出任何反應(yīng)率水平的劑量，且實(shí)驗(yàn)2-5組均組均可。可。機(jī)率單位法要求機(jī)率單位法要求： 1、劑量按等比級(jí)數(shù)排列，相鄰兩劑量組間的比值、劑量按等比級(jí)數(shù)排列，相鄰兩劑量組間的比值常用常用0.8； 2、各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)相等。、各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)相等。機(jī)率單位法計(jì)算公式（五個(gè)劑量組時(shí)）機(jī)率單位法計(jì)算公式（五個(gè)劑量組時(shí)）X3-為第三個(gè)組的劑量對(duì)數(shù)為第三個(gè)組的劑量對(duì)數(shù)(X3=log80，80mg/kg)i-為相鄰兩組劑量比值（以高劑量組為分子）的對(duì)數(shù)為相鄰兩組劑量比值（以高劑量組為分子）的對(duì)數(shù)(i=log(1/0.8)y-為死亡率相應(yīng)的機(jī)率單位（查表）為死亡率相應(yīng)的機(jī)率單位（查表）1、2、3、4、5

12、為小劑量組到大劑量組的順序。為小劑量組到大劑量組的順序。yK-為為50%死亡率時(shí)所相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)率的機(jī)率單位，計(jì)算死亡率時(shí)所相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)率的機(jī)率單位，計(jì)算LD50時(shí)，時(shí)，yK=5.0LD50=log-110i(yk-y)2(y5-y1)+(y4-y2)+X3WyyyyyykyyiSx22415215)()(2)(50)(210)yy()yy(2)yyk( i10X2415），（的可信限05. 0p)S96. 1X(logLDX150四、結(jié)果評(píng)價(jià)四、結(jié)果評(píng)價(jià) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒體征、死亡時(shí)間和特征、根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒體征、死亡時(shí)間和特征、LD50，按受試物種類按受試物種類急性毒性分級(jí)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定，判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定，判斷該受試物的毒性大小及毒性特征。該受試物的毒性大小及毒性特征。急性經(jīng)口毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（急性經(jīng)口毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（WHO）級(jí)別級(jí)別經(jīng)口經(jīng)口LD50（mg/kg）劇毒劇毒5高毒高毒550中毒中毒50500低毒低毒5005000微毒微毒5000五、作業(yè)五、作業(yè) 實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告六、注意事項(xiàng)六、注意事項(xiàng)1、灌胃時(shí)操作要熟練，以免損傷食道或誤入氣管、灌胃時(shí)操作要熟練，以免損傷食道或誤入氣管2、正確捉拿動(dòng)物，防止咬傷且避免動(dòng)物損傷、正確捉拿動(dòng)物，防止咬傷且避免動(dòng)物損傷3、灌入量計(jì)算和操作要準(zhǔn)確，否則影響結(jié)果、灌入量計(jì)算和