引物純化方式選擇指南

1、容導(dǎo)讀一、DNA 合成的方法和原理二、引物純化的方法原理及其效果三、純化方法與應(yīng)用指南四、常見問題的原因分析及相應(yīng)的對策一、DNA 合成的方法和原理 目前引物合成主要采用固相亞磷酰胺三酯法進行。 基于該方法的 DNA 合成儀有多種， 由 ABI/PE 公司生產(chǎn)的高通量 DNA 自動合成儀得到了廣泛的應(yīng)用。 各合成儀進行引物合成的原理基本相同， 主要區(qū)別在于合成產(chǎn)率的高低、 試劑消耗量和單個循環(huán)用時等。 生工公司采用的合成儀主要機型 為全新的 ABI3900 高通量合成儀。固相亞磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，具有高效、快速偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。該方法是在固相載體上完成DNA鏈的合成

2、的，DNA化學(xué)合成不同于酶促的DNA合成過程從53方向延伸，而是由 3端開始，相鄰的核苷酸通過3t 5磷酸二酯鍵連接。具體的反應(yīng)步驟如圖一。1、脫保護基 (Deblocking) 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid ， TCA) 脫去連結(jié)在 CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷 酸的保護基團 DMT ( 二甲氧基三苯甲基 )，獲得游離的 5-羥基端，以供下一步縮合反應(yīng)。2 、活化 (Activation)將亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體(其 3-端已被活化，但 5-端仍受 DMT 保護 )，此中

3、間體將與 GPG 上的已脫保護基的核苷酸發(fā)生 縮合反應(yīng)。3 、連接 (Coupling)亞磷酰胺四唑活性中間體遇到 CPG 上已脫保護基的核苷酸時， 將與其 5-羥基發(fā)生親合反應(yīng)， 縮 合并脫去四唑，此時合成的寡核苷酸鏈向前延長一個堿基。4 、封閉 (Capping)縮合反應(yīng)后， 為了防止連在 CPG 上的未參與反應(yīng)的 5-羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過乙?；瘉矸忾]此端羥基，一般乙?；噭┦怯靡宜狒蚇-甲基咪唑等混合形成的。圖 1: DNA 合成原理示意圖(固相亞磷酰胺三酯法)5 、氧化 (Oxidation)縮合反應(yīng)時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在 CPG 上的寡核苷酸連接， 而亞磷

4、酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，此時常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。經(jīng)過以上五個步驟后，一個脫氧核苷酸就被連到 CPG 的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去 新連上的脫氧核苷酸 5-羥基上的保護基團 DMT 后，重復(fù)以上的活化、 連接、封閉、 氧化過程即 可得到DNA片段粗品。最后對其進行切割、 脫保護基，合成的Oligo在脫去保護基后，目的Oligo純度是比較低的， 其中含有大量的雜質(zhì)。 主要雜質(zhì)有： 所脫下的保護基與氨形成的苯甲酸氨和異 丁酸氨，腈磷基上脫下的腈乙基，以及合成時產(chǎn)生的短鏈等。以至于粗產(chǎn)品中全長Oligo DNA含量僅為25%左右。盡管合成時每一步的效

5、率都在98%99%，但累積的效率并不高。這些雜質(zhì)成分，尤其是存在于粗產(chǎn)品中的大量鹽和短鏈，不但造成定量不準(zhǔn)，還會影響下一步的反應(yīng)。 因此必須對 Oligo DNA 進行純化、定量等合成后處理即可得到符合實驗要求的寡核苷酸片段。二、引物純化的方法原理及其效果基于以上合成的原理和步驟， 目前， 常見的幾種純化方法如 C18 柱、 OPC 或 HAP、 PAGE 、 HPLC 。生工公司采用 HAP 、 ULTRA PAGE 、 HPLC 三種純化方法，其純化的原理及其效果分 別如下，我們建議客戶應(yīng)根據(jù)不同的實驗需求，選擇合適、經(jīng)濟并有效的純化方法。1. HAP 純化方法HAP （ HighAffi

6、nityPurification ）是生工生物自主開發(fā)的新型 oligoDNA 純化方法。該方法已 取得國家專利（專利號： 0.X ）。其原理是利用合成引物 5- 端 DMT 基團對 HAP 樹脂專一性吸 附，而不含 DMT 的短鏈 DNA 不被吸附，從而達到分離純化的目的。HAP 純化 柱中裝有對 DMT 具有親和力的樹脂，合成 DNA 片段時保留 5端最后一個堿基 上的 DMT ，所有合成產(chǎn)物吸附在柱上以后，用稀的有機溶劑洗柱，帶有DMT 的片段吸附能力強，不易被洗脫，不帶有 DMT 的片段吸附能力弱，被洗脫。然后用三氟乙酸TFA 或三氯乙酸 TCA 脫去 DMT 基團，再用濃一點的有機溶

7、劑洗脫 DNA 。這種方法具有多快好省的特點。 制品純度可達到 8090% ， 可以滿足雜交 探針 、 測序 、常規(guī) PCR （不再做進一步克隆實驗）等 用途了。但是因為其專一性吸附 DMT 能力有限，不免仍然有短片段帶入的可能，而且負(fù)載量 小。特別是對長于 39 堿基以上的片段純化效果不好。此 級別只提供長度在 10-39mer 以下的合 成 oligo DNA 制品。序列更長時，制品的純度得不到保證。若考慮節(jié)約經(jīng)費，對于要求較低的實 驗，如簡單的 PCR 反應(yīng)，則采用 HAP 純化即可。2. ULTRA PAGE 純化方法PAGE （Polyacrylamide Gel Electroph

8、oresis），該方法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA 片段進行分離， 然后從凝膠中回收目的 DNA 的方法。 PAGE 純化基于尺寸和構(gòu)象分離全長 產(chǎn)物和失敗序列，可以分離相差一個堿基的引物 （120 堿基以 ），從而提供高純度的引物。純化后 的DNA純度大于90%，相比與其他兩種方法，PAGE純化對長鏈 Oligo DNA （大于50 mer）的純化特別有效，制品純度保證 90 95% 。如訂購的 DNA 欲用作 RT-PCR 引物、各種探針，或 用于 PCR 克隆測序、定點突變等，請選用 PAGE 純化制品。ULTRA PAGE :理論上分析型 PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一

9、個堿基的差別。經(jīng)過 PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，上樣量都是非常大，電泳時的條帶往往比較寬，帶與帶之間有重疊，分辨率有所下降，電泳后割帶回收目的引物時，導(dǎo)致割的條帶有時可能比較寬，很難避免割到差別僅一個或幾個堿基的引物。因此生工生物為了給客戶更好解決以上問題，將原有的 PAGE純化方式升級優(yōu)化為現(xiàn)在的 ULTRA PAGE 純化方式，即在 PAGE純化的 同時配合質(zhì)譜對 DNA進行定性分析，以保證回收片段的正確性。3. HPLC純化方法HPLC （High Performa nee Liquid Chromatography）是使用高效液相色譜的原理，依據(jù)DNA的疏水性來分離

10、產(chǎn)物的。合成粗產(chǎn)物中不同長度的DNA片段的疏水性不同，一般來說較長的片段具有較強的疏水性，AT含量高的片段也具有較強的疏水性。先將粗產(chǎn)物檢測主峰位置，再增加加樣量，回收主峰位置的部分。該方法用于分離純化時能達到很高的純度和靈敏度，可以有效的去除大部分 N-短片段，因而可以除去失敗序列或未結(jié)合的標(biāo)記物，從而對DNA片段進行純化。同時配合質(zhì)譜對 DNA進行定性分析，以保證回收片段的正確性。由于HPLC產(chǎn)品的純度非常高，使用本法純化的DNA制品可適用于各種基因工程實驗。主要用于PCR克隆、定點突變、人工合成基因、長鏈和修飾引物的純化等。它的優(yōu)點是自動化程度高、省人力；弱點是純化量通量小、成本較高。三

11、、純化方法與應(yīng)用指南表1: HAP、ULTRA PAGE 和HPLC 三種純化方法的特點比較純化方式純化原理優(yōu)缺點應(yīng)用HAP采用純化柱上特異性樹脂對DNA片段上保留 5端最后 一個堿基上的 DMT有親和 吸附作用從而達到分離純 化。多快好省的特點。純度可達到8090%，但是對長于40堿基以上的片 段純化效果不好?？梢詽M足雜交探 針、測序、常規(guī) PCR （不再做進一 步克隆實驗）等用 途。ULTRA PAGE采用變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳，基于凝膠的尺寸和 DNA 的構(gòu)象原理，可以分離相差 一個堿基的引物，從而達到 對全長產(chǎn)物和失敗序列進行 分離，然后從凝膠中回收目 的DNA ,同時配合質(zhì)譜對 D

12、NA進行定性分析，以保證 回收片段的正確性。純度好，準(zhǔn)確性高，對于較長 序列（40-120 ），制品純度 保證9095%，相比與其他兩 種方法，ULTRA PAGE 純化 對長鏈引物（大于50mer）的 純化特別有效，缺點需要跑電 泳并切膠回收，費時費力?？蛇m于多重PCR、 亞克隆、點突變、 各種探針，或用于 PCR克隆測序、定 點突變等。HPLC采用高效液相色譜的原理， 依據(jù)DNA的疏水性來分離 產(chǎn)物的。合成粗產(chǎn)物中不同 長度的DNA片段的疏水 性不同，一般來說較長的片 段具有較強的疏水性，同時 配合質(zhì)譜對DNA進行定性 分析，以保證回收片段的正 確性。該法自動化程度高、省人力； 對于較長片

13、段（大于89 mer）， 純化效果不如 ULTRA PAGE 方法好。盡管對于較長序列， 但如果實驗對制品的純度要 求非常高， HPLC 與ULTRA PAGE雙重精制會使效果更 佳，其弱點是純化通量小、成 本較高。因其HPLC產(chǎn)品的 純度非常高，使用 本法純化的 DNA 制品可適用于各 種基因工程實驗。主要用于PCR克 隆、定點突變、人 工合成基因、長鏈 和修飾引物的純 化。對40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的純化方法， 其次是ULTRA PAGE ；而對40 mer 以上的DNA制品ULTRA PAGE 純化要優(yōu)于單純的 HPLC純化。所以，如您要對 PCR產(chǎn)物 克隆后測序，一

14、定要選擇 ULTRA PAGE 純化或HPLC純化的引物。根據(jù)不同的實驗要求，您可以選用以下適合的純化方法，具體見表2表2: HAP、ULTRA PAGE 和HPLC 三種純化方法的應(yīng)用應(yīng)用引物長度要求純化方法要求普通 PCR/RT-PCR40baseULTRA PAGE多重PCR/定量 PCR根據(jù)實驗要求定ULTRA PAGE, HPLC測序根據(jù)實驗要求定HAP診斷PCR擴增根據(jù)實驗要求定HAP, ULTRA PAGE亞克隆，點突變根據(jù)實驗要求定ULTRA PAGE, HPLC基因構(gòu)建根據(jù)實驗要求定ULTRA PAGE, HPLC全基因合成根據(jù)實驗要求定HAP反義核酸根據(jù)實驗要求定HPLC修

15、飾/標(biāo)記引物根據(jù)實驗要求定HPLCPCR產(chǎn)物用于克隆表達研究或 基因重組等根據(jù)實驗要求定ULTRA PAGE, HPLC四、常見問題的原因分析及相應(yīng)的對策Q-1.拿到引物后，想在實驗室檢測純度，如何實現(xiàn)？A-1:實驗室可通過變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行引物純度的檢測：使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，堿基數(shù) 12個的引物用20%的膠，12-60個堿基的引物用16%的膠，60個堿基的引物用12%的膠。取0.2-0.5 OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95 C，2 min ）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行

16、電泳，一定時間后（約2-3小時），剝膠，用熒光 TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的（有時由于變性不充分，主帶之上可能會有條帶，是引物二級結(jié)構(gòu)條帶)Q-2. 測序發(fā)現(xiàn)引物有突變或缺失是什么原因？A-2: 測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)有突變，主要考慮三個方面的原因：測序， PCR/ 克隆過程，引物本身。A、測序引入的錯誤對于 PCR 產(chǎn)物進行的克隆而言，無論是 TA 克隆或酶切克隆，引物區(qū)往往位于載體兩端， 如果用載體引物進行測序， 此時克隆引物區(qū)離測序引物區(qū)的距離比較近， 處于測序起始階段或正 好處于測序染料峰所在的區(qū)域( 90-120 bp )，這兩個區(qū)域也是最容易產(chǎn)生測序錯誤的

17、地方。因 此，首先要看原始的測序峰圖在引物區(qū)是否清晰， 堿基的錯誤或缺失是否是由于峰圖不清楚而導(dǎo) 致的計算機誤讀。B 、 PCR/ 克隆過程盡管使用高保真聚合酶進行 PCR 出錯的可能性比較少， 但不排除 PCR 錯配或者克隆過程中 突變的可能。有的人會問， PCR 的突變怎么會出現(xiàn)在引物區(qū)呢？這是因為，引物是單鏈，PCR產(chǎn)物引物區(qū)的互補鏈同樣是以引物為模板進行擴增得到的，因此，有可能存在引物正確但其產(chǎn)物出錯的情況。針對這種情況的解決方法是進行測序時，請送 2-3 個獨立的克隆子進行測序，這樣可以排除PCR 過程出錯或克隆產(chǎn)生突變的情況。C、引物本身錯誤如前面所述，引物合成是一種多步驟的化學(xué)反

18、應(yīng)，即使每一步合成效率達到99% ，仍有 1%的序列不能連接或錯誤地連接下一個堿基，這些序列在經(jīng)過Capping 后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；對于 缺失突變 ，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽 (capping) 反應(yīng)不徹底造成的， Caping 反應(yīng)主要 是封閉極少數(shù) 5-羥基沒有參加反應(yīng)單體。 被封閉的引物， 在下一輪偶連時將不能繼續(xù)參與合成。 對于實驗中測序發(fā)現(xiàn)的較常見堿基缺失的可能原因如下：1. 由于DNA合成是沿著3 f 5端方向?qū)A基逐個連接上去的，每連上一 個堿基，都需要經(jīng)過 (Detritylation 、 Coupling 、 Capping 、 Oxidation) 一個循環(huán)

19、。 Coupling 是上一個堿基的 5-OH 與 下一個堿基的 3 活性部分發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)的效率最高可達 99% ，即便如此， 仍有 1%的序列不能連接下一個堿基，這些序列在經(jīng)過 Capping 后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；2. Capping 是將沒有連接上下一個堿基的 5-OH 乙?；?， Capping 的效率不可能達到 100% ， 沒有被乙?；?5OH 會進一步發(fā)生反應(yīng)，造成中間缺堿基的失敗序列；3. Detritylation 是脫掉上一個堿基 5-OH 上的保護基，準(zhǔn)備連接下一個新堿基， Detritylation 的效率也不可能達到 100% ，沒有脫保護的 5-OH

20、 會跳過該循環(huán)而直接進入下一個循環(huán)， 造成中 間缺堿基的失敗序列；至于 插入突變 ，引物序列中往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過程中，正在偶連的部分堿基 發(fā)生丟失 DMT ，處于活性狀態(tài)的新堿基在沒有與上一個堿基反應(yīng)前發(fā)生自連，將會造成堿基重 復(fù)，故會發(fā)生插入同一堿基的突變的失敗序列。對于堿基置換的突變 ，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能 100% 脫保護，即引物上可能含有殘 留保護基團，通常發(fā)生在 G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基 G 在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 2,6-diaminopurine （脫嘌呤）， DNA 復(fù)制和 PCR 過程中 DNA 聚合酶將 2,6-diaminopurine 看

21、 作堿基 A ，發(fā)生 G 到 A 的轉(zhuǎn)換，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基 G-A 置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中 發(fā)生的頻率較高。引物合成過程中，造成堿基缺失，插入，置換突變的因素客觀存在，上述各種原因產(chǎn)生的失 敗序列可通過純化不同程度地得到去除。但是基于目前大規(guī)模生產(chǎn)的純化方法，還不能達到 100% 的純度，對 40 mer 以下的 DNA 制品， HPLC 是最好的純化方法，其次是 ULTRA PAGE 而對 40 mer 以上的 DNA 制品 ULTRAPAGE 純化要優(yōu)于單純的 HPLC 純化。所以，如您要對 PCR 產(chǎn)物克隆后測序，一定要選擇 ULTRA PAGE 純化或 HPLC 純化的引物

22、。測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是 40 個堿基以下的引物 , 發(fā)生的概率不大，但是偶爾也會 發(fā)生。 客戶一般可以放心， 引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列復(fù)制到合成儀的， 人為造 成的序列出錯可能微乎其微。 在目前的技術(shù)水平下， 各家公司還沒有辦法徹底解決引物合成出錯 的這個問題。 引物合成的固相合成原理都一樣， 采用的機器也基本相同， 合成主要原料都是由可 數(shù)的幾家跨國公司提供的， 所以每個合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似， 沒有哪家公司可以完全 避免。Q-3. 長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？A-3:引物合成時，每一步反應(yīng)效率都不能達到100% ，產(chǎn)生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀條

23、件都有一直存在。 引物鏈越長， 出錯的頻率累加起來就越高。 客戶總希望合成的引物完全正 確，這種心情可以理解。但是正像 PCR 擴增，不可能絕對保證擴增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成 也不可能保證 100% 正確。通常引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫 聚合酶 PCR 擴增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，特別是長鏈引物合成，出了建議選擇準(zhǔn)備。Q-4. 如何能保證引物的正確性A-4:1. 訂購引物時，選用高純度級純化方法。2. 最好選用小于 40 個堿基的引物。3. 克隆實驗時，一定要選擇 ULTRA PAGE 純化或 HPLC 純化的引物。并且每次克隆都須 進行測序驗證，以保證序列的正確性， 然后再進行進一步實驗。 進行蛋白表達實驗時， 尤其需要Q-5. PCR 產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯誤， 怎么辦 ?A-5:1. 遇到這種情況，首先和我們?nèi)〉寐?lián)系，我們的生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是 核對合成序列是否和定單一致，我們在電腦中保留所有原始數(shù)據(jù)。2. 如果確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆 的。因為引物純度不可能是 100% ，因此，挑選