pcR引物設(shè)計注意事項參考模板

1、ORF (Open reading frame ) 開放閱讀框是基因序列的一部分，包含一段可以編碼蛋白的堿基序列，不能被終止子打斷。CDS(coding sequence)序列是編碼序列，是用來編碼蛋白質(zhì)的那段序列，是mRNA的一部分.通常外顯子指的是編碼蛋白序列.嚴格地說,外顯子是指保留在初級中不被剪切掉的區(qū)域,包括5非翻譯區(qū)(5UTR)、編碼序列和3非翻譯區(qū)(3UTR)。所以mRNA的外顯子的概念應(yīng)該要大于CDS序列的范疇何謂PCR？PCR引物設(shè)計時有哪些注意事項（1） 聚合酶鏈式反應(yīng)簡稱PCR（英文全稱：Polymerase Chain Reaction）。（2）PCR引物設(shè)計原則1設(shè)計

2、的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟件將試圖通過使用每一引物設(shè)計變化的預(yù)定值在這兩個目標間取得平衡。設(shè)計引用有一些需要注意的基本原理： 引物長度 GC含量，一般引物序列中G+C含量一般為40%60%，一對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5端加適量的A、T或G、C尾巴。 退火溫度 退火溫度需要比解鏈溫度低5，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，是DNA雙鏈結(jié)合。一對引物的退火溫度相差46不會影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣

3、的，可以在5575間變化。 避免擴增模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域 選擇擴增片段時最好避開模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計目的片段的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（G）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。 與靶DNA的錯配 引物末端 引物3端是延伸開始的地方，因此要防止錯配就從這里開始。3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。3端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3端不能發(fā)生錯配。如擴增編碼區(qū)域

4、，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。 引物的二級結(jié)構(gòu) 引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。兩引物之間不應(yīng)該存在互補性，尤應(yīng)避免3端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。 為了下一步操作而產(chǎn)生的不完全匹配 5端對擴增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變

5、位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。額外的堿基或多或少會影響擴增的效率，還加大引物二聚體形成的幾率，但是為了下一步的操作就要作出適當(dāng)?shù)摹盃奚薄? / 5PCR引物設(shè)計的黃金法則1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。 DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。 2.引物長度一般在1530堿基之間。 引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合

6、酶進行反應(yīng)。 3.引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72。 GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。 4.引物3端要避開密碼子的第3位。 如擴增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特

7、異性與效率。 5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。 引物3端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。 6. 堿基要隨機分布。 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。 7. 引物自身及引物之間不

8、應(yīng)存在互補序列。 引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。 兩引物之間也不應(yīng)具有互補性，尤其應(yīng)避免3 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進行。 8. 引物5 端和中間G值應(yīng)該相對較高，而3 端G值較低。 G值是指DNA 雙鏈

9、形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5 端和中間G值相對較高，而3 端G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3 端的G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進行分析） 9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。 引物的5 端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。 引物的延伸是從3 端開始

10、的，不能進行任何修飾。3 端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。 10. 擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。 某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（G°）小于58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。11. 引物應(yīng)具有特異性。 引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。 值得一

11、提的是，各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 做Real Time時,用于SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求： 1)   避免重復(fù)堿基，尤其是G. 2)   Tm=58-60度。 3）GC=30-80%. 4)3'端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C.5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 6)PCR擴增產(chǎn)物長度： 引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。 7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上； 要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。 而且引物設(shè)計時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。 至于設(shè)計軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。 做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對于引