流式細胞術(shù)在白血病診斷中的應用

1、四川大學華西醫(yī)院血液科四川大學華西醫(yī)院血液科朱煥玲朱煥玲l FCM：集激光、電子、光電測量、計算機、：集激光、電子、光電測量、計算機、熒光化學、單抗的高科技儀器。熒光化學、單抗的高科技儀器。l對處在快速對處在快速直線流動狀態(tài)直線流動狀態(tài)中的中的單個細胞單個細胞或或生生物顆粒物顆粒進行進行多參數(shù)的多參數(shù)的、定量分析定量分析和和分選分選的技的技術(shù)。術(shù)。l分兩類：臺式機（臨床型）分兩類：臺式機（臨床型） 大型機（大型機（cell sorting).科研用。科研用。BD FACSVantage SE lFCM的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)細胞流動室；細胞流動室；光源；光源；聚光系統(tǒng)；聚光系統(tǒng)；信號檢測器；信號檢測器；電

2、子計算機；電子計算機；細胞分選裝置。細胞分選裝置。光源細胞流動室聚光系統(tǒng)信號監(jiān)測器l數(shù)據(jù)的存儲：數(shù)據(jù)的存儲：listmodel顯示：顯示：單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖(histgram);：常用于分析：常用于分析DNA等；等；雙參數(shù)：二維點圖等（雙參數(shù)：二維點圖等（dot plot) ；等高圖：等高圖：(contour)三維等高圖：三維等高圖：3D plotl設門（設門（gating):一定條件下，熒光強度與細胞內(nèi)DNA含量成正比。只反應一個參數(shù)與細胞數(shù)量間的關系，不能顯示兩個獨立參數(shù)與細胞的關系。 Flow Cytometry cont. Data displayedGreen Fluoresc

3、ence IntensityNumber of CellsUnstained cellsFITC-labeled cellsOne Parameter HistogramRed Fluorescence IntensityGreen Fluorescence IntensityTwo Parameter HistogramContour plot3D plot:細胞多的地方，山峰高。l前向角散射前向角散射(forward scatter FSC):與激光束平與激光束平行的信號。與行的信號。與被測細胞大小有關被測細胞大小有關。l側(cè)向角散射（側(cè)向角散射（side scatter SSC):與激光束

4、呈與激光束呈90的光信號。與的光信號。與細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和顆粒物質(zhì)多少細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和顆粒物質(zhì)多少有關。有關。l采用采用FSC、SSC組合，可區(qū)分淋巴細胞、單核組合，可區(qū)分淋巴細胞、單核細胞、粒細胞等群體。細胞、粒細胞等群體。l熒光素探針標記的細胞所發(fā)熒光。熒光素探針標記的細胞所發(fā)熒光。l熒光信號強弱、多少與細胞的抗原量、內(nèi)含物熒光信號強弱、多少與細胞的抗原量、內(nèi)含物多少有關。多少有關。l常用的熒光顯色劑：常用的熒光顯色劑： FITC： PE：藻紅蛋白藻紅蛋白 PerCP； PI：碘化丙啶，測定碘化丙啶，測定DNA含量。含量。l臨床常用三色熒光檢測，現(xiàn)有四色分析臨床常用三色熒光檢測，現(xiàn)有四色分析。lCD

5、45為造為造血細胞血細胞（紅系除（紅系除外）的共外）的共同抗原。同抗原。避免雜質(zhì)避免雜質(zhì)細胞的沾細胞的沾染。染。CD45: 淋巴細胞單核細胞成熟粒細胞原幼細胞l細胞的分化成熟、細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其分化抗原細胞的分化成熟、細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其分化抗原的逐漸增減是漸進過程，非突變。故同時獲知的逐漸增減是漸進過程，非突變。故同時獲知一個細胞的多種參數(shù)方能正確判斷細胞屬性。一個細胞的多種參數(shù)方能正確判斷細胞屬性。l當細胞發(fā)生克隆增殖后，可出現(xiàn)抗原量變、丟當細胞發(fā)生克隆增殖后，可出現(xiàn)抗原量變、丟失和錯譯表達。失和錯譯表達。l細胞抗原的陽性率及熒光強度是同等重要的指細胞抗原的陽性率及熒光強度是同等重要的指標。標。

6、l單個細胞，新鮮標本，抗凝保存：單個細胞，新鮮標本，抗凝保存：PB；BM；（；（有時有時BM活檢標本）活檢標本）LN（包括包括FNA）；）；CSF；組織浸潤組織浸潤FNA 或活檢標本；或活檢標本；l白血病細胞的抗原表達一定程度遵循正常細胞白血病細胞的抗原表達一定程度遵循正常細胞抗原表達的規(guī)律?？乖磉_的規(guī)律。l白血病細胞為腫瘤性生長，可出現(xiàn)正常細胞表白血病細胞為腫瘤性生長，可出現(xiàn)正常細胞表達以外的異?，F(xiàn)象，如缺失、錯譯表達等。達以外的異?，F(xiàn)象，如缺失、錯譯表達等。l目前未發(fā)現(xiàn)白血病特異性抗原，須多參數(shù)分析。目前未發(fā)現(xiàn)白血病特異性抗原，須多參數(shù)分析。l臨床原臨床原/幼細胞群定性比定量更為重要。幼

7、細胞群定性比定量更為重要。l常用抗體選擇： 核心McAbs:確定淋系或髓系（系特異性） 髓系：CD33、CD13、CD14，cMPO B-cell: CD19、CD10、cCD22 CD20 T-cell:CD7、CD2、CD5、cCD3 紅系：GlyA 巨核細胞：CD41、CD61 非系列特異性：CD34、DR、CD45lCD7/CD117/CD45-protocallHLA-DR/CD13/CD45lCD14/CD2/CD45lCD19/CD5/CD45lCD33/CD34/CD45lCD20/CD10/CD45 CD64,l117,13,33,14,64myeloidl19,10,20B

8、 lineage 7,2,5T lineage lDR,34 immature FAB SubtypeCommon PhenotypeComments/VariationsM0DR.CD13,CD33,CD34,CD7, cMPO*Generally negative for lymphoid markersM1Similar to M0 except CD15M2DR,CD13,CD33,more CD15,lessCD34CD19(+) -t(8;21) favorable prognosisM3DR(-)*,CD13,CD15,CD33,CD34-/+,CD2(+),DR(-) in m

9、aturing AML,consider M3.Myeloid/naturalkiller cell ALCD56(+).M4/M5DR,CD15,CD14,CD33,CD13,CD4weakCD2(+),consider M4EoM6DR,CD13-/+,CD33+/-,CD34,CD45 weakMature forms express glycophorinM7DR-/+,CD33+/-,CD34,CD41,CD61Beware of platelet.adhesionDiagnosis: AML- M1Antigen Profile: positive : DR, CD13, CD34

10、, CD38; partially positive for CD7,negative cCD3.Diagnosis: Acute myeloid leukemia with differentiation (AML M2) with features consistent with t(8;21)Antigen Profile: Positive for CD33(dim), CD34, CD13, CD15 CD11b (partial) with CD19. Negative for CD56,CD10,CD2 72 , female . A bone marrow examinatio

11、n was performed.Diagnosis: AML- M5Antigen Profile: Positive for CD33, CD38,CD34,HLADR, CD4(dim), CD64, CD13,CD14, CD11b and CD15.Diagnosis: Erythroleukemia (FAB M6)Antigen Profile: Blasts positive for CD33, CD71, CD34, CD38, CD13; Diagnosis: Acute megakaryoblastic leukemia (FAB M7)Antigen Profile: P

12、ositive for CD33, CD71, CD34, CD61SubtypeCommon PhenotypeComments/VariationsB-precursor ALLDR, CD19, CD20-/+, CD10+/-, CD34, TdT,sIg(-)Infants CD10(-) Multile myeloid Agt(9;22)Pre-B ALLDR,CD19,CD20+/-,CD10, CD34(-),cIgM(+),TdT+/-t(1;19)-CD34(-)poor prognosis.B-ALLDR,CD19,CD20,CD22,CD24, CD10+/-,CD34

13、(-),SIg L3T-ALLcCD3,CD5,CD7,CD1,CD2,dual CD4/8,CD10+/-CD34-/+Frequently lose T-cell Ag.6y. Girl, Hb: 100g/LWBC:10X10G/L,LC80%Plt. 85X10G/LDiagnosis: ALL, B-precursor type (common ALL)Antigen Profile: Positive for CD71, CD19, CD10, CD22, HLADR, CD34; dimly positive for CD33A 15 year old girl who play

14、ed for her high school soccer team noted to have difficulty breathing during her workouts. A chest x-ray revealed a large mediastinal mass, and she was found to have anemia and an elevated white blood countDiagnosis: ALL, T-cell Antigen Profile: Positive for CD7, CD5, CD3, CD34, CD10; partly positiv

15、e for CD4 and CD8Diagnosis: B-Precursor ALL (common ALL)Antigen profile: Positive for CD19, CD10, CD34, HLADR; negative for CD20, CD45, smIglAUL：僅占僅占1%典型的典型的AUL：DR+，CD34+ with no lineage-specific antigens.lBiphenotypic leukemia(mixed):僅有僅有7%能嚴格符合此型。過度診能嚴格符合此型。過度診斷是由于：斷是由于：未排除非白血病細胞；未排除非白血病細胞；非特異性結(jié)合；

16、非特異性結(jié)合；某些抗體缺乏系特異性；某些抗體缺乏系特異性；l特異性抗原為：特異性抗原為： BcCD22; TCD3; MMPO;Points B-淋巴淋巴 T-淋巴淋巴 髓系髓系 2 cCD79a cCD3 cMPO CD22 TCRab cIgM TCRrd 1 CD19 CD2 CD117 CD10 CD5 CD13 CD20 CD8 CD33 0.5 TdT TdT CD14 CD7Diagnosis: Acute mixed lineage leukemia with t(4;11)Antigen Profile: One population CD19+CD22+DR+CD20-CD

17、10-; another CD33+DR+CD64+CD14+DisorderCommon PhenotypeComments/VariationsCLLDR,CD19,CD20,CD5, CD22(-), CD23,CD10(-).clonal SIgM,FMC7(-)CD20 dimPLLDR,CD19,CD20.CD5(-),CD22, CD23(-),CD10(-),bright clonal SIgCD20 bright。CLL/PLL(30%幼淋細胞)MCLDR, CD19,CD20, CD5, CD22, CD23(-),CD10(-)FMC7(+)SIg bright Cycl

18、in D1 overexpressedFCC lymphomaDR,CD19,CD20,CD5(-),CD22, C23+/-,CD10CD10 negative20% HCLDR,CD19,CD20,CD5(-),CD22,CD23(-),CD10(-),CD11c,CD25,CD103SIgD common,very bright CD22 and CD11cPlasma cell dyscrasiasDR(-),CD19(-),CD20(-),CD22(-),CD38,CD45,clonal cIg,Bright CD38,dim CD45 73 , woman,mild splenomegaly ,WBC normal,with slight relative lymphocytosis, a PB specimen was sent for flow cytometryDiagnosis: Chronic lymphocytic leukemiaAntigen Profile: Positive for CD19, CD22, CD5, kappa, CD23, dimly positive for CD20; MCLAg profile: positive for CD19,CD5,lambda(bright),CD20（bright),FMC7.