免疫比濁膠乳顆粒使用

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上膠乳微球使用中常見問題及解答問：產(chǎn)品說明書中給出的膠乳粒徑是平均粒徑嗎？ 答：產(chǎn)品說明書中給出的膠乳粒徑（Diameter）是平均粒徑。 問：如何選擇膠乳微球的粒徑？ 答：一般選擇粒徑小的膠乳微球，則需要的抗體量就多，精密度和線性相對較好，而選擇粒徑大的膠乳微球性，則所需抗體少，精密度和線性相對較差，相對于小球，大球的靈敏度較 好。 問：一般情況下我們所使用的微球的濃度大概是多少？ 答： 整個(gè)測定體系中， 微球的濃度大約在 0.01%左右， 當(dāng)然這與試劑本身規(guī)定的線性有關(guān)系。問：在使用離心方法偶聯(lián)乳膠微球，一般需要多大的（相對）離心力？ 答：需要多大的離心力和所使用的

2、乳膠微球有關(guān)，一般 70nm 左右的微球大概 13000g/min 30min 以上，粒徑越小所需時(shí)間越長，離心力越大。 問：蛋白（抗體）與微球偶聯(lián)前，是不是微球的活化時(shí)間越長，效率越好？ 答：羧基微球的活化所需時(shí)間很短，一般以 10-20 分鐘為宜，長時(shí)間的活化反而會(huì)降低偶聯(lián) 效率。 問：由于抗體不只是 FC 的氨基酸上有 NH2，是不是表示它可以在任何方向與 EDCA 活化 微球偶聯(lián)呢？如果是這樣，是不是會(huì)影響抗體與抗原的特異性反應(yīng)？ 答： 事實(shí)的確如此，當(dāng)然由于抗體的空間折疊方式和 FC 端疏水性強(qiáng)，因此偶聯(lián)反應(yīng)的絕大 多數(shù)發(fā)生在 Fc 端，對抗體與抗原的結(jié)合的影響不大。 問：膠乳微球與

3、抗體偶聯(lián)后，當(dāng)時(shí)沒發(fā)現(xiàn)有凝集，但隔夜后發(fā)現(xiàn)有凝集，這是什么原因？ 如何控制和避免？ 答：這種情況一般是偶聯(lián)效率低的原因。當(dāng)體系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交 聯(lián)后還空出許多反應(yīng)基團(tuán)時(shí)， 這些基團(tuán)又可以與相連微球上的蛋白反應(yīng)， 結(jié)果是把球又拉在 一起了，所以有聚集?？梢约右恍┳钄鄤?解決,常見的是 BSA，另外，也可提高微球的交聯(lián) 率。但為什么是過一段時(shí)間后才出現(xiàn)凝集呢，這是因?yàn)槲⑶蚺悸?lián)上蛋白后，相互之間由于攜 帶同種電荷的關(guān)系，比較穩(wěn)定（所以能以膠體樣存在），只有當(dāng)偶爾相互碰撞，遇上彼此的 反應(yīng)基團(tuán)時(shí)才能結(jié)合。 3、膠乳的自凝現(xiàn)象如何控制和避免？ 答：膠乳自凝與許多因素有關(guān)，如高電解質(zhì)

4、濃度、表面價(jià)電荷被中和、或置于某些不利環(huán)境 如冷凍時(shí)。如果電解質(zhì)濃度升高到某一水平，使得表面的價(jià)負(fù)荷被掩蔽，膠乳微球之間發(fā)生 接觸，于是便產(chǎn)生凝集，故高離子強(qiáng)度的緩沖溶液不應(yīng)使用，緩沖溶液的的濃度不要超過 50mM，但有些 CML 膠乳微球具有高電荷密度，則也能夠耐受較高的離子強(qiáng)度。對負(fù)電荷 膠乳微球，不能使用陽電荷的緩沖溶液如 Tris 緩沖溶液，因?yàn)槟苁闺姾芍泻投Ｔ陂L 期貯藏時(shí)，懸浮介質(zhì)的 pH 值應(yīng)至少保持在比膠乳微球表面基團(tuán)的 pKa 值高 1-2pH 單位。 高濃度的膠乳微球容易促使膠體不穩(wěn)定， 故膠乳微球的濃度盡量以低濃度為宜， 膠乳微球也 不能受冷凍，否則會(huì)凝集。 問：抗體

5、偶聯(lián)至羧基微球后，即時(shí)檢測效果很好，但置于 37 度 2 天后，抗體活性似乎下降 很大，什么原因？ 答：這種情況大概是以下情況所致：一、乳膠微球含有表面活性劑，導(dǎo)致膠乳自身出現(xiàn)自凝 現(xiàn)象，可以通過顯微鏡進(jìn)行觀察，如果是膠乳含有活性劑，則在偶聯(lián)之前進(jìn)行清洗，保證偶 聯(lián)的膠乳微球沒有聚集。二、如果共價(jià)結(jié)合反應(yīng)是成功的而抗體活性失活如此迅速，最常見 的原因是抗體質(zhì)量差或試劑過期所致， 而且還會(huì)出現(xiàn)一個(gè)自由流動(dòng)白色粉末、 持續(xù)性團(tuán)塊等， 這表表明試劑已被污染。 問：膠乳溶液用什么緩沖液多大離子強(qiáng)度保存穩(wěn)定性最好？ 答：一般常用的是低濃度的 Goods 緩沖液，如 MOPSO、MES、HEPES 等緩沖

6、液，濃度在 25-50mmol/L。 問：膠乳微球偶聯(lián)抗體后與抗原進(jìn)行反應(yīng)，但是反應(yīng)不明顯，是什么原因所致？ 答：抗原和抗體不匹配；包被的抗體量下足；抗體使用量雖多，但偶聯(lián)效率低。問：如何選擇膠乳試劑的波長？ 答： 膠乳試劑隨著檢測波長的增加吸光度降低， 為了保證試劑檢測過程中不超過吸光度的檢 測限，一般膠乳試劑的波長選擇在 546-600nm 左右。 微球表面基團(tuán)種類及其反應(yīng)微球表面基團(tuán)活化劑與之反應(yīng)之基團(tuán)生成化學(xué)鍵類型羧基EDC；EDC/(sulfo)NHS；CDI；CMPI伯氨；仲氨酰胺；仲胺氨基交聯(lián)劑 硼氫化氰羥基琥珀酰亞胺酯； 醛基；鹵乙?；?；氯甲基酯酰胺；仲胺或叔胺酰肼交聯(lián)劑；硼氫

7、化氰羥基琥珀酰亞胺酯；醛基二酰基肼；還原型腙醛基硼氫化氰；苯胺酰肼；肼；氨氧基腙；肟環(huán)氧基氨基；巰基；羥基仲胺；硫醚；醚巰基交聯(lián)劑；四硫磺酸鈉 ；4,4'-聯(lián)吡啶二硫醚馬來酰亞胺；鹵乙?；?；二硫吡啶；環(huán)氧基；羥基琥珀酰亞胺酯；乙烯砜硫醚；二硫化物硫醚；羥基CDI；對甲苯磺酰氯 羥基 溴化氰；DSC ；雙環(huán)氧基化合物氨基；巰基；羥基胺；仲胺；硫醚；醚金屬基硫醇或二硫醇硅羥基硅烷共價(jià)結(jié)合膠乳微球的參考方法A. 一步法 1. 配制 50 mM 的 MES 反應(yīng)緩沖溶液，pH 值為 6.0； 2. 將蛋白質(zhì)溶解于反應(yīng)緩沖溶液中，其濃度為 10mg/ml； 3. 用反應(yīng)緩沖溶液稀釋膠乳微球，使其

8、濃度為 1%（W/V）； 4. 將上述蛋白質(zhì)溶液與膠乳微球混和，混和后在室溫培育 20 分鐘； 5. 用去離子水配制 EDAC 溶液，濃度為 10 mg/ml（52 mol/ml）； 6. 取計(jì)算量的 EDAC 溶液加到蛋白質(zhì)與膠乳微球混合液中； 7. 用 0.1 M 氫氧化鈉（NaOH）溶液調(diào)整該反應(yīng)混合液的 pH 值至 6.5±0.2，在搖床室溫 培育 2 小時(shí)； 8. 將未結(jié)合的蛋白質(zhì)除去，貯藏于緩沖溶液中。 B. 二步法 簡單二步法 1. 用反應(yīng)緩沖溶液稀釋膠乳微球，使其濃度為 1%（W/V）； 2.1ml 膠乳微球懸浮液，加入 20 mg EDAC，在室溫培育 40 分鐘，

9、在 20 分鐘后第二次加入 20 mg/ml； 3.用相等體積的該緩沖溶液來洗滌膠乳微球，離心，用 1 倍體積的緩沖溶液重復(fù)處理； 4.將蛋白質(zhì)溶解于 50-100mM 的 MES 緩沖溶液中，蛋白質(zhì)濃度為 1mg/ml； 5.再將膠乳微球懸浮于去離子水或結(jié)合的緩沖溶液中， 迅速加入溶解的蛋白質(zhì)， 37攪拌反 應(yīng) 3 小時(shí)； 6.按 1ml 反應(yīng)混合液加入 2.5 l 乙醇胺混合，攪拌反應(yīng) 10 分鐘； 7.除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，貯藏與貯存的緩沖溶液中。 生成 NHS-酯的中間體二步法 1.每 ml 反應(yīng)混合物加入下列各物： a.去離子水是最后容積為 1.0 ml； b.0.1 ml 的 10x

10、 的貯備緩沖溶液，其 pH 值為 6.0-6.5（一般可用 0.5 M MES 緩沖溶液）； 膠乳微球最終濃度為 1%（W/V）； c.0.23 ml 的 50 mg/ml 的 NHS 在去離子水中的溶液； d.19.2 mg/ml (100 mM)的 EDAC 在去離子水中的溶液（注 5、6）； 2.在室溫將此混合物反應(yīng) 15-30 分鐘，不斷攪拌； 3.用 MES 緩沖液或純化水洗滌膠乳微球懸浮物，除去未反應(yīng)的 NHS 和 EDAC； 4.重新將膠乳微球在去離子水中懸浮，使其濃度為 1%（w/v）； 5.將結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于50-100mM 的MES緩沖溶液中，濃度為1 

11、mg/ml； 6.立即加入蛋白質(zhì)溶液（膠乳微球、蛋白質(zhì)和緩沖溶液的濃度分別為0.5%(w/v)、0.5 mg/ml、25-50 mM）； 7.將混合物反應(yīng)至少2小時(shí)，輕輕攪拌； 8. 按1ml反應(yīng)混合液加入2.5 l乙醇胺混合，攪拌反應(yīng)10分鐘； 9.除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)和乙醇胺，貯與適宜的貯存緩沖溶液中。C 、蛋白質(zhì)與帶醛基的膠乳微球反應(yīng) 帶醛基的膠乳微球是疏水性的膠乳微球，能吸附并能與蛋白質(zhì)在中性 pH 條件下生成 Schiff 堿， 這是脂肪族醛基與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生的反應(yīng) （賴氨酸的伯胺） 。 這些膠乳微球不需事先 活化而生成共價(jià)鏈。 Schiff 堿的生成是可逆反應(yīng)。此 Schiff 堿能被氰基氫硼化鈉（ sodium cyanoborohydride ） 反應(yīng)還原至穩(wěn)定的烷基胺。 當(dāng)肽類或其他有單一反應(yīng)氨基的分子與帶醛 基的膠乳微球結(jié)合時(shí)，由于還原而趨向穩(wěn)定。 下面說明蛋白質(zhì)與帶醛基的膠乳微球結(jié)合的方法： 1. 配制