脯氨酸含量的測定

1、植物組織游離脯氨酸含量的測定（一）實(shí)驗(yàn)原理      植物在逆境條件下，游離脯氨酸便會(huì)大量積累，且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。      采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減少了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態(tài)(干或鮮樣)限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520 nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內(nèi)與其消光度成正比。 （二）實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備及試劑&

2、#160;1 材料植物葉片     2 儀器設(shè)備 分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，漏斗，具塞刻度試管(20 ml) ，移液槍（1 ml和5 ml），5 ml和1 ml刻度試管，燒杯，吸水紙，玻璃棒，試管架，比色皿等。3 試劑 (1) 3磺基水楊酸溶液 ：萬分之一電子天平稱取3 g磺基水楊酸，然后將稱好藥品溶于100 ml蒸餾水中。    (2) 甲苯 (3) 2.5酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6 mol L-l磷酸以3:2混合，作為溶劑進(jìn)行配制，此液在4下23天有效

3、（此步驟重要）。 稱取1.25 g茚三酮放入燒杯中用混合液50 ml放入70水浴鍋中溶解，冷卻。(4) 脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取25 mg脯氨酸，用蒸餾水溶解后定容至250 ml，其濃度為100 ug/ml。再取此液10 ml，用蒸餾水稀釋至100 ml，即成10 ug/ml的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。  三實(shí)驗(yàn)方法1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 （1）取7支具塞刻度試管按表2加入各試劑。混勻后加玻璃球塞，在沸水中加熱40 min。試管號(hào)0123456脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液/ml00.20.40.81.21.62水/ml21.61.20.80.40.20冰乙酸/ml2222222茚三酮顯

4、色液/ml3333333脯氨酸含量/µg0248121620（2）取出冷卻后向各管加入5 ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以0號(hào)管作為對照在波長520 nm下比色。 （3）以消光值為縱坐標(biāo)，脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程 。2 樣品測定     （1）脯氨酸提取：從-80冰箱中取出樣品，放入事先裝好液氮的保溫桶中。每個(gè)樣品均取0.2 g左右，分別置于大試管中，加入5 ml 3磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10 min。 （2）取出試管，待

5、冷卻至室溫后，吸取上清液2 ml，加2 ml冰乙酸和3 ml顯色液，于沸水浴中加熱40 min，下步操作按標(biāo)準(zhǔn)曲線制做方法進(jìn)行甲苯萃取和比色（向各管加入5 ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以0號(hào)管作為對照在波長520 nm下比色）。  （3）結(jié)果計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測定液中脯氨酸濃度 脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。     脯氨酸g.g-1(干或鮮重)=(C·V)·(a·W)1    式中：C一提取液中脯氨酸濃度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得：

6、            V  提取液總體積（ml）            A -  測定時(shí)所吸取得體積（ml）            W- 樣品重（g）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表海拔處理編號(hào)吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率稀釋倍數(shù)提取液中脯

7、氨酸含量C（ug）提取液總體積V（ml）測定時(shí)所吸取的體積a（ml）樣品重（W）脯氨酸含量 ugg平均值2900CK1 1 11 1 21 1 31 1 4PEG1 2 11 2 21 2 31 2 43000CK2 1 12 1 22 1 32 1 4PEG2 2 12 2 22 2 32 2 43100CK3 1 13 1 23 1 33 1 4PEG3 2 13 2 23 2 33 2 43258CK4 1 14 1 24 1 34 1 4PEG4 2 14 2 24 2 34 2 43600CK5 1 15 1 25 1 35 1 4PEG5 2 15 2 25 2 35 2 43600-1CK6 1 16 1 26 1 36 1 4PEG6 2 16 2 26 2 36 2 43700CK7 1 17 1 27 1 37 1 4PEG7 2 17 2 27 2 37 2 43800CK8 1 18 1 28 1 38 1 4PEG8 2 18 2 28 2 38 2 43900CK9 1 19 1 29 1 39 1 4PEG9 2 19 2 29 2 39 2 44000CK10 1 110 1 210 1 310 1 4PEG10 2 110 2 210