醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì) （一）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)計(jì)原則。原則上臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。這4個(gè)區(qū)域在物理空間上必須是完全相互獨(dú)立的，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。例如使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并；采用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)為一體的自動(dòng)化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。各區(qū)的功能是： 1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合

2、液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。 2.標(biāo)本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。對(duì)于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。 3.擴(kuò)增區(qū)：cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測(cè)。 4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測(cè)定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測(cè)序等。 （二）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向可按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域。可按照從試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力遞減的方式進(jìn)行?？赏?/p>

3、過安裝排風(fēng)扇、負(fù)壓排風(fēng)裝置或其他可行的方式實(shí)現(xiàn)。 （三）工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)。 1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)。 （1）28和-20以下冰箱。 （2）混勻器。 （3）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）。 （4）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。 （5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭。 （6）專用工作服和工作鞋(套)。 （7）專用辦公用品。 2.標(biāo)本制備區(qū)。 （1）2-8冰箱、-20或-80冰箱。 （2）高速離心機(jī)。 （3）混勻器。 （4）水浴箱或加熱模塊。 （5）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）。 （6）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面） 。 （7）生物安全柜。

4、（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。 （9）專用工作服和工作鞋(套)。 （10）專用辦公用品。 （11）如需處理大分子DNA，應(yīng)當(dāng)具有超聲波水浴儀。 3.擴(kuò)增區(qū)。 （1）核酸擴(kuò)增儀。 （2）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl），（視情況定）。 （3）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。 （4）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。 （5）專用工作服和工作鞋。 （6）專用辦公用品。 4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 視檢驗(yàn)方法不同而定，基本配置如下： （1）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）。 （2）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。 （3

5、）消耗品：一次性手套、加樣器吸頭（帶濾芯）。 （4）專用工作服和工作鞋。 （5）專用辦公用品。 上述各區(qū)域儀器設(shè)備配備為基本配備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù)自己使用的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)或試劑的特點(diǎn)，對(duì)儀器設(shè)備進(jìn)行必要的增減。 二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作基本原則 (一)進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū) 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 (二)各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。 (三)不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。 (四)實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)

6、行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。 (五)工作結(jié)束后，必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面應(yīng)當(dāng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照射應(yīng)當(dāng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對(duì)去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動(dòng)紫外燈（254nm波長(zhǎng)），在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上6090cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對(duì)（bp），對(duì)紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長(zhǎng)照射時(shí)間，最好是照射過夜。 (六)實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符合實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求（GB19489-2008）。 三、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域工作

7、注意事項(xiàng) (一)試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)，試劑盒中的陽性對(duì)照品及質(zhì)控品不應(yīng)當(dāng)保存在該區(qū)，應(yīng)當(dāng)保存在標(biāo)本處理區(qū)。 (二)標(biāo)本制備區(qū)。由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件，避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。 (三)擴(kuò)增區(qū)。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)當(dāng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。必須注意的是，所有經(jīng)過檢測(cè)的反應(yīng)管不得在此區(qū)域打開。 (四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法（放射性核素標(biāo)記或非放射性核素標(biāo)記）、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測(cè)序方法、質(zhì)譜分析等。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1 mol/L HCl中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)當(dāng)至遠(yuǎn)離