用DefH9-iaaM和TERF1基因轉(zhuǎn)化糖橙的研究

1、用DefH9-iaaM和TERF1基因轉(zhuǎn)化糖橙的研究柑橘是世界第一大水果,2006年,世界柑橘年產(chǎn)量1.1億噸,面積10730萬(wàn)畝,年貿(mào)易額達(dá)65億美元,堪稱世界第一大水果。我國(guó)是柑橘的重要原產(chǎn)地之一,柑橘資源豐富,優(yōu)良品種繁多,栽培歷史悠久。2006年我國(guó)柑橘面積已超過(guò)170萬(wàn)公頃,占世界柑橘總面積的23%,居世界第一位,產(chǎn)量近1800萬(wàn)噸,居世界第二位。柑橘已經(jīng)成為我國(guó)南方經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。但是我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)雖有一定的基礎(chǔ),但與世界柑橘生產(chǎn)先進(jìn)國(guó)家相比,差距還較大。特別是在品種選育方面還需進(jìn)一步加強(qiáng)。柑橘是木本植物,存在童期長(zhǎng)、珠心胚干擾、高度雜合、遺傳背景復(fù)雜等缺點(diǎn),導(dǎo)致常規(guī)育種的方法不僅存

2、在很大的盲目性,而且育種效率低。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,與傳統(tǒng)育種方法相比,利用基因工程培育新品種不受基因型限制,目的基因來(lái)源廣泛,可以定向地改變目標(biāo)性狀等優(yōu)點(diǎn),采用成年態(tài)材料作為轉(zhuǎn)化受體,還可以大大縮短育種周期,研究外源基因?qū)χ参镩_花和結(jié)果的影響。糖橙由于純甜似蜜,深受消費(fèi)者的喜愛。但糖橙種籽較多,目前還沒(méi)有無(wú)核的糖橙品種,同時(shí)細(xì)菌病害和真菌病害危害較多,增強(qiáng)抗病性也是主要育種目標(biāo)之一。因此本項(xiàng)研究的目的是建立糖橙的高效再生轉(zhuǎn)化體系和成年態(tài)再生轉(zhuǎn)化體系，在此基礎(chǔ)上把defH9-iaaM基因，即來(lái)自金魚草的iaaM基因和來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的DefH9啟動(dòng)子導(dǎo)入柑橘中,以期望獲得具有單性結(jié)實(shí)能力的新種質(zhì)

3、。其次,將通過(guò)酵母單雜交從番茄中克隆的轉(zhuǎn)錄因子TERF1導(dǎo)入糖橙中，期望能夠獲得對(duì)柑橘主要病害如潰瘍病、炭疽病有廣譜抗性的新種質(zhì)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因的種質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)、形態(tài)學(xué)觀測(cè)和抗病性等方面的研究,綜合評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因育種對(duì)品種改良方面的作用。本試驗(yàn)獲得主要研究結(jié)果如下:(1)建立糖橙實(shí)生態(tài)的再生培養(yǎng)體系。以30d苗齡的糖橙實(shí)生態(tài)節(jié)間莖段不定芽分化率較高,暗培養(yǎng)可以顯著的提高不定芽的再生率。篩選出適宜實(shí)生態(tài)節(jié)間莖段再生的不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基:MS+5mg/L6-BA;不定芽增殖培養(yǎng)基：MS+1.0mg/L6-BA+NAA1.0mg/L;生根培養(yǎng)基:MS+0.5mg/LNAA。其中采用兩步法誘導(dǎo)不定芽再生

4、和生根效果較好。(2)建立了成年態(tài)糖橙的不定芽再生體系。用改良的消毒方法G,即采枝梢前一周，每隔一天下午，于溫室中將要采取的枝梢用10%的次氯酸鈉溶液擦拭一遍,共擦拭4次,且供試植株須隔離放置。再采用70%的酒精處理30s,再用1%的升汞溶液加幾滴吐溫浸泡24min,無(wú)菌水沖洗4次進(jìn)行消毒?？娠@著的提高成年態(tài)節(jié)間莖段的成活率。成年態(tài)節(jié)間莖段培養(yǎng)基以6-BA5mg/L+2,4-D2mg/L+IAA2mg/L培養(yǎng)的效果最好,莖段愈傷誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率最高可達(dá)17.8%和2.87個(gè)。對(duì)成年態(tài)不定芽的嫁接進(jìn)行了研究，認(rèn)為經(jīng)過(guò)改良的壓法成活率較高，可以達(dá)到78.94%。(3)建立了將DefH9-iaa

5、M基因和TERF1S因兩個(gè)外源基因?qū)氲綄?shí)生態(tài)糖橙的轉(zhuǎn)化體系。研究了不同根癌農(nóng)桿菌對(duì)糖橙實(shí)生態(tài)節(jié)間莖段的轉(zhuǎn)化率,結(jié)果顯示EHA105的轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)于LBA4404浸染時(shí)間以15min為宜。針對(duì)糖橙實(shí)生態(tài)節(jié)間莖段和成年態(tài)節(jié)間莖段再生能力的差異性,認(rèn)為卡那霉素濃度為100mg/L時(shí)適合對(duì)糖橙實(shí)生態(tài)節(jié)間莖段再生不定芽進(jìn)行篩選，卡那霉素濃度為30mg/L時(shí)適合對(duì)柑橘成年態(tài)節(jié)間莖段再生不定芽進(jìn)行篩選,通過(guò)PCFRI定,不定芽的轉(zhuǎn)化率高達(dá)29.4%。(4)通過(guò)PCRI定，結(jié)果顯示以獲得了6株轉(zhuǎn)DefH9-iaaM基因植株,通過(guò)形態(tài)學(xué)的研究證實(shí),這6株轉(zhuǎn)基因植株在株高、節(jié)間長(zhǎng)度、葉面積方面比對(duì)照有明顯的增長(zhǎng)、

6、增寬現(xiàn)象。利用PCRRT-PCRSouthern雜交技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)TERF仰因的糖橙進(jìn)行了分子檢測(cè)，結(jié)果顯示，共獲得了7株轉(zhuǎn)TERF供因植株株系。通過(guò)對(duì)3,7,11號(hào)植株的Southern雜交，結(jié)果顯示TERF值因已經(jīng)成功的整合到了糖橙的基因組中，且均為為單拷貝插入。從植株形態(tài)特征表現(xiàn)上看，轉(zhuǎn)TERF仰因的植株與未轉(zhuǎn)化植株無(wú)顯著差異。(5)對(duì)轉(zhuǎn)TERF1基因的糖橙進(jìn)行離體潰瘍病和炭疽病的接種試驗(yàn)。通過(guò)對(duì)病斑大小和數(shù)量的分析,結(jié)果表明1,3,7,8,11號(hào)株系對(duì)柑橘潰瘍病和炭疽病表現(xiàn)出廣譜抗性。接種潰瘍病病害時(shí),3號(hào)株系對(duì)潰瘍病的抗病性最強(qiáng),發(fā)病級(jí)別為0級(jí)。其余轉(zhuǎn)基因植株潰瘍病的發(fā)病率比對(duì)照植株下降了70%左右。進(jìn)行炭疽病