用quantityone進(jìn)行定量分析的方法

1、v1.0可編輯可修改用QuantityOne進(jìn)行定量分析的方法生物技術(shù)2009-09-06,21:17葉林QuantityOne是Bio-Rad公司的凝膠電泳圖像獲取、處理以及定量分析軟件。功能很強(qiáng)大，到底多么強(qiáng)大在這就不說了。用處很多，到底多么多在這也不說了，具體功能請參考QuantityOne使用說明及相關(guān)教程。下面只是QuantityOne用于DGGE吉果定量分析的一般操作方法：有下面這么一張DGGt®像，需要分析一下左邊第5條泳道的8個條帶對應(yīng)的DNA在樣品中占的百分比各分別是多少。第一步：建立泳道點(diǎn)擊菜單欄“Lane-AutoFrameLanes",一般情況下Qu

2、antityOne會自動識別并建立泳道。但也有很多時候不能自動建立泳道，這就需要選擇菜單欄“Lane-FrameLanes”然后輸入要建立泳道的數(shù)目，手動建立泳道。泳道建立后需要調(diào)整，在菜單欄“Lane-EditFrame'中有拉伸、旋轉(zhuǎn)、移動、添加/刪除錨點(diǎn)等選項(xiàng)，通過這些選項(xiàng)可以對泳道進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整后大致如下：wwwgrelNiskycom第二步：消除泳道背景點(diǎn)擊菜單欄“Lane-LaneBackground”跳出一個對話框，“AllLanes”中選擇第二個，然后點(diǎn)一下第“SelectedLane"的下面會顯示SelectedLan:#5(#5),然后選擇“LaneOn&

3、quot;RollingDiskSize20之間的數(shù)(可以多嘗試幾個，看看效果)，最后點(diǎn)“Donee'完成操作。第三步：建立條帶點(diǎn)擊菜單欄“Band->DetectBands”打開一個對話框，調(diào)整Sensitivity和LaneWidth的數(shù)值，5條泳道，中填一個10使每個條帶都Brackets ,使被檢測到，如果條帶上面顯示的是一條紅線，可以在"Band-BandAttributes”的Style欄中選擇之顯示為括號形式。條帶建立后圖像顯示如下：wwwyelinslsy.caoim第四步：生成報告點(diǎn)擊菜單欄“Report-LaneReport"然后點(diǎn)一下第五

4、條泳道，在彈出的對話框的Measurements一欄中選擇TraceQty（個人感覺選擇這個比較合適，也可以選擇其他的看看效果）,然后點(diǎn)Report,就看到了每個條帶的TraceQty值，這個值與DNA的濃度呈正比，根據(jù)這個值計(jì)算百分比即可。以上僅僅是QuantityOne進(jìn)行定量的簡單流程，非常不具體，一些具體的參數(shù)設(shè)置及軟件的其它功能請參考相關(guān)的使用說明或教程。另外，不確定上面的操作是否有不當(dāng)之處，如有請多指教。需要特別說明的一點(diǎn)是：對于一個從復(fù)雜的環(huán)境樣品中提取的DNA經(jīng)過PCR-DGGE然后用QuantityOne定量，通過分析每條條帶的intensity來計(jì)算百分比，然后估計(jì)原始樣品

5、中各個物種（比如細(xì)菌）的百分比，這樣的做法是非常不準(zhǔn)確的，這種數(shù)據(jù)發(fā)paper可能不會被接受，因?yàn)檎麄€過程中存在很多Bias。同理，T-RFLP也存在類似問題。QuantityOne施用教程大全（轉(zhuǎn)貼）2010-11-1109:531 -內(nèi)容簡介凝膠電泳是每個做份子有生命的物質(zhì)學(xué)的同窗天天都要打交道的基本技術(shù)。電泳然后的信息處理與電泳本身同樣重要。今朝有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，比較有名的比如BandScanBandLeader、SigmaGel等等。今日要向大家介紹的是來自Bio-Rad的1D凝膠定量軟件QuantityOne(Bio-Rad還有一個做2D凝膠分析的軟件PDQuest。這

6、個軟件的最新版本可以在Bio-Rad的主頁不收費(fèi)下載。今朝的最新版本是版2 -QuantityOne的定量方法QuantityOne的分析功能顧名思義首要用來舉行凝膠或培養(yǎng)皿的熒光定量分析。它的分析功能或說分析方式首要有4種：泳道/條帶軌跡定量法；等高線直接定量法；菌落計(jì)數(shù)；份子量測定這三種方法中施用最為利便也是最為廣泛的應(yīng)該是等高線定量法(VolumnContour)。它經(jīng)由過程半AUTO的繪電泳條帶的等高線邊沿來得到等高線區(qū)域內(nèi)部平面或物體表面的大，再將該平面或物體表面的大乘以區(qū)域內(nèi)平均光疏密程度值當(dāng)?shù)綏l帶內(nèi)部總的信號量。固然這種分析方法的蠹弊顯而易見：無法同等得排除不同泳道的配景亮度；等

7、高線的繪制處于“半AUTO狀態(tài)，即需要人為判斷作為等高線標(biāo)準(zhǔn)的電泳條帶的邊沿；最致命的是在幾個電泳條帶距離十分接近的時辰幾乎無法繪制純一條帶的輪廓(常出現(xiàn)持續(xù)的幾個條帶等高線相連而無法分離出獨(dú)自條帶的輪廓)。三種方法中個人感覺最為科學(xué)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽?yīng)該是泳道/條帶軌跡定量法(TraceTracking)。這種方法施用起來步調(diào)較為繁瑣，必需經(jīng)由過程泳道識別-電泳條帶識別兩個持續(xù)的步調(diào)才氣舉行定量。然而這種方式的最大長處在于它可以純粹丟棄人為主觀因素舉行全AUTCfe量。他的定量方式為：首先根據(jù)不同電泳條帶的光疏密程度值繪制光疏密程度曲線，然后計(jì)算光疏密程度曲線下平面或物體表面的大作為電泳條帶的定量根據(jù)

8、。大家可能會問他能不能排除泳道配景謎底是必定的，它能夠最大程度的排除不同泳道之間的配景差異，讓各個泳道上的不同電泳條帶在一條幾乎不異的開始跑線上舉行相比較。這個配景排除功能是等高線法無法做到的(等高線法也有基本的配景排除措施，但是和泳道/條帶軌跡定量法的配景排除不是一個等級的。等高線法只能排除同一泳道上的配景，而不能均等的排除不同泳道的配景)。另外泳道/條帶軌跡定量法還可以聯(lián)合GaussModelBands對緊密相連的電泳條帶舉行分析，而這種條帶也是等高線法無法分析的。我們這次重點(diǎn)學(xué)習(xí)這個方法。第三個分析功能是菌落計(jì)數(shù)(ColonyCounting)。這個功能其實(shí)很實(shí)用，可以分析藍(lán)白篩選的結(jié)果

9、。但是很奇怪Mycomputer居然無法運(yùn)行這個功能，因此無法向大家介紹了。另外QuantityOne還可以經(jīng)由過程回歸曲線測定份子量。下面讓我們了解一下QuantityOne經(jīng)常使用的基本菜譜操作。打開文件：由于QuantityOne是Bio-Rad的硬件組成一套軟件，因此QuantityOne可以AUTO輸入來自Bio-Rad公司的凝膠分析儀的數(shù)據(jù)。具體支持哪些硬件大家可以在“Edit-Preference-Imagers”里面設(shè)置。如果您的實(shí)驗(yàn)室沒有接納Bio-Rad的硬件設(shè)施也沒瓜葛。您只要將電泳圖片用ACDSe繇程序*$換為TIF圖片格式就能夠被QuantityOne識別了。注重Qu

10、antityOne只支持8位和16位灰度的TIF文件。QuantityOne彷佛有一個小bug,就是在按“OpeH'然后并沒有立刻彈出資源管理器讓你選擇方針文件的位置。其實(shí)你只要將鼠標(biāo)在熒幕右下方點(diǎn)擊一下，資源管理器就會乖乖彈出來了QuantityOne只能分析白的顏色配景玄色條帶的電泳圖。而我們正常環(huán)境下得到的一般都是玄色配景白的顏色條帶的電泳圖。我們可以在“Image-Invertdata中將圖片顏色舉行反轉(zhuǎn)，然后即可以用QuantityOne舉行分析了.文字注解：QuantityOne提供基本的文字注解功能。您可以在您的電泳圖片上記載您的分析結(jié)果比如電泳條帶的份子量、光疏密程度值

11、、事物的量等等。這個功能可以經(jīng)由過程“Edit-TextOverlayTools”來使成為事實(shí)。在彈出的浮動工具欄入選擇“ABC或就能夠舉行文字輸入和畫標(biāo)志線的操作。光疏密程度工具：在“View-PlotDensity”的下級菜譜中大家會見到幾個和電泳條帶光疏密程度值相干的預(yù)示選項(xiàng)。大家可以別離選擇不同的選項(xiàng)感受一下它們之間的不同。選擇方法是點(diǎn)擊響應(yīng)的下級菜譜比如“PlotCrossSection:然后將變成帶一個藍(lán)色感慨號的鼠標(biāo)移到您想懂得光疏密程度的位置，點(diǎn)擊一下就會預(yù)示該處的光疏密程度相干信息。鄙人面這幅圖片中我們可以看見兩條黃線交叉處的電泳條帶的相干信息。上方的一串曲線是不同泳道之間在

12、同一平行線上的光疏密程度比率曲線；左邊是黃線交叉處地點(diǎn)泳道的幾個電泳條帶的光疏密程度漫衍環(huán)境。3DViewer：在“View-3DViewer”菜譜中大家會看到一個有趣的功能叫做3DViewer。這個玩意按照Bio-Rad的說法可以輔助鑒別幾條緊密相連在一路的電泳條帶的漫衍環(huán)境。大家只要選擇了這個號令后鼠標(biāo)就會一個“”型，然后將型移動到您感興趣的位置，拖動鼠標(biāo)畫出一個正方形區(qū)域，然后用鼠標(biāo)雙擊，QuantityOne就會將這塊區(qū)域按照gauss漫衍規(guī)律渲染成一個三維模子，頗有意思。但個人感覺這個功能噱頭多于實(shí)用。4-QuantityOne的基本配景排除功能最起頭的時辰我們就說過Quantity

13、One的等高線定量模式也有一種比較基本的配景排除方法。這個方法同樣也合用于泳道/條帶定量模式。此刻我們就來學(xué)習(xí)這個方法?；九渚芭懦墓δ芪挥凇边@兩個菜譜?！癐mage-Substractbackgroud.”和“Image-FilterWizard.Image-FilterWizard:這個功能是對原始圖片做一些開真?zhèn)€加工，主如果祛除一些圖片上的“斑點(diǎn)”。這些斑點(diǎn)首要有兩種類型：一種是深色的“胡椒面”型和淡色的“食鹽”型，兩種斑點(diǎn)都可以毫不猶豫地去除。從"Image-FilterWizard.”菜譜調(diào)出向?qū)Р俗V后選擇“pepper”和“salt”，下面兩個選項(xiàng)可以按照程序默許的選項(xiàng)

14、，然后“OK就能夠完成這第一步的降噪歷程。Image-Substractbackgroud:這個功能是真正對圖片配景舉行清理的工具（區(qū)別于“Image-FilterWizard.”的降噪模式）。只是這種清理是一種“全局”型的清理，即它以不異的參量對每條泳道舉行配景清理。然而在清理方式上它照舊可以分成兩種不同的方式：BackgroudBox：一種是以一個局部小平面或物體表面的大為標(biāo)準(zhǔn)配景，將整張電泳圖片上所有比該區(qū)域光疏密程度值低的區(qū)域全部漂白。這種發(fā)型稱為“BackgroudBox"。操作時用鼠標(biāo)選中對話框下部左側(cè)的“BackgroudBox”按鍵，然后用鼠標(biāo)在電泳圖片上選擇一塊顏色

15、近乎配景色，色澤比較勻稱的區(qū)域，用鼠標(biāo)拖動畫出一個正方形。開釋鼠標(biāo)后程序就會當(dāng)即對電泳圖片舉行降低配景的處理；BackgroudStripe:相對于“BackgroudBox”來講是一種更加智能化的處理方式。它出格合用于梯度凝膠，即凝膠濃度由上至下依次變化。由于梯度膠的光疏密程度值在一定距離內(nèi)不斷變化，因此如果接納“BackgroudBox”的方法除配景就會發(fā)生偏差。QuantityOne此時提供一種隨著凝膠濃度變化而變化的除配景方式就是“BackgroudStripe"。和“BackgroudBox”近似，選擇右下角的“BackgroudStripe”按鍵，然后用鼠標(biāo)沿著電泳泳道拖

16、放形成一個狹長的剪影帶（Stripe）,這個剪影帶內(nèi)部的光疏密程度值順著泳道逐漸升高或降低。QuantityOne根據(jù)這個Stripe可以動態(tài)的對整張圖片的配景舉行剪影。比如泳道肇始處光疏密程度低，那末QuantityOne在此處的剪影值也降低；隨著Stripe向前延長，光疏密程度值逐漸升高，QuantityOne也同樣不斷加大剪影的強(qiáng)度。這樣一來就能夠排除由于梯度膠帶來的配景不相符的影響因素。5-QuantityOne的電泳泳道分析功能-創(chuàng)建泳道前面說過QuantityOne之所以強(qiáng)大是因?yàn)樗哂械挠镜?條帶軌跡定量法。此刻我們就來學(xué)習(xí)一下如安在電泳圖片上創(chuàng)建泳道（Lane）和怎樣舉行針對不

17、同泳道的配景排除。創(chuàng)建泳道：首先打開我們要分析的電泳圖片（以卵白質(zhì)電泳為例）。然后選擇“Lane-AutoFramelanes"。這時候如果您的電泳圖片比較標(biāo)準(zhǔn)的話，QuantityOne就會AUTOR別出每條電泳泳道的位置，而且將各個泳道的路徑用一條紅線標(biāo)畫出來；如果您對軟件AUTG志的泳道不甚對勁，您可以經(jīng)由過程“Lane-EditFrame'下級各個子菜譜提供的功能對泳道框架位置、大小等舉行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)方法就是經(jīng)由過程鼠標(biāo)的拖放來使成為事實(shí)，大家可以本身體驗(yàn)一下；如果您只消分析此中幾個泳道的數(shù)據(jù)而不想其它泳道的標(biāo)志滋擾您的眼看東西假想線，您可以經(jīng)由過程“Lane-Sing

18、leLane-RemoveLanes刪除您不需要的泳道的標(biāo)志。不是所有的電泳圖片的泳道都能夠被QuantityOneAUTO識別。在不能AUTOR別的環(huán)境下，QuantityOne就會彈出對話框告訴您它不能識別泳道。這時候大家就需要手工繪制電泳泳道。方法和上邊同樣，同過“Lane-SingleLane-CreatLane”來使成為事實(shí)。只要用鼠標(biāo)在您的電泳圖片上順著待標(biāo)志的泳道的中軸線拖放就能夠繪制出該泳道的標(biāo)志紅線.6-QuantityOne的電泳泳道分析功能-排除配景前面說過QuantityOne之所以強(qiáng)大是因?yàn)樗哂械挠镜?條帶軌跡定量法。此刻我們就來學(xué)習(xí)一下如安在電泳圖片上創(chuàng)建泳道（L

19、ane）和怎樣舉行針對不同泳道的配景排除。排除配景：首先請大家注重，這個排除配景和前面我們在“Image”菜譜中施用的“SubstructBackgroud”有所不同。后者排除配景的對象是全般電泳圖片而非將各個電泳泳道的配景別離舉行排除。此刻我們要學(xué)習(xí)的這個號令可以幫忙我們別離排除各個泳道（也能夠?qū)⑷坑镜烙貌划悩?biāo)準(zhǔn)舉行排除）的不同的光疏密程度配景。這個功能對我們以后的分析影響甚大，大家一定好好學(xué)習(xí)。首先我們要將我們的電泳圖片舉行前面談到的泳道識別，不論是AUTOT式照舊手工識別。然后選擇“Lane-LaneBackgroud.”號令。選擇該號令后，鼠標(biāo)即變成一個綠顏色的“”，將鼠標(biāo)移到您籌算

20、舉行配景排除的泳道（比如下圖中的第4泳道），點(diǎn)擊左鍵一下，立刻就會彈出如下圖所示的對話框。此中“OpticalDensity”預(yù)示得是該泳道光疏密程度值的漫衍環(huán)境。大家會注重到這個漫衍曲線其實(shí)不是緊貼著縱軸，而是位于縱軸上方漫衍。造成這個“懸在空中現(xiàn)象”的緣故原由就是該泳道自身存在著一定的光疏密程度“配景”。這個配景的存在導(dǎo)致該泳道上各個電泳條帶之間不能處于同一水平舉行相比較；如果思量到相鄰的其它泳道更是因?yàn)椴煌渚暗拇嬖诙鵁o法相比較不同泳道上的不同電泳條帶。怎樣去除這個配景呢我們繼續(xù)看右面的“LaneBackgroudSubstruction”對話框。這個對話框的上方“AllLanes”表示

21、可以對所有泳道舉行一次性處理；下方的“SelectedLane”表示僅針對這次選中的這個泳道舉行處理（我們選中的是第4泳道）。我們用鼠標(biāo)選擇“SelectedLane”的“LaneOn”選項(xiàng)。然后鄙人面的“RollingDiskSize”里填上“5”，再按“回車”鍵。好！大家再來看看此刻“OpticalDensity”中出現(xiàn)了一條緊緊沿著光疏密程度曲線漫衍的深赭色曲線。這條曲線將泳道的配景與電泳條帶的光疏密程度漫衍十分精確的區(qū)分清楚隔來。大家可能會好奇這搭的“RollingDiskSize”指得是啥子意思我們可以將QuantityOne提供的去除配景功能想象成是一個骨碌的小球。如果這個小球的半

22、徑越小，那末它沿著光疏密程度曲線骨碌時滾過的路徑就越發(fā)精致，具體反映在深赭色曲線的軌跡越發(fā)靠近玄帶顏色的光疏密程度漫衍曲線的基線。因此從理論上來講“RollingDiskSize”的取值越小，它的去除配景效果越好。大家可以試著選擇一個較大的值比如80,再來看看此時深赭色曲線的軌跡。固然也不能取過小的值。因?yàn)槿绻≈颠^小，大家可以想象這個十分微小的球就會滾入光疏密程度曲線內(nèi)部，造成有用陽性信號的損失。個人感覺520是一個比較好的取值范圍.OK我們再在“LaneBackgroudSubstruction”對話框的最下方鉤選“ShowLaneTracewithBackgroudSubstructed

23、”，再來看看是否泳道上所有的配景都被消弭了各個電泳條帶是否純粹聯(lián)合到縱軸上在同一水平舉行比較了我們對其它泳道也能夠依萌產(chǎn)畫瓢舉行近是的配景排除工作。如果大家覺得可以施用同樣的標(biāo)準(zhǔn)，即不異的“RollingDiskSize”舉行排除，那末我們可以在“LaneBackgroudSubstruction”對話框入選才？上方的“AllLanesOn(samelevel)”選項(xiàng)。然后在“RollingDiskSize”中填上一個合適的值，點(diǎn)擊“Done'按鍵確認(rèn)就能夠了。此時該電泳圖片上所有的泳道都以不異的標(biāo)準(zhǔn)舉行了配景去除。不信你可以本身將鼠標(biāo)點(diǎn)擊其它泳道(比如第8道或第1道)，你會發(fā)明所有泳

24、道的配景均已去除。7 -QuantityOne的電泳泳道分析功能-相比較泳道剛才我們已經(jīng)對電泳圖片上的泳道舉行了識別和配景去除。止匕刻我們可以利用QuantityOne提供的泳道相比較功能對同一張凝膠相片上的不同泳道舉行相比較，看看每條泳道上電泳條帶的漫衍環(huán)境。泳道相比較：首先將打開的電泳相片舉行前面談到的泳道識別和去除配景步調(diào)。然后選擇“Lane-CompareLanes”號令，鼠標(biāo)變成“藍(lán)色感慨號”然后將鼠標(biāo)移動到您但愿舉行相比較的泳道上（比如下圖的第3泳道），左鍵點(diǎn)擊，QuantityOne就會立刻探出一張玄色配景的“CompareLanes”對話框。在這個對話框中紅色的曲線代表您選擇的

25、泳道的光疏密程度漫衍曲線。曲線的波峰部門表示位于泳道上的不同電泳條帶；波峰的凹凸象征電泳條帶光疏密程度值的大??；波峰的寬窄象征電泳條帶的寬度；波峰由左至右表示各個電泳條帶順著泳道由后向前的漫衍。大家請注重這個紅色曲線。它不僅只提供給我們關(guān)于泳道上光疏密程度的漫衍環(huán)境，更重要的是鄙人一步我們對電泳條帶舉行定量的時辰，我們將以每個波峰的曲線下平面或物體表面的大作為定量的標(biāo)準(zhǔn).我們還可以用鼠標(biāo)點(diǎn)擊其它我們感興趣的泳道（比如下圖中第六、9、14泳道），這時候再轉(zhuǎn)到“CompareLanes”對話框我們會發(fā)明QuantityOne已經(jīng)幫我們用不同顏色在同一張圖片上繪制出了這4條泳道的相比較圖。是不久短常

26、PP8 -QuantityOne的電泳條帶分析功能-創(chuàng)建條帶前面我們已經(jīng)識別和分析了電泳圖片的泳道，下面我們起頭研究電泳條帶的問題。首先在這搭明確兩個名詞翻譯：“Lane”指電泳泳道；“Band'指電泳條帶。鄙人類社會文化中一例施用這兩個英文名詞來表示這兩個意思。電泳條帶的識別：和前面研究Lane同樣，首先我們要對Lane上的Band舉行識別。識別方式同樣分為AUTOR別和人工識別。AUTOR別的時辰選擇“Band-DetectBands.”號令。這時候QuantityOne會AUTO單出一個"DetectBands”的對話框（如下圖）。首屆用QuantityOne的朋友可能

27、會發(fā)明您的Bands識別以后僅只是畫出了一條紅色的粗線，而在上邊的演習(xí)圖片中倒是上下括號的形式。其實(shí)大家可以在“Band-BandAttributes”選項(xiàng)中設(shè)置Bands的預(yù)示形式。鄙人方的“Style”選項(xiàng)卡入選擇“Brackets”就會將原來的粗線改為括號形式了.在上邊的對話框中，我們可以指定識別的參量。如果要AUTOR別所有Lanes上的Bands就鉤選Lands后面的“All”選項(xiàng)；如果僅只想AUTOR別某一條Lane上的Bands就鉤選“OnS,然后在后面的輸入框中填上您想識別的泳道號碼；如果僅只想識別泳道上部門光疏密程度值最強(qiáng)的Bands,可以在“Bands”后面的選項(xiàng)入選擇“L

28、imit”，然后填上響應(yīng)的數(shù)目（比如10）。QuantityOne就會僅識別該泳道上光疏密程度最大的10條Bands；如果您發(fā)明AUT5別的Bands寬度太窄，圈定Band的紅色括號內(nèi)范圍小于玄色的光疏密程度影。此時可以施用“LaneWidth”號令來調(diào)整Bands識別的寬度。用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“LaneWidth”后面的向上箭頭就會發(fā)明紅色括號逐漸變寬，最后要求其范圍略為寬過其包繞的Band影跡；如果您發(fā)明AUTOR別功能沒有識別您想要的Band或誤識別了您不想要的Band,您還可以施用上邊的工具欄舉行調(diào)整。將您的鼠標(biāo)指向每個圖標(biāo)，QuantityOne就會懂得彈出一個*的提示信息告訴您這個按鍵的功

29、能。在此再也不繼續(xù)闡述了。9 -QuantityOne的電泳條帶分析功能-高斯建模與結(jié)果分析此刻我們已經(jīng)完成為了泳道識別、配景去除、條帶識別的任務(wù)。接下來我們要對Bands舉行一些處理，然后就能夠舉行最終的結(jié)果分析了。高斯建模：大家學(xué)過計(jì)數(shù)學(xué)知識后都懂得高斯（Gauss）漫衍是個啥子意思，在此我就未幾作解釋了。QuantityOne認(rèn)為一個理想狀態(tài)的Band內(nèi)部的光疏密程度漫衍應(yīng)該也服從高斯曲線的特性，正如前面向大家展示的3DViewer中的圖片那樣。在我們同樣平常的電泳泳道中時常出現(xiàn)幾個相隔很近的Bands（即份子量很接近的幾個卵白或核酸）在泳道的某個區(qū)域成串出現(xiàn)。此時我們很難經(jīng)由過程會自等

30、高線的措施精確的描繪出每條Band自力的輪廓。這個時辰我們就需要對這些擁擠在一路的Bands舉行高斯建模處理。QuantityOne能夠依據(jù)高斯曲線的特性，配合有用的配景去除，將各條緊靠在一路、界限彼此融合的Bands描繪成具有自力光疏密程度漫衍的彼此疊合的曲線。如下圖所示，原來彼此融合的22、23兩條Bands經(jīng)過高斯建模然后變成為了兩個具有自力漫衍曲線，彼此疊合的Bands。高斯建模必需建立在有用的泳道配景去除然后。配景去除的方法可以參見我們前面的方法，即經(jīng)由過程“Lane-LaneBackgrouds”的方式舉行去除配景。去除配景的時辰最佳選擇RollingDiskSize小一些的方案。

31、這樣配景去除后的光疏密程度漫衍曲線和高斯建模后的光疏密程度漫衍曲線才氣比較好的吻合。另外高斯建模其實(shí)不是一個必需的步調(diào)。它僅只在出現(xiàn)多條Bands緊密擺列在一路，以至于無法分辯它們之間的間隔的時辰才最有用。如果Bands在泳道上松散的漫衍則可以不施用高斯建模.那末怎樣舉行高斯建模呢很簡單！只要執(zhí)行“Band-GaussModelBands."號令就能夠，執(zhí)行后QuantityOne回彈出一個對話框問您要對那條泳道舉行高斯建模。請鉤選“OnS,然后再輸入需要建模的泳道代碼就能夠了（比如下圖中的第2泳道）；如果選擇了“All”則對所有泳道舉行高斯建模，固然建模這么多泳道會費(fèi)一點(diǎn)兒時間了。

32、察看結(jié)果：執(zhí)行完高斯建模以后施用“Band-BandInformation”號令來察看結(jié)果。方法是將變成藍(lán)色驚嘆號的鼠標(biāo)移到剛才已經(jīng)識別的Band的部位，一個詳細(xì)的“BandInformation”信息框就會立刻彈出來（見下圖）。在這幅圖中我們必需注重的是“Trace”和/或“GaussModelTrace”，因?yàn)槲覀儎偛判量嗔税胩炀褪菫榱说玫竭@個數(shù)據(jù)。這個數(shù)據(jù)表示的就是Band光疏密程度漫衍曲線下平面或物體表面的大，也就是QuantityOne用來表達(dá)Band內(nèi)份子總量的方式。在這個信息框中還有一些重要信息比如“MolWt”（份子量）；“Quantity/Units”等此刻照舊空缺，咱們下以

33、后的分析步調(diào)中將逐漸填滿它們。QuantityOne有一點(diǎn)兒讓人感到很半大白。它的“Trace”和“GaussModelTrace”都是表示曲線下平面或物體表面的大的，可是施用的單元是OD*mm而在另外的等高線定量方法中，同樣是表示某個區(qū)域平面或物體表面的大的單元倒是OD*mm2.下面讓我們回過甚來看看高斯建模然后電泳圖片的分析結(jié)果到盡頭發(fā)生了啥子變化。首先是一張沒有舉行高斯建模的圖片，大家可以看到在這張圖片中的白框部門，第2泳道白第6個band的光疏密程度曲線*部門其實(shí)不呈高斯對稱（少了一部門不是）。這是因?yàn)樗徊块T和鄰近的Band彼此融合在一路了。此刻再來相比較一下經(jīng)過高斯建模后的電泳圖片

34、分析結(jié)果。照舊在不異位置，這時候代表第2泳道第6個Band的*光疏密程度曲線是否呈完備的高斯對稱了而且后面的“GaussModelTrace”也再也不是“”，而變成為了“OD',相比較上邊的“Trace”=OD,大家想想為啥子要大一些呢!10-QuantityOne的電泳條帶分析功能-份子量預(yù)先推測前面我們和大家學(xué)習(xí)了用QuantityOne舉行電泳條帶定量的基本方法。此刻我們暫時轉(zhuǎn)移眼看東西假想線來探討一下另外一個功能，份子量預(yù)先推測。這個功能對卵白質(zhì)而言是份子量預(yù)先推測，對核酸而言就是核酸大小的預(yù)先推測了。下面我們照舊以卵白質(zhì)為例來學(xué)習(xí)份子量預(yù)先推測：首先大家必需懂得的是份子量的預(yù)

35、先推測是建立在泳道和條帶都已經(jīng)創(chuàng)建好的根蒂根基上。我們只是人為的為一些泳道上的條帶加上一個已知的標(biāo)準(zhǔn)，然后經(jīng)由過程不同泳道和條帶之間的相比較繪制回歸曲線，經(jīng)由過程回歸曲線的走歷來預(yù)先推測特別指定條帶上的份子的份子量。固然如果我們能夠在一次電泳中多跑幾條不同份子量身分的marker,肯定是能夠提高我們預(yù)先推測的準(zhǔn)確性。下面我們談?wù)勗鯓硬僮?。在已?jīng)創(chuàng)建好泳道和條帶的圖片上，執(zhí)行“Match-Standard”號令，在彈出的“SelectStandards”選項(xiàng)卡入選擇一個合適的marker。如果您本身已經(jīng)跑了Marker,那末請選擇“NewStandard”創(chuàng)建您本身的marker,然后在彈出的“

36、Standard”菜譜中輸入您的Marker的份子量。如下圖在“Standard”中輸入一個名稱，然后鄙人面的表格中輸入各個Marker的份子量和名稱。輸入完成以后用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“Type”下面的小箭頭（上圖鼠標(biāo)指向的位置），然后把變成綠顏色加號的鼠標(biāo)移動到您的Marker泳道上響應(yīng)的band。例如上圖中200KD就移動到第15泳道的200KD的位置，以此類推，將每個Marker都標(biāo)志上響應(yīng)的數(shù)字。標(biāo)志完成后，Maker泳道上的Bands就會變成藍(lán)色。如果您有多條Marker泳道，您可以再多表記幾條以提高軟件預(yù)先推測的準(zhǔn)確性。此刻我們執(zhí)行“Match-StandardCurve”，然后用鼠標(biāo)隨便點(diǎn)

37、擊我們想要了解的泳道，QuantityOne立刻就會為我們預(yù)示出一條曲線，當(dāng)中還有一個小的對話框“OptionsforProteins”，在這個對話框中“RegressionModel”選擇“PointtoPointSemi-log”或“Elder-Southern”這兩種回歸方式；然后鉤選當(dāng)中的“ShowNumericaldataofPoints"，這時候再看那條曲線上是否已經(jīng)標(biāo)注了很多數(shù)字這些數(shù)字就是水平方向上對應(yīng)的Bands的份子量了。11-QuantityOne的電泳條帶分析功能-創(chuàng)建定量標(biāo)準(zhǔn)上邊說明說過，在BandInformation中除了“trace”和“gaussmo

38、deltrace”之外我們還有幾個項(xiàng)目沒有填入數(shù)據(jù)。這些其時未填入的數(shù)據(jù)其實(shí)是""和“Quantity/Unit”這2項(xiàng)。剛才我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了怎樣預(yù)先推測份子量，大家此刻再用“Band-BandInformation”號令看看您感興趣的Band,是否已經(jīng)被填上數(shù)字了此刻只剩下“Quantity/Unit"，讓我們起頭學(xué)習(xí)怎樣測定具體的定量值（原來測定的僅只是光疏密程度值和Band之間的事物的量的比，而沒有落實(shí)到具體的實(shí)際數(shù)字）o創(chuàng)建定量標(biāo)準(zhǔn)：所謂創(chuàng)建“定量標(biāo)準(zhǔn)”其實(shí)近似于剛才我們設(shè)置的份子量Markero只不外這搭我們用已知Band的事物的量做為Marker,就像用

39、5ul的DL2000跑電泳，每條Band含50ng的雙鏈DNA具體操作如下：執(zhí)行“Analysis-QuantityStandards”，在彈出的“CalibrationCurve”對話框入選擇“CreatNew”，在隨后的“QuantityStandards”對話框中填寫一系列相干信息。重要的信息包孕：1. “Units"：指作為marker的事物的量的單元，例如ng,ug,mg等等2. “Measure"：指對Maker和待測Band的丈量方式。點(diǎn)擊“Measure”按鍵后可以選擇“TraceDensity"、“ContourDensity"、“Pe

40、akDensity”和“AverageDensity"。如果您前面的分析接納的是軌跡法定量的話可以選擇“TraceDensity"；如果您接納的是等高線法定量可以接納“ContourDensity”。3. “Select”：在“Select”后面有三個選項(xiàng)，BandMatch、Lane。選中此中一個選項(xiàng)比如band”，然后將變成向上小箭頭的鼠標(biāo)指向您本身跑的Marker條帶，點(diǎn)擊左鍵，就會發(fā)明此時該Band已經(jīng)變成*。您可以多點(diǎn)選幾個作為Marker的BandS至少3個，越多越好），然后回到“QuantityStandards”框。這時候框下部的表格變成可填寫狀態(tài)，在“Quantityug”中填入響應(yīng)的數(shù)字，每個數(shù)字對應(yīng)您剛才標(biāo)志的作marker的Bandso后面的“Dilutionfactor”項(xiàng)可暫時不管；其它兩項(xiàng)“La