革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓課件

1、革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓革蘭氏染色及鏡檢革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓操作規(guī)范培訓質(zhì)量管理部質(zhì)量管理部革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓目錄目錄一、革蘭氏染色法一、革蘭氏染色法二、革蘭氏染色原理二、革蘭氏染色原理三、儀器設(shè)備、試劑三、儀器設(shè)備、試劑四、操作方法四、操作方法五、鏡檢及結(jié)果判定五、鏡檢及結(jié)果判定六、革蘭氏染色圖片六、革蘭氏染色圖片七、革蘭氏染色注意事項七、革蘭氏染色注意事項八、革蘭氏染色小結(jié)八、革蘭氏染色小結(jié)革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓一、革蘭氏染色法一、革蘭氏染色法 革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師年

2、由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。創(chuàng)立。 革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，革蘭氏陽性菌（后，用酒精脫色，革蘭氏陽性菌（G+）不）不被脫去，革蘭氏陰性菌（被脫去，革蘭氏陰性菌（G-）可被脫去。）可被脫去。為為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌蕃紅等進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。則被染上紅色。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應

3、；的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)陰性反應。都呈現(xiàn)陰性反應。 革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓G+和G-生物學特性的差異 比較項目比較項目 G+細菌細菌 G-細菌細菌 革蘭氏染色反應革蘭氏染色反應 能阻留結(jié)晶紫而染成紫色能阻留結(jié)晶紫而染成紫色 可經(jīng)脫色而復染成紅色可經(jīng)脫色而復染成紅色 肽聚糖肽聚糖 厚，層次多厚，層次多 薄，一般單層薄，一般單層 磷壁酸磷壁酸 多數(shù)含有多數(shù)含有 無無 外膜外膜 無無 有有 脂多糖（脂多糖（LPS） 無無 有有 類脂和脂蛋白含量類脂和脂蛋白含量 低（僅抗酸性細菌含有類低（僅抗酸性細菌含

4、有類脂）脂） 高高 鞭毛結(jié)構(gòu)鞭毛結(jié)構(gòu) 基體上著生基體上著生2個環(huán)個環(huán) 基體上著生基體上著生4個環(huán)個環(huán) 產(chǎn)毒素產(chǎn)毒素 以外毒素為主以外毒素為主 以內(nèi)毒素為主以內(nèi)毒素為主 對機械力的抗性對機械力的抗性 強強 弱弱 革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓陰性菌陰性菌陽性菌陽性菌革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓二、革蘭氏染色原理二、革蘭氏染色原理G+菌由于其細胞壁較厚，肽聚糖網(wǎng)層次多且交聯(lián)程度菌由于其細胞壁較厚，肽聚糖網(wǎng)層次多且交聯(lián)程度大，故經(jīng)酒精脫色，失水而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不大，故經(jīng)酒精脫色，失水而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故酒精處理，能把結(jié)晶紫和碘的復合物牢牢含類脂，故酒精處理，能把結(jié)晶紫和碘的復合物牢

5、牢留在壁內(nèi)，使其保持紫色。留在壁內(nèi)，使其保持紫色。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓G-菌因其細胞壁薄，外膜層類脂含量高，肽聚糖層薄菌因其細胞壁薄，外膜層類脂含量高，肽聚糖層薄且交聯(lián)程度低（松疏），經(jīng)酒精脫色后，以類脂為主且交聯(lián)程度低（松疏），經(jīng)酒精脫色后，以類脂為主的外膜迅速溶解，這時薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋的外膜迅速溶解，這時薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘的復合物的溶出，因此細胞退成無色，再結(jié)晶紫與碘的復合物的溶出，因此細胞退成無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復染，就使經(jīng)沙黃等紅色染料復染，就使G-菌呈紅色。菌呈紅色。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓三、儀器設(shè)備、試劑三、儀器設(shè)備、試劑生物顯微鏡生物

6、顯微鏡載玻片載玻片草酸銨結(jié)晶紫染色液草酸銨結(jié)晶紫染色液革蘭氏碘液革蘭氏碘液沙黃復染液或番紅染色液沙黃復染液或番紅染色液95%乙醇乙醇革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓5、革蘭氏染色液配制、革蘭氏染色液配制5.1草酸銨結(jié)晶紫染液草酸銨結(jié)晶紫染液 A液：結(jié)晶紫液：結(jié)晶紫2g ，95%乙醇乙醇20mL。B液：草酸銨液：草酸銨0.8g， 蒸餾水蒸餾水80mL 混合混合A液及液及B液，靜置液，靜置48h后使用。后使用。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓5.2碘液配制碘液配制 碘片碘片1g， 碘化鉀碘化鉀2g ，蒸餾水，蒸餾水300mL 配制方法：先將碘化鉀溶解在少量水中，配制方法：先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片

7、溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加夠蒸餾水即可。后，加夠蒸餾水即可。 革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓5.3番紅復染液配制番紅復染液配制番紅番紅2.5g， 95%乙醇乙醇100mL 取上述配好的番紅乙醇溶液取上述配好的番紅乙醇溶液10mL與與80mL蒸餾水混勻既成。蒸餾水混勻既成。 革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓四、操作方法四、操作方法1、制片、制片 在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水。在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水。用接種環(huán)進行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載用接種環(huán)進行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約玻片的水滴中，與水混合做成

8、懸液并涂成直徑約1厘米的薄層。厘米的薄層。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓為避免因菌數(shù)過多聚成團，不利觀察個體形態(tài)，為避免因菌數(shù)過多聚成團，不利觀察個體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層。中再取一環(huán)于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層。若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物沖洗下制備的若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物沖洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可菌液，則直接涂布于載玻片上即可 革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓2、自然干燥、自然干燥 涂片最好在室溫下使其自然干燥。涂片最好在室溫下使其自然干燥。有時為了使之干得更快

9、些，可將標本面向上，手持有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。以防標本烤枯而變形。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓3、固定、固定標本干燥后即進行固定，固定的目的：標本干燥后即進行固定，固定的目的：）殺死微生物，固定細胞結(jié)構(gòu)。）殺死微生物，固定細胞結(jié)構(gòu)。）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標本）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標本被水沖洗掉。被水沖洗掉。）改變?nèi)玖蠈毎耐ㄍ感?，因為死的原?/p>

10、質(zhì)比）改變?nèi)玖蠈毎耐ㄍ感?，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色?；畹脑|(zhì)易于染色。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓手執(zhí)載玻片的一端（涂有標本的遠端），標本向上。手執(zhí)載玻片的一端（涂有標本的遠端），標本向上。在酒精燈外焰盡快的來回通過在酒精燈外焰盡快的來回通過34次，共約次，共約23秒秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過為宜（不超過60）, 放置待冷后，進行染色。放置待冷后，進行染色。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓4、初染、初染 滴草酸銨結(jié)晶紫染滴草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘分鐘蒸餾水沖洗。蒸餾水沖洗。 革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓5、媒染

11、、媒染 加革蘭氏碘液染加革蘭氏碘液染1分鐘分鐘蒸餾水沖洗，用吸水紙吸去水分。蒸餾水沖洗，用吸水紙吸去水分。 革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓6、脫色、脫色 加加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后立即用蒸餾水沖洗。秒后立即用蒸餾水沖洗。用吸水紙吸去水分。用吸水紙吸去水分。 革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓7、復染、復染 蕃紅染色液（稀）（或沙黃）復染液染蕃紅染色液（?。ɑ蛏滁S）復染液染1分分鐘后，用蒸餾水沖洗，并自然干燥。鐘后，用蒸餾水沖洗，并自然干燥。 鏡檢。鏡檢。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓五、鏡檢及結(jié)果判定五、鏡檢及結(jié)果判定 接通顯微鏡的電源，調(diào)節(jié)光線的強

12、度。接通顯微鏡的電源，調(diào)節(jié)光線的強度。將載玻片放在載物臺上，調(diào)節(jié)鏡頭至油鏡鏡頭處，將載玻片放在載物臺上，調(diào)節(jié)鏡頭至油鏡鏡頭處，調(diào)節(jié)粗準焦螺旋和細準焦螺旋至清晰為止。調(diào)節(jié)粗準焦螺旋和細準焦螺旋至清晰為止。觀察菌落形態(tài)及菌體的顏色。觀察菌落形態(tài)及菌體的顏色。革蘭氏陽性菌染色呈紫色，革蘭氏陰性菌染色呈革蘭氏陽性菌染色呈紫色，革蘭氏陰性菌染色呈紅色。紅色。 革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓六、六、革蘭氏染色圖片革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓革蘭氏染色的大腸桿菌革蘭氏染色的大腸桿菌革蘭氏染色的金黃色革蘭氏染色的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌葡萄球菌和大腸桿菌革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓革蘭染色的傷寒沙門菌革蘭染色的

13、傷寒沙門菌革蘭染色的福氏志賀菌革蘭染色的福氏志賀菌革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓七、七、革蘭氏染色注意事項標本涂片不能太厚，若涂片較厚，應延長脫標本涂片不能太厚，若涂片較厚，應延長脫色時間，直至不在出現(xiàn)紫色為止。色時間，直至不在出現(xiàn)紫色為止。染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上的殘水。應吸去玻片上的殘水。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓選用培養(yǎng)物時，選用培養(yǎng)物時，G+菌培養(yǎng)菌培養(yǎng)12h-16h， G-培培養(yǎng)養(yǎng)24h。菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常。菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應。使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應。革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時間。如脫色革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時間。如脫色過度，革