石墨烯及氧化石墨烯在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用

1、word石墨烯及氧化石墨烯在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用X愛(ài)紅1,X姣23,林虹君2,3*1中國(guó)人民解放軍防化學(xué)院，102205;唯白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，102206;3軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，100850摘要：近年來(lái)，隨著石墨烯的問(wèn)世，石墨烯及其氧化物氧化石墨烯在生命科學(xué)領(lǐng)域，尤其是蛋白質(zhì)檢測(cè)研究中的應(yīng)用日趨增多。石墨烯以其大的比表面積、優(yōu)異的生化性能使其發(fā)揮了傳統(tǒng)材料不可替代的作用。本文綜述了石墨烯及氧化石墨烯在電免疫檢測(cè)、生物質(zhì)譜分析以及westernblotting分析中的應(yīng)用，并對(duì)其應(yīng)用前景做一展望。關(guān)鍵詞：石墨烯，氧化石墨烯，蛋白質(zhì)檢測(cè)Theapplicati

2、onofgrapheneandgrapheneoxideinthedetectionofproteinZHANGAi-Hong1,ZHANGJiao2。LINHong-Jun2,3InstituteofChemicalDefense,Beijing102205,China2StateKeyLaboratoryofProteomics,BeijingProteomeResearchCenter,Beijing102206,China;3BeijingInstituteofRadiationMedicine,Beijing100850,ChinaAbstract:Inrecentyears,wit

3、htheadventofgraphene,theapplicationofgrapheneandgrapheneoxideinthefieldoflifesciences,particularlyinthestudyofproteindetectionisincreasing.Graphene,withitslargespecificsurfacearea,excellentbiochemicalproperties,hasplayedanirreplaceableroleoftraditionalmaterials.Thispaperreviewstheapplicationofgraphe

4、neandgraphene3 / 71 GO的制備oxideinelectricityimmunitydetection,biologicalpresentsitsapplicationprospect.Keywords:graphene,grapheneoxide,detectionofprotein石墨烯(graphene)是單原子厚度的二維碳原子晶體，被認(rèn)為是富勒烯、碳納米管和石墨的基本結(jié)構(gòu)單元。早在60年前人們就在理論上對(duì)石墨烯進(jìn)行了研究，然而，直到本世紀(jì)初才獲得獨(dú)立的單層石墨。石墨烯因具有大的比表面積、優(yōu)異的生物化學(xué)性能等一系列獨(dú)特性質(zhì)，引起了廣大科研人員的極大興趣1,2。然而，由于

5、石墨烯表面功能基團(tuán)較少，不易與生物分子結(jié)合，因此，首先將石墨烯氧化生成氧化石墨烯(grapheneoxide,GO),在其表面產(chǎn)生較多的竣基等功能基團(tuán)，大大提高了其應(yīng)用X圍3,4八massspectrometryandwesternblottinganalysis,andGO是高結(jié)晶度的石墨經(jīng)強(qiáng)力氧化、水解得到的產(chǎn)物。GO的合成方法主要有Brodie法、Staudenmaie袪和Hummers法5。這三大化學(xué)氧化方法都是用強(qiáng)質(zhì)子酸處理石墨，形成石墨層間化合物，然后加入強(qiáng)氧化劑對(duì)其進(jìn)行氧化。隨著研究的發(fā)展，又出現(xiàn)了電化學(xué)氧化法6,以及對(duì)以上三種化學(xué)氧化法的改進(jìn)，從而縮短了氧化時(shí)間，提高了制備效率

6、7-10。圖1為氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)模型圖。圖1GO的結(jié)構(gòu)模型22石墨烯在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用2.1 石墨烯在質(zhì)譜檢測(cè)方法中的應(yīng)用石墨烯與抗體結(jié)合，擴(kuò)大單位檢測(cè)體系中可檢測(cè)到的信號(hào)密度，可對(duì)痕量、甚至超痕量生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。在2010年Dong研究組11首次將石墨烯應(yīng)用于基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOFMS),具體操作如下：首先將石墨烯溶為基質(zhì)，然后將待測(cè)小分子溶在石墨烯基質(zhì)中，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。由于石墨烯對(duì)非極性分子的解析和離子化效率

7、更好，因此可以提高被檢測(cè)物在檢測(cè)器中的響應(yīng)信號(hào)。圖2是MALDI-TOFMS對(duì)小分子的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比圖。從圖中我們可以看出，用石墨烯作為基質(zhì)時(shí)，可以大幅提高目標(biāo)信號(hào)的響應(yīng)度，而對(duì)干擾信號(hào)進(jìn)行了規(guī)避。同時(shí)，即使目標(biāo)檢測(cè)物的濃度低至0.2因時(shí),仍能檢測(cè)到明顯的信號(hào)。圖2MALDI-TOFMS檢測(cè)對(duì)比圖(a)膽固醇(m/z369,M-H2O+H+)和鯊烯(m/z433,M+Na+)并用CHCA做基質(zhì)；(b)膽固醇(m/z409,M+Na+)和鯊烯(m/z433,M+Na+)并用石墨烯為基質(zhì)；(c)石墨烯對(duì)鯊烯的吸附量為20M;(d)石墨烯對(duì)鯊烯的吸附量為0.2M2.2 石墨烯與氧化錯(cuò)結(jié)合對(duì)含磷基團(tuán)試劑

8、進(jìn)行檢測(cè)2011年Du研究組12又提出，將ZrO2與石墨烯結(jié)合形成graphene-ZrO2納米復(fù)合材料(GZr),并將GZr作為電極，用于對(duì)含磷酸基團(tuán)試劑的檢測(cè)(圖3)。本方法對(duì)甲基對(duì)磷酸的檢測(cè)線(xiàn)性X圍是0.5100ngmL-1,檢測(cè)PM是0.1ngmL-1。因此，該方法可用于對(duì)有機(jī)磷試劑的監(jiān)測(cè)和檢測(cè)。圖3GZr納米電極及其對(duì)甲基對(duì)磷酸的檢測(cè)示意圖12該方法用于對(duì)含磷酸基團(tuán)試劑的檢測(cè)的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1.GZr對(duì)磷酸基有強(qiáng)有力的結(jié)合力；2.GZr作為電極擁有快速的電子轉(zhuǎn)移性能和優(yōu)異的電催化性能；3.通過(guò)電學(xué)方法可以控制待測(cè)物在GZr上的吸附量等。我們相信該方法能在磷酸肽及蛋白質(zhì)的檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作

9、用。2.3 石墨烯用于電免疫傳感器對(duì)生物分子進(jìn)行檢測(cè)將石墨烯應(yīng)用于電免疫傳感器在生物檢測(cè)領(lǐng)域得到了較多的研究13-16。2010年Wang等13發(fā)展了一種利用石墨烯和納米金對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)標(biāo)記物的固定新方法(圖4)。在本策略中，石墨烯首先被固定在玻碳電極上(glassycarbonelectrode,GCE),然后將L半胱氨酸(L-cysteine,L-cys)電沉積在石墨烯上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石墨烯可以誘導(dǎo)L-cys在其表面有規(guī)律的生長(zhǎng)，并進(jìn)一步提高納米金顆粒的穩(wěn)定性，最終使得該電極負(fù)載更多的生物分子。該方法可以提高免疫傳感器的靈敏度和穩(wěn)定

10、性。本傳感器對(duì)人IgG的檢測(cè)X圍是0.2320ngmL-1,檢測(cè)限是70ngmL-1,而且該結(jié)果與傳統(tǒng)ELISA方法有較好的吻合。圖4 一抗的固定及免疫檢測(cè)過(guò)程示意圖133.1GO與電免疫化學(xué)結(jié)合對(duì)生物分子進(jìn)行檢測(cè)GO由于具有大的比表面積，可作為載體提高對(duì)生物分子的負(fù)載量，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的目的。早在2010年Du等將GO與HRP結(jié)合，形成多酶擴(kuò)增（即一個(gè)二抗對(duì)應(yīng)多個(gè)HRP）,實(shí)現(xiàn)了對(duì)p53蛋白質(zhì)的超靈敏檢測(cè)（圖6）。用GO改進(jìn)后的方法對(duì)磷酸化彳飾的p53蛋白質(zhì)的檢測(cè)限達(dá)到了0.01nM,比不用GO時(shí)低了10倍，該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，而且對(duì)人血漿中的的檢測(cè)回收率達(dá)到92103.8%

11、。將石墨烯用于電免疫傳感器的還有Su等14,該研究組提出一種新的電化學(xué)免疫傳感器并對(duì)人血清中的AlphaFetoprotein（AFP）進(jìn)行靈敏檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)便，一步即可完成免疫傳感器的自組裝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)AFP的檢測(cè)動(dòng)態(tài)X圍是1.010ngmL-1,檢測(cè)PM是0.7ngmL-1。更重要的是該方法提供了一個(gè)對(duì)生物混合物檢測(cè)的平臺(tái)，并為其它電化學(xué)、生物化學(xué)傳感器的提出及應(yīng)用提供了參考。Wang等17利用氧化石墨烯處理過(guò)的電極，成功對(duì)小分子進(jìn)行低濃度檢測(cè)，體現(xiàn)了石墨烯優(yōu)異的電學(xué)性能以及其在電化學(xué)中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。Liao等18也在此領(lǐng)域做了相關(guān)研究。圖5電化學(xué)免疫傳感器的制備和檢測(cè)過(guò)程示

12、意圖143GO在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用GO由于具有較多的活化基團(tuán)，易與生物分子結(jié)合，然后與蛋白質(zhì)檢測(cè)方法連用，可大大提高檢測(cè)信號(hào)，減低現(xiàn)有方法的檢測(cè)限（limitofdetection,LOD）,擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。圖6HRP-p53392Ab2-GO的制備過(guò)程6在同一年，該研究組又提出將石墨烯和碳納米球用于免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)雙重信號(hào)放大8。該方法將功能化的石墨烯片用于傳感器平臺(tái)，增加其與初級(jí)抗體（Ab1）的結(jié)合能力，實(shí)現(xiàn)了對(duì)信號(hào)的放大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改進(jìn)后的方法對(duì)癌癥標(biāo)志物AFP檢測(cè)信號(hào)提高了7倍，檢測(cè)限可達(dá)0.02ngmL-1,線(xiàn)性校正X圍是0.056ngmL-1。因此，該方法為臨床篩查癌癥生物標(biāo)志

13、物提供了新的選擇。此外，Chen等19對(duì)石墨烯的制備、功能化修飾以及其在電化學(xué)方面的應(yīng)用等做了很好的綜述。3.2GO與磁性Fe3O4結(jié)合He等20利用兩步法完成了GO和表面修飾過(guò)的Fe3O4的結(jié)合。具體步驟是：首先，用四乙基正硅酸鹽和（3-氨丙基）三乙氧基硅烷在Fe3O4表面引入氨基，然后，F(xiàn)e3O4上的氨基與GO上的竣基反應(yīng)，生成GO-Fe3O4結(jié)合物，該結(jié)合物對(duì)亞甲基藍(lán)和中性紅的陽(yáng)離子染料的吸附量分別為190.14mgg-1和140.79mgg-1,而且GO-Fe3O4可以用NaBH4還原彳#到graphene-FesO4。GO-Fe3O4的制備過(guò)程見(jiàn)Miii.rix*-' ; I

14、I - I02悠號(hào)圖7。OUMI*'|產(chǎn)1靖皿總】3"一匐TUS吁*F皿圖7GO-Fe3O4的制備過(guò)程示意圖205 / 7除兩步法外，Shen等21提出在高溫下利用一步 法將三乙酰丙酮鐵磁性納米材料附著在氧化石墨 烯上，得到GO-Fe3O4復(fù)合物（圖8）。將磁性顆粒與GO結(jié)合是對(duì)后續(xù)蛋白質(zhì)分析的第一步，在完成此步驟的基礎(chǔ)上，按照前面的方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)研究，有利于對(duì)蛋白質(zhì)的分離和富集研究，大大縮短了時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作步驟。在制備GO-Fe3O4復(fù)合物的基礎(chǔ)上，Yang等22研究又對(duì)解離性質(zhì)進(jìn)行了探討。在酸性條件下該復(fù)合物積聚，而且在外加磁場(chǎng)下有規(guī)律的移動(dòng)。而在堿性條件下該凝聚

15、體能重新分散形成穩(wěn)定的懸浮液。圖8GO-Fe3O4的一步合成法示意圖21圖9將Fe3O4和鹽酸阿霉素（DXR）結(jié)合在GO上的流程示意圖22實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GO-Fe3O4復(fù)合物對(duì)抗癌藥鹽酸阿霉素的負(fù)載量為1.08mgmg-1,可通過(guò)調(diào)節(jié)酸堿度來(lái)使得GO-Fe3O4的聚集和分散，得到輸送目標(biāo)藥的目的，我們相信該方法在生物醫(yī)學(xué)、生物材料學(xué)和生物診斷學(xué)上將有廣闊的應(yīng)用前景。3.3 GO用于Westernblotting優(yōu)化并對(duì)生物分子進(jìn)行檢測(cè)合，由于一個(gè)納米金粒子能結(jié)合多個(gè)一抗，所以提高了一抗與抗原的比例，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的一次放大。其次將二抗與氧化石墨烯結(jié)合，由于石墨烯大的比表面積，在單位氧化石墨烯片上結(jié)

16、合多個(gè)二抗，擴(kuò)大了二抗與一抗的比例，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的第二次放大。通過(guò)信號(hào)逐級(jí)放大，能將westernblotting的檢測(cè)靈敏度提高32倍，擴(kuò)大了該方法的適用領(lǐng)域（圖10）。Lin等10將GO應(yīng)用于westernblotting，對(duì)二抗進(jìn)行高密度結(jié)合，擴(kuò)大了二抗與一抗的結(jié)合比例，進(jìn)而放大了檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)低濃度待測(cè)物的靈敏檢測(cè)。具體操作步驟如下：首先將納米金與一抗結(jié)谷。H時(shí)5晨售谷 惘41支4 谷航付肢7-小林聲一If 春優(yōu)H"依T-的播閾新勵(lì)化蛹Y 二批圖10氧化石墨烯用于Western blotting信號(hào)放大示意圖10word和藥物傳遞方面都有很好的應(yīng)用。然而，探測(cè)石墨烯在分子內(nèi)

17、的監(jiān)控和原位分子探測(cè)仍然剛剛開(kāi)始。在這一方面，Wang等25設(shè)計(jì)了適體竣基熒光/氧化石墨烯納米片復(fù)合物，研究了其在活體細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，獲取該復(fù)合體以及細(xì)胞目標(biāo)監(jiān)控是成功的。氧化石墨烯在活體細(xì)胞內(nèi)很好的傳送、保護(hù)和感知能力表明氧化石墨烯在很多生物領(lǐng)域，比如DNA和蛋白質(zhì)分析、基因和藥物傳導(dǎo)分之內(nèi)示蹤都是一種很好的備選材料。此外Xu等26、Lin等27、Chang28等研究組也在此方面做了一定的研究。3.4 GO與量子點(diǎn)結(jié)合對(duì)生物分子進(jìn)行檢測(cè)Dong等23于2010年提出了一個(gè)新的平臺(tái)，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移將生物分子從量子點(diǎn)有效傳感到氧化石墨烯，分子信標(biāo)(molecularbeacon)

18、和氧化石墨烯之間的強(qiáng)相互作用力導(dǎo)致量子點(diǎn)的熒光猝滅，一旦目標(biāo)分子被識(shí)別，在量子點(diǎn)和氧化石墨烯之間的距離會(huì)擴(kuò)大，同時(shí)被目標(biāo)識(shí)別的分子信標(biāo)和氧化石墨烯之間的作用力會(huì)變得微弱，這就嚴(yán)重的阻礙了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。熒光強(qiáng)度的變化為檢測(cè)目標(biāo)物提供了一種新的方法，而且，該方法工作量小、靈敏度高以及特異性好。若用適配體替代分子信標(biāo)，該方法的適用X圍將得到擴(kuò)展，比如通過(guò)檢測(cè)適配體和蛋白質(zhì)之間的相互作用來(lái)測(cè)試生物分子等。此外，Wang等24對(duì)在此方面做了相關(guān)的研究。激發(fā)、:發(fā)射I：抑制慧慧圖11GO誘導(dǎo)的分子信標(biāo)和量子點(diǎn)熒光猝滅和生物傳感機(jī)制示意圖234石墨烯在細(xì)胞和成像方面的應(yīng)用石墨烯在生物納米科技，包括DNA

19、傳感、蛋白鑒定5石墨烯在摻雜方面的研究石墨烯摻雜是通過(guò)物理或化學(xué)方法將其它元素(比如氮元素)添加到石墨烯的空隙中，以改善其形貌和結(jié)構(gòu)，提高其導(dǎo)電、儲(chǔ)蓄等f(wàn)能。Wang等29通過(guò)化學(xué)方法對(duì)石墨烯進(jìn)行氮處理，通過(guò)控制曝光時(shí)間，所制備的N摻雜石墨烯具有較高的催化活性。氮摻雜石墨還被進(jìn)一步用于葡萄糖生物傳感器，并在有干擾存在的情況下對(duì)濃度低至0.01mM的被檢測(cè)物進(jìn)行有效檢測(cè)。此外，Long等30和Reddy等31研究組也對(duì)N摻雜石墨烯的制備、表征及性能評(píng)價(jià)做了大量的工作，此方面的研究對(duì)我們有很大的借鑒意義。6石墨烯的組裝體在生物分析方面的研究近年來(lái)，氧化石墨烯基復(fù)合材料一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)。氧化石墨

20、烯表面含有大量的含氧官能團(tuán)，如：竣基、羥基等，這些功能團(tuán)使氧化石墨在水中具有很好的分散性，并使得利用層層組裝技術(shù)(layer-by-layerassemblytechnique,LbL)制備有機(jī)物/氧化石墨烯復(fù)合物成為可能。Yuan等32提出一種由氧化石墨烯片和溶菌酶自組裝成抗菌復(fù)合膜的技術(shù)。該復(fù)合膜具有多層的有序結(jié)構(gòu)，在相鄰層之間填充有蛋白質(zhì)分子，通過(guò)控制該復(fù)合物在水中的釋放度來(lái)控制夾層中蛋白質(zhì)的量，從基質(zhì)上剝落的薄層可作為自由且獨(dú)立的抗菌包裹層，有很廣的使用價(jià)值。該技術(shù)為發(fā)展多功能納米復(fù)合材料提供了切實(shí)可行的參考。另外，Kotov等33、Tang等34和Wang等35研究組也在自組裝方面做

21、了大量研究工作，對(duì)于拓展石墨烯的應(yīng)用很有價(jià)值。7結(jié)語(yǔ)石墨烯以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的生化性能及潛在的應(yīng)用，越來(lái)越引起研究人員的廣泛關(guān)注，現(xiàn)已成為材料、化學(xué)、生物等眾多領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。然而，目前的制備技術(shù)存在石墨烯尺寸小且分布不均、難以批量生產(chǎn)以及性能難以精確控制等瓶頸；而且，現(xiàn)有的表征手段耗時(shí)、容易破壞石墨烯的晶格結(jié)構(gòu)，也制約著石墨烯的進(jìn)一步研究。我們相信，通過(guò)業(yè)內(nèi)人士的不斷努力，設(shè)計(jì)和批量制備大尺寸、層數(shù)和性能可控的石墨烯在不久的將來(lái)即可實(shí)現(xiàn)。另外，石墨烯與現(xiàn)有生物技術(shù)結(jié)合，也將在蛋白質(zhì)檢測(cè)及分析研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。參考文獻(xiàn)1馬文石，周俊文，程順喜.石墨烯的制備與表征.高校化學(xué)工程學(xué)報(bào),

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