多環(huán)芳烴降解菌的篩選及其對芘的降解研究-

1、第1期多環(huán)芳烴降解菌的篩選及其對芘的降解研究王蕾,聶麥茜,王志盈,玉亞,徐會寧,張睿(西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,陜西西安710055摘要:以焦化廠排水溝底泥為菌源馴化篩選出6株多環(huán)芳烴降解菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:各菌對芘均有一定的降解能力,不同菌體表面疏水性不同,這種不同可以影響到反應(yīng)初期菌株對芘的表觀降解率,菌體的疏水性表面較親水性表面對芘有更強(qiáng)的吸附性;保存的一組天然混合菌對芘降解率較低,沒有表現(xiàn)出優(yōu)于單個(gè)菌株的協(xié)同作用;多環(huán)芳烴降解菌在芘培養(yǎng)液中生長快慢和降解能力沒有必然聯(lián)系。對兩株菌體表面疏水性相差較大的菌株在不同條件下的芘降解性能研究結(jié)果表明:2#菌降解芘的最佳溫度是30,9#菌

2、降解芘的最佳溫度是40;Mn 2+對2#降解芘有促進(jìn)作用,對9#菌幾乎無影響,Cu 2+對各菌芘降解均有不同程度的抑制作用;外加葡萄糖對于2#菌和9#菌的芘降解有促進(jìn)作用。關(guān)鍵詞:芘;優(yōu)勢菌;降解;疏水性;溫度;無機(jī)離子;外加碳源中圖分類號:X132文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號:1003-6504(201001-0043-05Screening of PAH-degrading Strains and Study on MetabolicProperties of PyreneWANG Lei ,NIE Mai-qian ,WANG Zhi-ying ,YU Ya ,XU Hui-ning ,ZHA

3、NG Rui(School of Environment and Municipal Engineering ,Xi an University of Architecture and Technology ,Xi an710055,China Abstract :Six strains and a group of original mixed strains were isolated and screened from the bottom sludge of coke-plant wastewater.Results indicated that most of the bacteri

4、a had the best pyrene-degrading capabilities.Six strains had the different cell surface hydrophobicity ,and the difference of cell surface properties could affect the pyrene removal rate in early reaction period.Results also showed that pyrene was more likely to be adsorbed onto cell surface with hy

5、drophobicity than onto cell surface with hydrophobicity.The original mixed strains had the relatively low pyrene biodegradation rate ,and showed no synergistic effect among different strains.The strain growth in pyrene cultural medium had no necessary connection with its pyrene biodegradation capabi

6、lity.Two strains with different cell surface properties were chosen to study the individual factors affecting pyrene biodegradation.Results showed that the optimum temperature to pyrene biodegradation was 30for strain 2#and 40for strain 9#.Mn 2+could promote the pyrene degradation velocity of strain

7、 2#while it was almost no effect on strain 9#,Cu 2+had an inhibitory effect on pyrene biodegradation of the two strains.Exotic carbon source test showed that glucose was a beneficial substrate on the degradation of pyrene for both strain 2#and strain 9#.Key words :pyrene ;predominant strains ;biodeg

8、radation ;cell surface hydrophobicity ;temperature ;inorganic ions ;exotic carbon source多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons ,簡稱PAHs 是一大類廣泛存在于環(huán)境中的有機(jī)污染物,也是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的化學(xué)致癌物1。多環(huán)芳烴在環(huán)境中污染面廣而分散,不易集中治理,一些環(huán)境微生物經(jīng)過適應(yīng)性馴化和誘導(dǎo),可以對PAHs 進(jìn)行代謝分解,甚至礦化2-4。已有研究表明,微生物修復(fù)(降解是環(huán)境中多環(huán)芳烴去除的最主要途徑5。多環(huán)芳烴降解菌的篩選一直是國內(nèi)外生物降解的一個(gè)重要方面。迄今已分

9、離到多種降解菌,但多以降解萘、菲等低分子量PAHs 為主。近年來,進(jìn)一步篩選四環(huán)或四環(huán)以上的高分子量PAHs 高效降解菌成為多環(huán)芳烴修復(fù)工作的必然趨勢。而芘作為高分子量PAHs 的典型代表,常被作為監(jiān)測PAHs 污染的指示物和其他PAHs 光化學(xué)降解、生物降解的模型分子6。因此本實(shí)驗(yàn)以焦化廢水排水溝底泥為優(yōu)良菌源,通過馴化分離篩選出多環(huán)芳烴優(yōu)勢降解菌并對其對芘的降解性能進(jìn)行了收稿日期:2008-09-18;修回2008-12-05基金項(xiàng)目:陜西省教育廳自然專項(xiàng)項(xiàng)目(07JK290作者簡介:王蕾(1983-,女,博士研究生,研究方向?yàn)殡y降解有機(jī)物的微生物處理技術(shù),(手機(jī)159*(電子信箱yimi

10、003 。Environmental Science &Technology第33卷第1期2010年1月Jan.2010第33卷 初步研究,以期為實(shí)際微生物修復(fù)多環(huán)芳烴污染環(huán)境奠定基礎(chǔ)。1實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1試驗(yàn)材料菌源:焦化廢水毒性大,含多種多環(huán)芳烴及雜環(huán)芳烴,本研究以陜西富平焦化廠焦化廢水排水溝底泥為優(yōu)良菌源,其外觀為半流體,呈黑褐色。馴化實(shí)驗(yàn)用土壤:西安建筑科技大學(xué)小西門內(nèi)東側(cè)花園土。晾干,粗篩(除去樹枝,碎玻璃等雜物,過1mm ×1mm 篩,備用。1.2主要培養(yǎng)基和試劑5.0g/L 芘丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱量0.2500g 芘標(biāo)準(zhǔn)試劑,用丙酮溶解于50mL 棕色容量瓶中

11、并定容,搖勻使芘濃度為5.0g/L 。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏3g ,蛋白胨10g ,NaCl 5g ,蒸餾水1000mL ,pH7.27.4。121高壓蒸汽滅菌30min 備用。無機(jī)鹽培養(yǎng)基:磷酸鹽緩沖液:K 2HPO 4·H 2O 21.75g ,Na 2HPO 4·12H 2O 33.4g ,KH 2PO 448.7g ,NH 4Cl 5.0g ,蒸餾水1000mL ;MgSO 4溶液:MgSO 422.5g ,蒸餾水1000mL ;FeCl 3溶液:FeCl 30.25g ,蒸餾水1000mL ;微量元素溶液:MnSO 439.9mg ,ZnSO 4·

12、;H 2O 42.8mg ,(NH 4MoO 24·4H 2O 34.7mg ,蒸餾水1000mL 。取上述磷酸鹽緩沖液5.0mL ,MgSO 4溶液3.0mL ,CaCl 2溶液1.0mL ,FeCl 3溶液1.0mL ,微量元素溶液1.0mL ,定溶至1000mL 。經(jīng)高壓蒸汽滅菌,備用。分離純化培養(yǎng)基:在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂,濕熱滅菌后,在無菌操作下加入多環(huán)芳烴碳源混合物,搖勻。然后在滅好菌的培養(yǎng)皿中倒成平板備用或分裝于提前滅菌的帶塞試管中制成斜面?zhèn)溆谩?.3試驗(yàn)方法取來含優(yōu)良菌源的污泥后,用均勻處理器處理20min 使污泥分散均勻,充分曝氣活化24h 。稱取土壤1kg

13、 放入自制土壤反應(yīng)器中,加入蒽菲芘各25mg 、葡萄糖1g 、Mn 2+5mg 后攪勻,再加入活化后的優(yōu)良菌源,加水?dāng)嚢枋雇寥肋_(dá)一定濕度(目測土壤均勻,松散,潮濕,把反應(yīng)器放入學(xué)?；ǚ繙厥?使之通風(fēng)、可接受陽光又免受雨淋,以后每天澆水、攪拌。馴化周期為三個(gè)月。稱取10g 馴化后的新鮮土樣于250mL 三角瓶中,在無菌操作條件下,加入90mL 無菌水,浸泡振搖20min 。上清液用無菌水稀釋,分別取107、108、109三個(gè)倍數(shù)的稀釋液各0.2mL 于盛有分離培養(yǎng)基的平板中央,用玻璃刮刀均勻涂布,37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d ,挑取長勢較好的單一菌落劃線分離,反復(fù)劃線分離,直至獲得純菌株。根據(jù)初步篩

14、選出的優(yōu)良菌對芘的降解情況進(jìn)一步優(yōu)選多環(huán)芳烴降解菌。無菌條件下,從斜面上挑取一環(huán)菌,接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,細(xì)胞表面疏水性采用BATH 測定方法7,具體為取一定量調(diào)整濃度(OD 600=0.5300.540的菌懸液4mL 于圓底具塞玻璃管中,按梯度加入二甲苯,對照組不加二甲苯。室溫下劇烈振蕩60s ,靜置5min 分層。用無菌注射針頭快速吸取下相水溶液3.0mL ,以磷酸鹽緩沖液為對照,在600nm 波長下測定A 值,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。細(xì)菌細(xì)胞表面疏水率(CSH %按下式計(jì)算:優(yōu)良菌對芘的降解過程用MPN 法測定菌體的生長情況,具體為將水樣做倍比稀釋,至適宜的稀釋度為止,應(yīng)使低稀釋度的各

15、管都長菌,而以高稀釋度的各管不長菌為宜。每個(gè)稀釋度重復(fù)接種至少3管。37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d ,檢查結(jié)果確定數(shù)量指標(biāo)8,繪制生長曲線。取下反應(yīng)瓶,把水樣用環(huán)己烷在125mL 梨形分液漏斗中反復(fù)萃取三次,萃取上清液合并于10mL 比色管定容。然后,取0.2mL 在另一比色管中稀釋到10mL ;在波長為242nm 處用紫外分光光度法測其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成濃度?；貧w直線方程為:y =2.2982x -0.009,R 2=0.9996。芘降解率為:芘降解率=(芘初始加入濃度-芘剩余濃度/芘初始加入濃度×100%(244第1期2試驗(yàn)結(jié)果與分析2.1優(yōu)良菌株的篩選結(jié)果經(jīng)平板劃線分離純化后

16、,共得到30余株多環(huán)芳烴降解菌。在篩選的過程中,根據(jù)各菌種在篩選培養(yǎng)基上生長出來的時(shí)間及菌落的長勢,從30余株中挑選9余株生長時(shí)間快菌落典型的菌種保存。根據(jù)其在馴化篩選培養(yǎng)基上生長快慢,長勢好壞,以及菌落的典型性,綜合考慮選取1#,2#,4#,5#,7#,9#,并保留一組天然混合菌做進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌的細(xì)胞表面疏水性是決定細(xì)菌非特異性黏附到各種生物和非生物表面及界面的最重要的因素之一,也是影響細(xì)菌吸收和降解疏水性有機(jī)物質(zhì)的主要因素之一7,因此研究細(xì)菌的細(xì)胞表面疏水性具有一定意義。實(shí)驗(yàn)首先測定了利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)菌的菌體表面疏水性,其結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出4#菌的疏水性

17、最大為65.5%, 2#菌疏水性次之為50.0%,9#菌的最小為10.2%,1#菌、5#菌、7#菌的疏水性居中,在20%40%范圍內(nèi)。細(xì)菌表面物質(zhì)成分相當(dāng)復(fù)雜,但只有含有疏水側(cè)鏈或疏水端的成分才決定細(xì)菌的表面疏水性。細(xì)胞壁和膜中的疏水性脂質(zhì)物質(zhì)、親水性低聚糖、不斷重復(fù)的糖蛋白使得脂多糖分子具有兩親性特點(diǎn),菌體表面的憎水性說明細(xì)胞與憎水性的物質(zhì)有較強(qiáng)的相容性。菌體表面性質(zhì)的不同可能影響到細(xì)胞攝取多環(huán)芳烴的方式,進(jìn)而影響到多環(huán)芳烴分子的生物降解過程。分別在不同時(shí)刻取下反應(yīng)體系萃取測值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出隨反應(yīng)時(shí)間的延續(xù),各菌對芘均呈現(xiàn)一定的降解能力(空白對照曲線一直很低,且降解率

18、趨勢總的來說是不斷升高的。在給定反應(yīng)時(shí)間初期2d時(shí),2#菌和4#菌降解率曲線斜率最大,降解最快,此后2#菌降解率稍有回落,之后穩(wěn)固上升,降解速率最快;4#菌降解率回落后降解率曲線保持平緩。9#菌降解曲線波動很大,在12d穩(wěn)固增加,26d曲線稍有回落,接著呈上升趨勢,到第10天大幅度回落,但總的趨勢也是不斷上升的。從第13天的降解率結(jié)果看,2#菌降解最快,其次是5#菌和9#菌。有文獻(xiàn)報(bào)道7菌體表面疏水性有可能導(dǎo)致菌體表面對多環(huán)芳烴這類疏水性物質(zhì)的吸附,4#菌疏水性最大,反應(yīng)初期芘的表觀降解率大很可能與菌體表面疏水性大導(dǎo)致芘在菌體表面的吸附結(jié)合有關(guān),而不是真正的降解。從圖2還可以看出天然混合菌的降

19、解并不快,沒有顯示出各菌之間的協(xié)同優(yōu)勢,說明獲得的天然混合菌并一定是降解多環(huán)芳烴的優(yōu)勢組合菌。王蕾,等 多環(huán)芳烴降解菌的篩選及其對芘的降解研究第33卷 菌種在培養(yǎng)基中的生長周期不同,這是由于各菌種本身的差異,對生長環(huán)境的適應(yīng)能力,以及自身的繁殖能力等。從生長曲線結(jié)果看10d 前,4#菌生長最好,其次是2#菌,10d 后開始進(jìn)入衰減期,5#菌后期生長較快在第10天達(dá)到其生長量最大值,超過2#菌和4#菌。其他各菌生長曲線變化平緩。 從圖2和圖3可以看出在初始芘濃度為50mg/L 的體系中,2#菌生長的好也降解的快,5#菌在10d 時(shí)生長旺盛,降解率也有增快的趨勢。而4#菌生長良好降解率卻不高,這說

20、明并不是所有生長好的菌,降解率都高。生長能力和降解能力沒有必然聯(lián)系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取降解效率好,并且具有表面性質(zhì)有代表性的2#、9#菌為對象做本論文下面的實(shí)驗(yàn)。2.2溫度對優(yōu)良菌降解芘的影響分別放入20、25、30、35、40,160r/min 恒溫?fù)u床振搖。在48h 時(shí)取下測定反應(yīng)體系中剩余芘濃度,計(jì)算降解率,以確定溫度對優(yōu)良菌降解芘的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖4,從圖4可以看出,溫度對2#菌和9#菌對芘的降解有一定的影響。對于2#菌在30時(shí),對芘降解率最高,48h 降解率達(dá)23.57%,小于或大于這個(gè)溫度降解率均變低;對于9#菌情況正好相反,30時(shí)降解率最小,溫度增大或變小芘降解率都增加。40的

21、降解率相對最高為28.26%。其原因有待進(jìn)一步研究。 2.3無機(jī)離子對優(yōu)良菌降解芘的影響本節(jié)試驗(yàn)研究Mn 2+、Zn 2+、Co 2+、Mo 6+、Fe 3+、Cu 2+各離子對2株優(yōu)良菌對芘降解的影響,于2#菌Mn 2+和Mo 6+對降解有促進(jìn)作用,且前者優(yōu)于后者,降解率可以分別提高4%和2%;Co 2+、Fe 3+、Cu 2+均有不同程度的抑制作用,其中Cu 2+最為明顯;Zn 2+對2#菌的降解沒有影響。對于9#菌各離子對降解沒有明顯的促進(jìn)作用,其中Mn 2+、Co 2+、Cu 2+對降解影響不顯著,而Zn 2+和Fe 3+均有不同程度的抑制作用,其中Zn 2+最為明顯。Mn 2+對2#

22、的芘降解有促進(jìn)作用,這可能是由于Mn 2+是一些微生物酶的激活劑,可以加快微生物的生化反應(yīng)。2.4外加碳源對優(yōu)良菌降解芘的影響圖6中可以看出葡萄糖對2#、9#各菌的降解均有促進(jìn)作用,其中對2#菌的促進(jìn)較為明顯,48h 可以使降解率提高4%。這可能是由于葡萄糖是微生物生長的良好的營養(yǎng)物質(zhì),它的存在使菌體生命活動加強(qiáng),對芘的代謝能力進(jìn)一步加強(qiáng)。脲對2#菌的降解有抑制作用,對9#菌的降解幾乎無影響。其抑制作用很可能是由于脲與芘產(chǎn)生競爭代謝引起的,這一原因有待證實(shí)。46第1期3結(jié)論(1以焦化廠廢水溝底泥為菌源馴化分離篩選出6株菌,保存了一組天然混合菌。研究結(jié)果表明,各多環(huán)芳烴優(yōu)勢菌的菌體表面疏水性不同

23、,且這種不同可以影響到反應(yīng)初期菌株對芘的表觀降解率,總的來說菌體的疏水性表面較親水性表面對多環(huán)芳烴有更強(qiáng)的吸附性。菌種的表面疏水性在降解芘的過程中會發(fā)生變化,總的趨勢是疏水性表面疏水性變小,親水性表面疏水性變大。獲得的一組天然混合菌對芘降解率較低,說明天然混合菌并一定是降解多環(huán)芳烴的優(yōu)勢組合菌。另外,多環(huán)芳烴降解菌在芘培養(yǎng)液中生長能力和降解能力沒有必然聯(lián)系。(2采用生物搖床進(jìn)行單因素試驗(yàn),對兩株表面疏水性質(zhì)相差較大菌株在不同環(huán)境條件下的芘降解性能研究結(jié)果表明:2#菌、9#菌對芘的降解受溫度的影響,對于2#菌30是其降解率高的最佳溫度,48h 內(nèi)芘降解率可達(dá)23.57%,溫度降低或增大降解率都減

24、小;對于9#菌40是其降解的最佳溫度,48h時(shí)降解率達(dá)28.06%。Mn2+對2#的芘降解有促進(jìn)作用,對9#菌幾乎無影響;Cu2+對各菌對芘的降解均有不同程度的抑制作用,Zn2+、Co2+、Mo6+、Fe3+各離子對優(yōu)良菌降解芘的作用好壞視菌種類而定,對于不同的菌,其影響結(jié)果不同。其它碳源的影響實(shí)驗(yàn)表明葡萄糖對于2#菌和9#菌的芘降解是一個(gè)有利的因素。參考文獻(xiàn)1戴樹桂.環(huán)境化學(xué)M.北京:高等教育出版社,2002:318.Dai Shu-gui.Environmental ChemistryM.Beijing:Higher Education Press,2002:318.(in Chinese

25、2Kim Y H,Freeman J P,Moody J D,et al.Effects of pHon the degradation of phenanthrene and pyrene by My-cobacterium vanbaalenii PYR-1J.Applied Microbiology and Biotechnology,2005,67:275-285.3Guo C L,Zhou H W,Wong Y S,et al.Isolation of PAH-degrading bacteria from mangrove sediments and their biodegradation potentialJ.Mar Pollut Bull,2005,51:1054-1061.4Kanaly R A,Bartha R,Watanabe K,et al.Rapid mineral-iz