食品波譜學課程論文

1、高效液相色譜法在食品分析中的應用摘要：隨著科學技術的不斷發(fā)展，食品檢測方法被不斷開發(fā)出來，高效液相色譜法（HPLC）作為色譜分析法的一個分支，是一種熱門的新型分離分析技術。本文將從高效液相色譜的原理及特點進行綜述，將會著重介紹高效液相色譜在食品樣品分析中的應用及操作方法，并對高效液相色譜法的應用前景進行了展望。關鍵詞：高效液相色譜，食品分析，應用Application of High Performance Liquid Chromatography in food analysisAbstract: With the continuous development of science and

2、 technology, food detection methods have been developed, high performance liquid chromatography (HPLC) as a branch of chromatographic analysis, is a popular new separation and analysis technology. In this paper, the principle and characteristics of high performance liquid chromatography (HPLC) was s

3、ummarized. The application and operation method of high performance liquid chromatography (HPLC) in food sample analysis was introduced. The application prospect of high performance liquid chromatography (HPLC) was also discussed.Key woeds:high performance liquid chromatography (HPLC) ;food analysis

4、;application1 高效液相色譜概述1.1背景1903n年俄國植物化學家Tswett 首次提出“色譜法”（Chromatography）和“色譜圖”（Chromatogram）的概念。1930年以后，相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術。1952年，英國學者Martin和Synge基于他們在分配色譜方面的研究工作，提出了關于氣-液分配色譜的比較完整的理論和方法，把色譜技術向前推進了一大步，這是氣相色譜在此后的十多年間發(fā)展迅速的原因。1960年中后期，氣相色譜理論和實踐發(fā)展，以及機械、光學、電子等技術上的進步，將高壓泵和化學鍵和固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了高效液相色譜。1

5、970年中期以后，微處理機技術用于液相色譜，進一步提高了儀器的自動化水平和分析精度。1.2原理高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography ,HPLC）是20世紀70年代發(fā)展起來的一種以液體為流動相的分離分析技術。其基本原理是各組分在固定相和流動相中的吸附能力存在差異，當溶于流動相中的各組分流經(jīng)固定相時，各組分在兩相之間進行反復多次吸附與分配，由于各組分在兩相間的分配系數(shù)不同，各組分就會先后流出色譜柱，結合柱后檢測器加以檢測，從而實現(xiàn)各組分被分離檢測的目的。1高效液相色譜儀主要由輸液泵、色譜柱、檢測器、記錄器等組成。它將具有不同極性的單一溶劑或不同

6、比例的混合溶劑、緩沖液等作為流動相，用輸液泵將流動相壓入裝有填充劑的色譜柱，注入樣品溶液，經(jīng)流動相帶入柱內，在填充劑上分離后，各成分先后進入檢測器，記錄色譜圖，進行定性定量分析2。進樣器梯度淋洗參比色譜柱樣品色譜柱 壓力表氫焰監(jiān)測器溶劑槽高壓 輸液泵記錄儀視差折光監(jiān)測器紫光監(jiān)測器自動收集器圖1 高效液相色譜儀結構示意圖高效液相色譜中包括多種分離模式。按色譜過程的分離機制，可以將液相色譜法分為吸附色譜、分配色譜、空間排阻色譜、離子交換色譜及親和色譜等類別。根據(jù)流動相與固定相極性的差別，也可分為正相色譜和反相色譜兩種模式。流動相的極性大于固定相的極性時，稱為反相色譜；反之，稱為正相色譜。31.3特

7、點 高效液相色譜法（HPLC）作為色譜分析法的一個分支，是一種新型的分離分析技術，它是在經(jīng)典液相色譜的基礎上引入氣相色譜的理論，在技術上采用高效微粒固定相、新型高壓輸液泵和高靈敏度檢測器，從而具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高的特點。其綜合了氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的優(yōu)點，并加以發(fā)展，尤其對高沸點仍不氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質具有良好的分析效果，其分析速度快、操作簡單、靈敏度好、分離效能高，分離和測定一次完成，可以和多種波譜分析儀器聯(lián)用，易于自動化，現(xiàn)在的色譜儀器已經(jīng)可以實現(xiàn)從進樣到數(shù)據(jù)處理的全自動化操作。因此多被應用于食品分析、生物化學、環(huán)境分析、藥物及臨床分析等4。色譜法最大的缺點便是定性

8、能力較差。為克服這一缺點，已經(jīng)發(fā)展起來了色譜法與其他多種具有定性能力的分析技術的聯(lián)用。尤其是氣質聯(lián)用技術的快速發(fā)展，大大克服了色譜法的缺點。隨著色譜技術的發(fā)展，結合計算機各種軟件的開發(fā)，使HPLC與各種檢測儀器聯(lián)用，更加拓寬了HPLC的應用范圍。近年來，高效液相色譜儀的各個組成部件都有新的發(fā)展，使HPLC分析更加靈敏準確、簡便快速。特別是聯(lián)用技術的發(fā)展，使之在藥物分析、環(huán)境監(jiān)測及生命科學領域的應用更具重要意義2。目前我國已逐漸將HPLC法列為食品檢測添加劑、污染物、無機成分、營養(yǎng)成分、毒素等的國標方法5。高效液相色譜法適于分析分子量大、受熱不穩(wěn)定易分解的、高沸點不易揮發(fā)的、不同極性的有機化合物

9、；多種天然產(chǎn)物和生物活性物質；合成的和天然的高分子化合物等。它們涉及食品、環(huán)境污染物、合成藥物、生物化工產(chǎn)品及石油產(chǎn)品等，約占全部有機化合物的80%。32 高效液相色譜儀的使用方法以日本島津LC-20AT高效液相色譜儀為例，其包括CBM-20A系統(tǒng)控制器、LC-20AT溶液傳輸單元、DGU-20A3真空脫氣機、SPD-M20A二極管陣列檢測器、SIL-20A自動進樣器、RF-10AXL熒光檢測器以及CTO-20A柱溫箱和Varian380-LC蒸發(fā)光檢測器等部分。本儀器采用高壓梯度通過高壓輸液泵分別獨立精確控制流量、調整溶劑濃度比例，實現(xiàn)高效率、高精度混合；即配備了可提供全波長三維信息的二極管

10、陣列檢測器，全新的光路設計與有效的梯形狹縫池設計保證了高分辨率和高靈敏度；也配備了靈敏度更高、選擇性更好的熒光檢測器；還配備了具有高靈敏度、檢測范圍更廣的蒸發(fā)光檢測器。本儀器可以高效地分離分析高沸點、熱不穩(wěn)定的有機及生化試樣；二極管陣列檢測器對大部分有機化合物有響應；熒光檢測器可以檢測產(chǎn)生熒光的物質，對如多環(huán)芳烴、維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應；蒸發(fā)光散射檢測器對碳氫化合物、表面活性劑、聚合物、脂肪酸和氨基酸、油和揮發(fā)性低于流動相的任何樣品、不含發(fā)色團的化合物有響應。實驗操作開始前應先確定好色譜條件，例如流動相的成分及比例，檢測波長和柱溫等等，其次是制

11、備好對照品和供試品溶液。接下來就可以將樣品進行檢測了，高效液相色譜儀操作步驟：   1) 過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。  2) 對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。  3) 打開HPLC工作站（包括計算機軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。  4) 進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。  5) 有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽

12、取。沖洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10 ml/min。6) 調節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。7) 設計走樣方法。點擊file，選取select users and methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊new method。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點擊protocol

13、。一個完整的走樣方法需要包括：a.進樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進樣閥的loading-inject轉換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。  8) 進樣和進樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。9). 積分 單擊再解析，打開已經(jīng)完成的數(shù)據(jù)，會看到數(shù)據(jù)、方法、報告格式、批處理、全部文件形式。 點擊分析圖標，選擇多色譜，提取所要波長下的峰。 在積分頁面，選擇通道，半峰寬，斜率

14、，最小峰面積，一般選擇面積選項。識別頁面，利用時間窗或時間帶限制峰。3 高效液相色譜法在食品分析中的應用高效液相色譜法在食品分析中有著廣泛的應用，如分析食品中的營養(yǎng)成分、食品添加劑、有害物質殘留等等3.1分析食品中的營養(yǎng)成分對食品中營養(yǎng)成分進行檢測具有兩方面的意義：一方面為了避免人體中維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分的缺乏，就要有目的的從不同食物中獲取營養(yǎng)成分，從而合理安排膳食。因此可以利用高效液相色譜法獲知食品中所含的成分種類及含量。另一方面可以通過食品中相關成分的檢測為合理的開發(fā)利用天然食品提供依據(jù)。賀利民6等使用美國TSP公司的Spectra SYSTEM UV3000HR可高速掃描的紫外可見檢

15、測器，實現(xiàn)了維生素A、D和E的同時紫外區(qū)掃描，據(jù)此選擇各自最大吸收性波長，探討了南中國深海小魚中脂溶性維生素A、D和E的3波長同時測定，質量濃度為0.1010mg/L范圍內，維生素A、D、E均呈現(xiàn)良好的線性關系，檢出限為0.050.62mg/L，回收率在90.0%110%之間，方法準確度和精密度完全符合分析檢測要求。李艷艷3等采用日本島津LC-20A高效液相色譜儀對豆奶粉中的四種大豆異黃酮（大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素）進行了測定。大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素的線性范圍分別是0.74100.00µg/mL，0.74200.00µg/mL，0.167500.0

16、0µg/mL，0.198160.00µg/mL（r0.9996），線性關系良好；加樣回收率（n=9）分別為100.01%，100.01%，99.48%，99.91%，方法簡便、靈敏、準確，適用于豆奶粉中這四種大豆異黃酮成分的含量測定和產(chǎn)品質量控制。3.2分析食品中的添加劑近年來，食品安全問題頻頻曝光，食品生產(chǎn)過程中添加劑的過量使用及非法添加物的使用是導致食品安全問題貧乏的重要因素之一。目前食品添加劑存在的安全風險主要包括兩個方面：一是法定允許使用的食品添加劑過量、超范圍使用，二是不法生產(chǎn)者將一些工業(yè)用的化學品或未達到食品添加劑標準的原料非法添加到食品中。這些不法添加劑的使用

17、可能會危害身體健康，因此必須加強對食品添加劑的檢測。劉敏等7采用簡單高效的前處理技術，并結合高效液相色譜法對多種食品添加劑及違法添加物進行了定性和定量研究。以調味品、餅干、加工肉制品三類具有一定代表性的基質復雜的樣品作為檢測對象，以8種抗氧化劑為目標分析產(chǎn)物，用凝膠滲透色譜（GPC）凈化經(jīng)C18柱高效液相色譜分析，三種樣品的添加回收率均在75.62%104.19%之間，相對標準偏差小于10%，檢出限為0.311.46µg/g。3.3分析有害物質殘留在一些食品中會有農(nóng)藥獸藥以及霉菌毒素等有害物質殘留，危害人體健康。因此對對食品中這些物質進行檢測是十分必要的。應用高效液相色譜技術和免疫親

18、和柱萃取，檢測限為10ng/kg，可檢測酸奶等食品中是否含有黃曲霉素；應用高效液相色譜與大氣壓化學電離質譜聯(lián)用，檢測限為0.12pg/kg，可檢測粗提物食品中的玉米烯酮霉素。8目前檢測食品中的獸藥殘留主要用ODS-C18色譜柱的方法，檢測呋喃唑酮的殘留量使用的流動相中乙腈、水和磷酸的體積比為40:6:1.動物性肌肉中的金霉素、四環(huán)素、土霉素和強力霉素等殘留也可通過固相萃取-高效液相色譜技術進行檢測，液相檢測技術檢測獸藥殘留的準確度高，回收率達到85%以上。4 結語綜上所述，高效液相色譜法作為目前市場上進行食品安全檢測的一種高效方便、準確實用的分析分離手段，得到了廣泛應用。通過液相色譜檢測技術可以進行多種食品營養(yǎng)成分分析和食品添加劑及有害物質檢測等問題，提升食品質量。隨著科學技術的不斷進步，食品檢測技術也會越來越多樣，越來越便捷準確，高效液相色譜法在食品中的應用也將會越來越廣泛。參考文獻：1高效液相色譜法-離子色譜法在環(huán)境分析和食品分析中的應用研究，熊建飛2高效液相色譜法在食品分析和藥物分析中的應