干化學(xué)技術(shù)與應(yīng)用所謂干化學(xué)是與傳統(tǒng)的濕化學(xué)即溶液化學(xué)相對(duì)比

1、干化學(xué)技術(shù)與應(yīng)用所謂“干化學(xué)是與傳統(tǒng)的“濕化學(xué)即溶液化學(xué)相比照擬而言的。它是以被檢測(cè)樣品中的液體作為反響媒介，待測(cè)物直接與固化于載體上的干粉試劑反響的一種方式。它與傳統(tǒng)濕化學(xué)的最大區(qū)別就在于參與化學(xué)反響的媒介不同。隨著生物化學(xué)中酶的別離、提純、存儲(chǔ)等技術(shù)的開展，傳感器、光度計(jì)和電極技術(shù)的進(jìn)步，以及計(jì)算機(jī)應(yīng)用的普及，干化學(xué)技術(shù)在近20年里得到了長足的進(jìn)步，相對(duì)于“濕化學(xué)，“干化學(xué)具有如下優(yōu)點(diǎn)：比擬點(diǎn)P干式生化心濕式生化倍統(tǒng)檢測(cè)心試制2準(zhǔn)備工作卩定標(biāo)門無需際畑的穩(wěn)定性心周期長數(shù)月卩周期短口種類卩全血可直攝上機(jī)檢浪卜全血不可心給排水系統(tǒng)Q無需占電源心無需后備電源除非大型設(shè)備»大參數(shù)需要電源

2、裝備Q操作心簡單便捷t觸小時(shí)待機(jī) 試劑無需設(shè)置和堆備+ 分?jǐn)厍昂鬅o需淸洗心菲專業(yè)人員丕可操作訂試劑需堆備，存在浪費(fèi)，測(cè)試后清洗心 預(yù)熱，測(cè)試前的港潔心校正Q的卡校正匸每次測(cè)訶原那么上需要枝正心容易口繁瑣口運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用衛(wèi)拝本少經(jīng)濟(jì)心拝本少 > 不經(jīng)濟(jì)心反響條件變動(dòng)衛(wèi)不可喪如可孌動(dòng)卩干化學(xué)試劑載體的結(jié)構(gòu) 干化學(xué)試劑載體的結(jié)構(gòu)分為二層結(jié)構(gòu)，三層結(jié)構(gòu)，和多層膜。最簡單的二層結(jié)構(gòu)用于生化分析的試劑載體最簡單的是二層結(jié)構(gòu)，在支持層塑料基片上有一試劑層纖維素片，在纖維素片中預(yù)固相了全部試劑。常見的是尿生化分析試劑條：尿液中的待測(cè)成分與預(yù)固相在纖維素片上的試劑直接反響，通過反射光度計(jì)測(cè)定其顏色的改變，從而計(jì)

3、算待測(cè)成份的濃度。這種機(jī) 構(gòu)只能對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定性或半定量測(cè)定，這樣就限制了它在其它須準(zhǔn)確定量的標(biāo)本的應(yīng)用。稍加改良的三層結(jié)構(gòu) 在試劑層上加一多孔膠膜過濾層，其作用是將樣品中的雜質(zhì)過濾掉，并起保護(hù)試劑層作用。常見的是微量法測(cè)定葡萄糖的試劑條。三層試劑載體的測(cè)定光路是通過透明的塑料基片，而不經(jīng)過最上面的過濾層，這樣消除了樣品中干擾成分的影響，保證了待測(cè)成分 測(cè)定的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。比擬完善的多層膜當(dāng)代臨床檢驗(yàn)中的干化學(xué)法，最具代表性的就是多層膜法，即干化學(xué)的多層膜試劑載體。它集現(xiàn)代化學(xué)、光學(xué)、酶工程學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體。多層膜分為三種類型：比色/速率法干片、離子法干片和免疫速率法干片1

4、.1 介紹比色/速率法干片比色/速率法干片主要用于常規(guī)生化工程的測(cè)定，干片模式圖圖1顯示了一個(gè)臨床化學(xué)比色/速率法干片模式簡圖。在這個(gè)試劑片中，多種反響試劑被固化在一張透明聚酯膜上，上面覆以多孔的擴(kuò)散層，然后被夾在一個(gè)塑料結(jié)構(gòu)中。如下圖，共有4個(gè)功能層:擴(kuò)散層、試劑層、指示劑層和支持層。每個(gè)試劑片的層數(shù)視所采用的分析方法而定，干片的大小大致與一枚郵票相同，顯色劑層呈現(xiàn)的 顏色深淺與待測(cè)物濃度成正比。圖4干片模式圖擴(kuò)散層：擴(kuò)散層的概念最早是由柯達(dá)研究實(shí)驗(yàn)室Edwin Przybylowic 博士提出的，是由TiO2,BaSO4和醋酸纖維素構(gòu)成的100-300微米的多空聚合物，聚合物的孔徑在1.5

5、 30微米之間。擴(kuò)散層的孔徑和厚度將取決于特定分析的需要。擴(kuò)散層的中空體積占 40% 90%這種毛細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能使樣品溶液快速、均勻地分布到下層。當(dāng)一滴樣品約10微升加在試劑片上后，毛細(xì)作用將樣品迅速吸入多空擴(kuò)散層，但樣品在一瞬間被下面的凝膠層所排斥，因?yàn)槟z層在接受血清組份之前，必須先生成水合物。擴(kuò)散層不僅可阻留細(xì)胞，結(jié)晶和其他小顆粒，它也可以根據(jù)需要讓大分子，如蛋白質(zhì)等滯留。當(dāng)待檢樣品通過擴(kuò)散層后，可以消除溶液中影響檢測(cè)反響干擾物質(zhì)。擴(kuò)散層中的TiO2和BaSO4.方面可用來掩蓋待檢樣品中的有色物質(zhì)，使反射光度計(jì)的測(cè)定結(jié)果不受影響，同時(shí)這些反光化合物也給干片底層的顯色層提供反射背景。在一些特

6、定試劑片中，擴(kuò)散層中還含有選擇性阻留某種成份或啟 動(dòng)某種反響的物質(zhì)，以提高分析的特異性。試劑層：在化學(xué)試劑層中，根據(jù)實(shí)際測(cè)定的需要，可由數(shù)層至數(shù)十個(gè)功能試劑層組成。反響區(qū)的功能是將待測(cè)物通過物理、化學(xué)或生物酶學(xué)等反響轉(zhuǎn)化為可與顯色劑結(jié)合的化合物。試劑層中按照反響的順序涂布了不同的化學(xué)試劑，使反響按照預(yù)先的設(shè)定依次進(jìn)行。針對(duì)不同檢測(cè)工程的個(gè)性化設(shè)計(jì)為化學(xué)反響提供了最理想的物理和化學(xué)反響環(huán)境一這就是為什么干化學(xué)技術(shù)能夠確保更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。尿酸干片是使用去除劑層的一個(gè)例如。去除劑層含有抗壞血酸氧化酶，用于將抗壞血酸維生素C一種內(nèi)源性干擾物轉(zhuǎn)化，對(duì)試劑層中所發(fā)生反響不產(chǎn)生干擾。指示劑層：反響底物進(jìn)入

7、指示劑層，在這里發(fā)生顯色反響。此層包含染料或相似的指示劑，使反響產(chǎn)物到達(dá)指示劑層后生成了有 色化合物，其顏色變化與分析物濃度成比例，被反射光檢測(cè)支持層：此層是透明塑料制成，起到支持其它層的作用，且允許光線百分之百透射，以便對(duì)有色復(fù)合物進(jìn)行測(cè)量。顏色變化通過反射光檢測(cè)，由于光線不通過已經(jīng)被阻留在擴(kuò)散層上的潛在干擾物，從而防止了對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。因?yàn)槎鄬拥脑O(shè)計(jì)，不同的工程參加了特殊的試劑層增強(qiáng)反響的特異性，干化學(xué)具有優(yōu)異的抗干擾能力。結(jié)合非結(jié)合膽紅素BuBc干片是使用屏蔽層的一個(gè)例如。屏蔽層可有效阻隔可能的干擾成分例如，血紅蛋白以防其進(jìn)入擴(kuò)散層，從而防止它們影響測(cè)量結(jié)果。1.2 直接選擇性電極離子

8、檢測(cè)干片離子鈉，鉀，氯檢測(cè)是干化學(xué)檢測(cè)工程中的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)工程，采用離子法干片。其設(shè)計(jì)采用直接電勢(shì)法，樣本無需稀釋。離子干片是由紙橋?qū)蓚€(gè)離子選擇性電極相連，通過電壓表來測(cè)量患者樣本和參比液之間的電勢(shì)差，從而計(jì)算出鈉，鉀，氯的離子濃度。1.3 免疫速率法干片免疫速率法干片主要用于進(jìn)行藥物濃度和蛋白質(zhì)檢測(cè)，分為競爭法和非競爭性干片兩類。I. 競爭法例如地高辛讀數(shù)時(shí)采用了多點(diǎn)速率法來檢測(cè)分析物濃度。分析物與酶標(biāo)抗原競爭有限數(shù)量的抗體結(jié)合位點(diǎn)。參加含底物的免疫洗液，一方面洗去未結(jié)合物質(zhì)，另一方面抗原抗體復(fù)合物與無色底物反響顯色以670nm波長參加免疫洗液并孵育 2.5min后讀數(shù)；通過速率的變化采計(jì)算分

9、析物濃度，發(fā)射光密度與分析物濃度成反比。II.非競爭法CRP讀數(shù)時(shí)采用定點(diǎn)速率法。待測(cè)物與固相抗體、酶標(biāo)抗體形成夾心“三明治。參加含底物的免疫洗液后洗去讀數(shù)視窗區(qū)域未結(jié)合物質(zhì)，抗原抗體結(jié)合物與底物反響顯色，孵育2.5分鐘時(shí)讀數(shù)670nm發(fā)射光密度與待測(cè)物濃度成正比。1反射光度法的原理一一干化學(xué)分析法的理論根底反射光度法依據(jù)反射介質(zhì)不同，有多種理論。光線進(jìn)入介質(zhì)后出現(xiàn)以下效應(yīng)：在照射外表產(chǎn)生反射和折射內(nèi)部吸收在內(nèi)部或照射外表產(chǎn)生散射這些效應(yīng)的總和決定了光再離開介質(zhì)的比率和方向。反射光密度與分析物濃度不呈線性關(guān)系的原因是檢測(cè)到的光信號(hào)包含了反射光和散射光。光通過各層干片時(shí)，干片內(nèi)部各個(gè)層和外表會(huì)產(chǎn)

10、生散射和反射。檢測(cè)比色/速率和免疫速率法干片時(shí)采用的是反射分光光度法。強(qiáng)生干化學(xué)技術(shù)反射光理論是Williams,Clapper 等提出的。在儀器內(nèi)部光源發(fā)出一束光透過透明支持層，在試劑層光被有色化合物局部吸收后，在擴(kuò)散層提供的反射面被反射，反射光經(jīng)濾光裝置后回到光度檢測(cè)器被讀數(shù)。光密度由此被轉(zhuǎn)化為電壓讀數(shù)，并計(jì)算成分析物濃度。圖E反射光示意圖干化學(xué)技術(shù)中入射光IO 100%進(jìn)入干片。有色物質(zhì)吸收一定比例光后反射。反射法檢測(cè)反射光IR，反射比為 R= lr/lo反射光密度DR公式為DR=log10反射法中，分析物濃度與DR不成比例關(guān)系。C不等于Ao 截距+A1 斜率*DR雖然不呈線性關(guān)系，但是

11、結(jié)果仍然可以預(yù)測(cè)。嚴(yán)密的研究建立了患者標(biāo)本濃度與反射光密度間的數(shù)學(xué)關(guān)系。通過一個(gè)函數(shù)就可完成二者間轉(zhuǎn)換。函數(shù)關(guān)系是使用前通過定標(biāo)盤載入檢測(cè)系統(tǒng)，通過函數(shù)實(shí)現(xiàn)每種測(cè)試工程的轉(zhuǎn)換。通用定標(biāo)模式這是用來把儀器檢測(cè)光密度與分析物濃度建立關(guān)聯(lián)的通用公式。A0、A1、A2是未知的，需經(jīng)定標(biāo)程序計(jì)算得出gDR是將檢測(cè)g(DR)與濃度呈線性關(guān)系。許多分析工程用了二條將DR轉(zhuǎn)換成g(DR)，轉(zhuǎn)換函數(shù)是出廠時(shí)由大量該儀器反復(fù)研究得出的，確保了 曲線來完成分析物濃度的轉(zhuǎn)換?！癉R曲線及“函數(shù)轉(zhuǎn)換曲線，二者在通過原點(diǎn)的直線上相交幾點(diǎn)可以看到二者呈鏡像關(guān)系。將它們疊加后，結(jié)果將全部落在 直線上。正是引入“函數(shù)轉(zhuǎn)換的目的

12、。當(dāng)然，此圖8只是為了便于理解而畫的比擬規(guī)律，實(shí)際更為復(fù)雜。0.4每個(gè)定標(biāo)品的g(DR)值都定義在通用定標(biāo)模式中，方程式A (圖9)函數(shù)轉(zhuǎn)換曲線與定標(biāo)曲線是相對(duì)應(yīng)的，當(dāng)DR為1.0時(shí)那么轉(zhuǎn)化為g(DR)校正讀數(shù)為1.3，當(dāng)DR為0.6時(shí)，校正讀數(shù)應(yīng)為g(DR)與通用定標(biāo)模式值和未知值定標(biāo)中的值有：C:三個(gè)是標(biāo)品的濃度，是通過定標(biāo)盤載入儀器的DR：從干片測(cè)得K:每種工程固定不變由定標(biāo)載入雖未知但可計(jì)算出，是定標(biāo)參數(shù)：A0=截距A仁斜率A2=曲率通過廠家的設(shè)置和用戶端的定標(biāo)操作，每個(gè)標(biāo)本的結(jié)果就可以通過光信號(hào)值計(jì)算得到反射光的反射背景是擴(kuò)散層，光線不通過已經(jīng)被阻留在擴(kuò)散層上的潛在干擾物，從而防止了

13、對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。這是擴(kuò)散層承當(dāng) 排除干擾的根底。由試劑片的結(jié)構(gòu)和反射光檢測(cè)技術(shù)可見涂層技術(shù)相對(duì)于溶液化學(xué)分析技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)： 在試劑片中化學(xué)反響可以在個(gè)別物理分 層中進(jìn)行，如下圖，前一反響的產(chǎn)物可以繼續(xù)進(jìn)入另一層進(jìn)行其他化學(xué)反響，從而引導(dǎo)一個(gè)反響序列，因此在多層復(fù)合薄膜中的各層 可以給出一種特定的環(huán)境用以完成某種特定的反響。這一點(diǎn)溶液化學(xué)分析是無法完成的，例如乳糜血的樣品，在進(jìn)行溶液方式生化分析 時(shí)，就需要先脫脂，然后進(jìn)行分析，而利用多層復(fù)合膜技術(shù)，即可在一個(gè)薄膜上一次完成全部反響，明顯提高了分析的特異性。同時(shí)由 于沒有溶液對(duì)待檢樣品的稀釋作用，所以本方法也可大大提高了檢測(cè)的靈敏度。這種能夠?qū)嵤讉€(gè)連續(xù)的物理和或化學(xué)反響而無需操作 者介入的方法，就像計(jì)算機(jī)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的芯片技術(shù)，可以使繁雜的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備和各種器皿聯(lián)合完成的工作固化在一個(gè)多層復(fù)合 薄膜上，極大的簡化了操作和提高重復(fù)性及穩(wěn)定性。因此，在短短的十幾年時(shí)間里，干化學(xué)技術(shù)即在世界各臨床化學(xué)實(shí)驗(yàn)室廣為應(yīng)用。經(jīng)過