透質(zhì)細(xì)胞毒性

1、食品與藥品FoodandDrug2006年第8卷第O2A期31 ? 論著? 醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 王昕,朱雪濤,施燕平 (國(guó)家藥品食品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,山東濟(jì)南250013) 摘要:目的研究醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉的細(xì)胞毒性.方法遵照ISO10993醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)原則,采用 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的兩種實(shí)驗(yàn)方法,更全面地反應(yīng)醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉的細(xì)胞毒性.結(jié)果醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉為0級(jí)反應(yīng)陰性和陽(yáng)性 對(duì)照組的反應(yīng)符合規(guī)定.結(jié)論醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉無(wú)細(xì)胞毒性. 關(guān)鍵詞:醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉;細(xì)胞毒性t浸提液 中圖分類號(hào):R969文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1672979X(2006)一02003

2、1-03Experimentonthecytotoxicityofmedicalsodiumhyaluronate WANGXin,ZHUXue-tao,SHIYah-ping(StateDrugandFoodAdministrationJinanQualitySupervisionandInspectionCenterforMedicalDevices, Jinan250013,China) Abstract:0bjectiveTostudythecytotoxicityofmedicalsodiumhyaluronate.MethodsAccordingtothe experimental

3、principleofinternationalbiologicalappraisingstandard(ISO10993)onmedicalapparatus,twointer nationalstandardexperimentalmethodsareadoptedonthestudyformedicalsodiumhyaluronatebywhichthe cytotoxicitycanberevealedcompletely.ResultsThemedicalsodiumhyaluronateiszerolevelwhilethenormaland modelgroupsarereas

4、onable.ConclusionThemedicalsodiumhyaluronateisnoncytotoxicity. Keywords:medicalsodiumhyaluronate;cytotoxicitytest;extractedfluid 醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉在醫(yī)院臨床和醫(yī)藥工業(yè)中被廣 泛應(yīng)用,其質(zhì)量直接關(guān)系著廣大人民群眾的身體健 康,必須控制好其質(zhì)量,進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià),使其 具有極高的生物安全性.我們使用生物學(xué)評(píng)價(jià)中首 選的體外篩選實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè),它 對(duì)反映醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量非常靈敏. 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)是將哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞小鼠 成纖維細(xì)胞ATCCCCLI(NCTCclone

5、929),在離體 狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng),模擬哺乳動(dòng)物生物體體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán) 境,檢測(cè)醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉及其浸提液接觸哺乳類細(xì) 胞后其生物學(xué)的反映. 1浸提液實(shí)驗(yàn) 1.1原理.t 使實(shí)驗(yàn)樣品的浸提液接觸受試細(xì)胞,通過對(duì)細(xì) 胞增生和抑制影響的測(cè)試,評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)細(xì)胞的 體外毒性作用.噻唑藍(lán)(又稱溴化四唑藍(lán),MTT) 比色法的原理是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的線粒體酶將黃綠色 的MTT降解形成藍(lán)紫色的物質(zhì),用二甲基亞砜 (DMSO)將其溶解,用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度,從 而定量測(cè)定細(xì)胞的存活比例.該實(shí)驗(yàn)用于定量評(píng)價(jià) 細(xì)胞毒性. 1.2材料與儀器 1.2.1材料醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉;高密度聚乙烯;天 然乳膠;MT'I'【3-(

6、4,5-dimethylthiazol一2一y1)一2,5-diphe- nyltetrazoliumbromide(進(jìn)口分裝);RPMIMedium1640培養(yǎng)基(GIBCOBRL);新生牛血清(杭 州四季青生物工程材料有限公司);胰酶(上海 源聚生物科技有限公司);0.9%氯化鈉注射液 (上海通用藥液有限公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分 析純. 1.2.2儀器超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司); CO.培養(yǎng)箱(SheldonManufacturing,Inc.);倒置 收稿日期:20050907 作者簡(jiǎn)介:王昕(1968.),女,山東龍口縣人,高級(jí)工程師,研究方向?yàn)獒t(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 32食品與藥品

7、FoodandDrug2006年第8卷第02A期 光學(xué)顯微鏡(重慶光學(xué)儀器公司);光學(xué)顯微鏡 (OLYMPUS);蒸汽滅菌器(山東新華醫(yī)療器械 股份有限公司),電熱恒溫水浴鍋(上海儀表集 團(tuán)公司);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(c0Star);可調(diào)式 微量加樣器(Finnpipette);酶標(biāo)儀(Labsystems Drag0n). 1,3方法 1.3.1樣品制備使用相同條件制備的醫(yī)用透明 質(zhì)酸鈉(實(shí)驗(yàn)樣品),高密度聚乙烯(陰性對(duì)照) 和天然乳膠(陽(yáng)性對(duì)照)材料的浸提液. 浸提條件;浸提介質(zhì)為含10%血清細(xì)胞培養(yǎng) 液;浸提比例為每0.2g樣品加1m1浸提介質(zhì); 浸提溫度為37;浸提時(shí)問為24h. 1.3

8、.2實(shí)驗(yàn)步驟(1)培養(yǎng)細(xì)胞直至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期末細(xì)胞趨于融合,用細(xì)胞消化液消化分散細(xì)胞, 用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成1X10個(gè)/ml的細(xì)胞懸液.取96孔培養(yǎng)板,每孔中加入100l的細(xì)胞懸浮液. 輕輕水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻地分散在皿孔的表 面;(2)置含5%二氧化碳培養(yǎng)箱,在37±2溫度 下培養(yǎng)24h;(3)棄去原培養(yǎng)液,每孔加入200IJl的 空白對(duì)照液,陰性對(duì)照液,陽(yáng)性對(duì)照液,l00%濃 度的實(shí)驗(yàn)樣品浸提液.每組至少設(shè)8孔;(4)置含 5%二氧化碳培養(yǎng)箱,在37±2溫度下培養(yǎng)48h; (5)培養(yǎng)后,每孔加入20lMTT溶液(濃度為 5mg/m1),置含5%二氧化碳培養(yǎng)箱,在37&

9、#177;2 溫度下培養(yǎng)5h;(6)棄去孔內(nèi)液體,每孑L分別 加入200lDMSO,將培養(yǎng)板放置10rain,水平 振搖使孔內(nèi)溶液顏色均勻;(7)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光 度,采用雙波長(zhǎng)測(cè)定法,選用的波長(zhǎng)為570nm和 630rim;(8)結(jié)果計(jì)算:細(xì)胞相對(duì)增生率RGR(%) = 實(shí)驗(yàn)樣品組(陰性對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組)的吸 光度÷空白對(duì)照組的吸光度X100%;(9)結(jié)果判 斷,見表1. 表1醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 級(jí)別反應(yīng)程度顯微鏡下反應(yīng)觀察 1.4結(jié)果 空白對(duì)照組為0級(jí)反應(yīng),陰性對(duì)照組為1級(jí)反 應(yīng),陽(yáng)性對(duì)照組為4級(jí)反應(yīng),實(shí)驗(yàn)樣品浸提液為0 級(jí)反應(yīng).陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的反應(yīng)符合規(guī)

10、定,本實(shí)驗(yàn)成立. 1.5結(jié)論 實(shí)驗(yàn)樣品即醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉提取液(按每O.2g 實(shí)驗(yàn)樣品加1ml浸提介質(zhì)的比例,置于37下提 取24h)表現(xiàn)出無(wú)細(xì)胞毒性的證據(jù).細(xì)胞毒性為0級(jí).醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉具有良好的細(xì)胞相容性,是 優(yōu)良的生物材料. 2直接接觸實(shí)驗(yàn) 2.1原理 細(xì)胞聾性檢測(cè)中最嚴(yán)格的評(píng)價(jià)方法-直接接 觸法,用于檢測(cè)組織工程材料.在本實(shí)驗(yàn)中使用直 接接觸法評(píng)價(jià)醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉的細(xì)胞毒性.該實(shí)驗(yàn) 用于定性評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性. 2.2材料與儀器 同浸提液實(shí)驗(yàn). 2.3方法 2.3.1樣品制備陰性對(duì)照為已經(jīng)確認(rèn)的不產(chǎn)生細(xì) 胞毒性反應(yīng)的材料高密度聚乙烯,陽(yáng)性對(duì)照為經(jīng)確 認(rèn)的可重現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)的材料天然乳膠,實(shí)驗(yàn)樣

11、品為醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉. 2.3.2實(shí)驗(yàn)步驟(1)培養(yǎng)細(xì)胞直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 末細(xì)胞趨于融合,用細(xì)胞消化液消化分散細(xì)胞,用 細(xì)胞培養(yǎng)液配制成1X10個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,從混 勻的細(xì)胞懸浮液中吸取2ml的懸浮液,注入6孔培 養(yǎng)板的每孔內(nèi).輕輕水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻地 分散在皿孔的表面;(2)置含5%二氧化碳培養(yǎng) 箱,在37±2溫度下培養(yǎng)24h;(3)實(shí)驗(yàn)前用 顯微鏡檢查培養(yǎng)細(xì)胞單層的情況.棄去原培養(yǎng)液, 每孔加入2ml的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液.將實(shí)驗(yàn)樣品,陰 性對(duì)照樣品,陽(yáng)性對(duì)照樣品分別輕輕放入培養(yǎng)板孔 內(nèi),并使其沉于皿底,每組平行操作3孔;(4) 置含5%-氧化碳培養(yǎng)箱,在37±2溫度下

12、培養(yǎng)48 h;(5)置倒置光學(xué)顯微鏡下觀察,按表2細(xì)胞 毒性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定. 表2細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 2.4結(jié)果 空白對(duì)照組為0級(jí)反應(yīng),陰性對(duì)照組為l級(jí)反 應(yīng),陽(yáng)性對(duì)照組為4級(jí)反應(yīng),實(shí)驗(yàn)樣品浸提液為0 0ll_000000000.00一 食品與藥品FoodandDrug2006年第8卷第02A期33 級(jí)反應(yīng).陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的反應(yīng)符合規(guī) 定,本實(shí)驗(yàn)成立. 2.5結(jié)論 實(shí)驗(yàn)樣品即醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉細(xì)胞毒性為0級(jí). 醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉具有良好的組織相容性,是優(yōu)良的 組織工程材料. 參考文獻(xiàn) 1】GB/T16886.122000,醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)一第l2部 分:樣品制備與參照樣品s. 【2G

13、B/T16886.52003,醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)一第5部分: 細(xì)胞毒性試驗(yàn):體外法【s. 【3USPXX1124版IS.BiologicalReactivityTests./nvivo. 玻璃酸鈉加bFGF促進(jìn)兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究 康思寧,劉強(qiáng) (山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,山西,太原030001) 摘要:目的研究外源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)與玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損的可行性 及有效性,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).方法相同方法制備兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損模型,20只家兔共40例,隨機(jī)分為 4組:(1)A組:bFGF+玻璃酸鈉,(2)B組:bFGF,(3)C

14、組:玻璃酸鈉,(4)D組:對(duì)照組,分別于術(shù)后第3,4,5, 6,7周注射.術(shù)后12周取材觀察其大體,光鏡情況,指標(biāo)量化行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.結(jié)果大體觀察顯示:A,B組均能 修復(fù)組織較好的覆蓋缺損,而C,D組較差,其組間P=0,388,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,除此之外任何兩組間P值均小0.01, 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.光鏡觀察顯示:任何兩組間P值均小于0.0l,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義結(jié)論外源性bFGF對(duì)兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨 缺損的修復(fù)有促細(xì)胞增生分化作用,且外源性bFGF與玻璃酸鈉結(jié)合對(duì)軟骨缺損修復(fù)有顯著促進(jìn)作用,可望臨床應(yīng)用. 關(guān)鍵詞:關(guān)節(jié)軟骨;缺損;玻璃酸鈉;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 中圖分類號(hào):Q538文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1

15、672979X(2006).02.003304 ExperimentalstudyoneffectsofsodiumhyaluronateandbFGFonrepairingfull-thickness articularcartilagedefectsoftherabbits'knees KANGSi.ning.UUQiang (TheFirstClinicaZHospitalofShanxiMedicafUniversity,Tauan030001,China) Abstract:ObjectiveTostudytheavailabilitytorepairfullthicknes

16、sarticularcartilagedefectsoftherabbits' kneeswithexogenousbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)andsodiumhyaluronate(SH)byintraarticular injection.MethodsPreparinganimalmodelsofful1.thicknessarticularcartilagedefectswithsamemethod.20adult rabbits(40examples)weredividedinto4groups:(1)bFGF+SH;(2)bFGF;(

17、3)SH;(4)controlgroup,then,the postoperativeintraarticularinjectionofsampledspecimensweregiveninthe3rd,4th,5th,6thand7thweek, respectively,thengavethemopticalmicroscopicalandmacroscopicalresearchin12thweek,andanalyzedthe experimentaldatawithstatisticalmethods.ResultsMacroscopicalresearch:The1stand2nd

18、groupcouldrepairthe defectsbetterthanthe3rdand4thgroup,further,the1stgroupwasbetterthanthe2ndgroup(P<0.O1).Optical microscopicalresearch:The1stgroupwasbetterthanthe2nd,3rdand4thgroup,andthePofeverytwogroups wassmallerthan0.01.ConclusionExogenousbFGFhassignificanteffectsofimprovingcellproliferationand differentiationinrepairingof