木霉TP100726菌株固體發(fā)酵及所產(chǎn)纖維素酶酶學性質(zhì)的研究

1、木霉TP100726菌株固體發(fā)酵及所產(chǎn)纖維素酶酶學性質(zhì)的研究摘要本試驗以在木霉TP100726菌株固體發(fā)酵基質(zhì)中加入木糖渣為目的，研究其在其它條件不變的情況下木糖渣對原始配方中稻草的替換，并進一步考察木霉TP100726菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶學性質(zhì)及糖化木糖渣的情況。結(jié)果表明，木糖渣可替代20%的稻草粉。纖維素酶的最適溫度為50，最適pH為5.0，在50，pH=5.0時較穩(wěn)定。以木糖渣為底物，檸檬酸緩沖液，料液比為1:10，溫度為50，pH5.0時，糖化木糖渣酶活最高，為833U/ml。為利用工業(yè)廢棄物木糖渣作為原材料發(fā)酵生產(chǎn)可發(fā)酵糖提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。關(guān)鍵字：固體發(fā)酵，纖維素酶，木糖渣，酶學性質(zhì)A

2、bstractThe experiments is in order to join the xylose residue in the solid fermentation substrate of Trichoderma TP100726 strains, and study the xylose residue in the case of other conditions remain unchanged on the replacement of the original formula in the straw, and further investigated the Trich

3、oderma TP100726 strain cellulase produced by the enzymatic properties and saccharification xylose residue. The results show that xylose residue can replace 20% of the straw powder. The cellulase's optimal temperature is 50 ° C, the optimum pH is 5.0, and it is more stable at 50 ° C, pH

4、 = 5.0. Xylose residue substrate, citrate buffer solution, solid to liquid ratio of 1:10, temperature 50 ° C, pH 5.0 and the highest enzyme activity is achieve to 833u/ml. It provides the basic data of use xylose slag as raw materials to fermentation production of fermentable sugars.Key words:

5、solid fermentation, cellulose enzyme, xylose slag, properties1 引言1.1 纖維素酶纖維素類物質(zhì)是自然界中資源最為豐富的可再生的生物聚合物之一1。如果將天然纖維素降解為可利用的糖類物質(zhì),再進一步轉(zhuǎn)化為乙醇、菌體蛋白、氣體燃料(如氫氣)等物質(zhì),對解決當今世界所面臨的環(huán)境污染、糧食短缺、飼料資源緊張和能源危機等問題具有重大現(xiàn)實意義2，而纖維素酶是降解纖維素最有效的生物催化劑3。1.1.1 纖維素酶的組成纖維素酶(Cullulase)是一種能夠?qū)⒗w維素分解成多糖或單糖的復合酶系，主要由外切-葡聚糖酶、內(nèi)切-葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶等組成4。

6、纖維素酶中的外切-葡聚糖酶（簡稱C1），降解纖維素分子末端的-1,4糖苷鍵，產(chǎn)生纖維二糖；內(nèi)切-葡聚糖酶（簡稱CX），隨機地降解纖維素分子內(nèi)部的-1,4糖苷鍵，產(chǎn)生大量具有非還原性末端的小分子纖維素；-葡萄糖苷酶（簡稱CB），降解纖維糊精或纖維二糖生成葡萄糖。1.1.2 纖維素酶的來源纖維素酶種類繁多，廣泛存在于生物體中5。植物、動物、微生物體內(nèi)都能夠產(chǎn)生纖維素酶，且其主要來源是微生物。1906年在蝸牛的消化液中首先被人們發(fā)現(xiàn)6，1945年在微生物中發(fā)現(xiàn)，并將纖維素酶應用在工業(yè)上7。目前工業(yè)上用來生產(chǎn)纖維素酶的微生物多為絲狀真菌，其中工業(yè)產(chǎn)纖維素酶 80% 來源于木霉屬和曲霉屬。木霉屬中常見有

7、綠色木霉(Trichoderm aviride)、里氏木霉(Trichoderma ressiei)、康氏木霉等8，曲霉中常見的高產(chǎn)菌株為黑曲霉，青霉屬中國內(nèi)研究較為清楚并用于工業(yè)生產(chǎn)的為斜臥青霉9。本論文采用的是一株木霉TP100726菌株，它屬于一種未知的綠色木霉。1.2 木糖渣木糖渣是玉米棒芯經(jīng)酸水解制取木糖后剩下的纖維殘渣，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，是一種化工原料廢棄物，價格低廉10。由于已經(jīng)過稀酸水解，此種纖維素資源結(jié)晶度低，更容易被菌體利用和被纖維素酶水解，所以它也是一種優(yōu)質(zhì)的纖維素資源。如能將這些纖維質(zhì)的“廢渣”轉(zhuǎn)化利用，將帶來很大的經(jīng)濟效益和社會效益。1.3 纖維素

8、酶酶學性質(zhì)pH值和溫度是影響纖維素酶活力的重要因素，是酶制劑應用中的主要參數(shù)11。研究纖維素酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性、最適pH及酸堿穩(wěn)定性，有利于提高酶的催化效率，即提高酶促反應速度。本實驗即要對工業(yè)菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適溫度、最適pH、溫度穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及糖化木糖渣的情況進行研究。1.4研究內(nèi)容及目的本試驗固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶所采用的菌株是一株木霉TP100726號菌株，本研究擬用工業(yè)固體廢料木糖渣部分替代木霉TP100726號菌株固體發(fā)酵基質(zhì)中的稻草，并研究固體基質(zhì)替代后固體發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶的酶學性質(zhì)及其水解木糖渣的最適反應條件。具體包括研究固體基質(zhì)替代后固體發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶的最適溫度、最

9、適pH、溫度穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及糖化木糖渣的情況，為探索合理利用木糖渣，使工業(yè)廢料變廢為寶提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。2 木霉TP100726號菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化2.1 試驗材料2.1.1 試驗菌種 木霉TP100726號菌株，實驗室培養(yǎng)。2.1.2 發(fā)酵原料來源木糖渣：由河南濮陽研光鵬程生物制品有限公司提供。半纖維素23.5%、纖維素21.3%、木質(zhì)素6.70%、其它48.50%1214。麩皮：市場購置，粉碎至4060目，備用。稻草粉：市場購買南陽豆粉：市場購買2.1.3 試驗試劑及配制（1）試驗試劑試驗所用試劑見表2.1表2.1 試驗所用試劑試劑純度生產(chǎn)廠家磷酸氫二鉀A.R吳江市天源化工有限公

10、司氫氧化鈉A.R鄭州派尼化學試劑廠生物傳感儀標準液B.R山東省科學院生物研究所3,5-二硝基水楊酸A.R國藥集團化學試劑有限公司酒石酸鉀鈉A.R天津市凱通化學試劑有限公司無水亞硫酸鈉A.R天津市永大化學試劑開發(fā)中心苯酚A.R天津市風船化學試劑科技有限公司硫酸銨A.R北京奧博星生物科技有限公司（2）試驗試劑配制1518DNS溶液（3，5-二硝基水楊酸）：稱取3,5-二硝基水楊酸5g，置于300ml水中，逐漸加入NaOH 5g,于45水浴中攪拌溶解，再加入酒石酸鉀鈉100g，苯酚0.5g，無水亞硫酸鈉2.5g，定容至500ml，一周后使用。0.05M檸檬酸緩沖液：A液：稱7.56504g檸檬酸，溶

11、于720ml去離子水中。B液：稱17.646g檸檬酸鈉，溶于1200ml去離子水中。A液和B液慢慢混合，制成pH=5的緩沖液。CMC試劑的配制：稱取1g羧甲基纖維素鈉于100ml檸檬酸緩沖液中，待溶解后置于冰箱中保存。 1 mg/mL葡萄糖標準液：準確稱取經(jīng)80100烘至恒重的分析純葡萄糖100 mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，充分混勻后，于4冰箱保存?zhèn)溆谩?.1.4 試驗儀器試驗所用儀器如表2.2所示：表2.2 試驗所用儀器名稱型號生產(chǎn)廠家生物傳感分析儀SBA-40c山東省科學院生物研究所電熱恒溫培養(yǎng)箱DH4000 B型天津市泰

12、斯特儀器有限公司UV-VIS分光光度計UV-1700SHIMADZU CORPORATION滅菌鍋YXQ-LS-30SII上海博訊實業(yè)有限公司電子天平(普通)YP601N上海精密科學儀器有限公司冷藏陳列柜LSC-269CW星星集團有限公司純水儀Synergy®UV美國Millipore公司冰箱BCD-207AK合肥美菱股份有限公司烘箱DV-600YAMATO SCIENTIFIC CO，LTD.電熱恒溫水浴鍋HSQ-3上海智誠分析儀器制造有限公司pH儀RHS-3C上海鵬順科學儀器有限公司恒溫振蕩搖床智誠ZHWY-103D上海智誠分析儀器制造有限公司離心機TGL16B上海安亭科技儀器廠

13、-80°C低溫冰箱MDF-U4086S日本SANYO 2.1.5 培養(yǎng)基活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：取200 g去皮洗凈的土豆切成小塊，加水煮爛后濾出上清后定容至1000 ml，加入2% 葡萄糖，2% 瓊脂，107滅菌20 min。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：60%麩皮，40%稻草粉，3%(NH4)2SO4 ，1%KH2PO4固液配比 :1:1.5 ，裝料比: 每250ml錐形瓶加6.0g固體成分。121高壓蒸汽滅菌25 min，備用。2.1.6 粗酶液的制備 當菌株培養(yǎng)一定天數(shù)后，用檸檬酸緩沖液按1:10的固液比浸提3小時，然后4000r/min離心10min，取上清即為粗酶液。2.2 試驗方法

14、2.2.1 木霉TP100726菌株固體發(fā)酵2.2.1.1 配制培養(yǎng)基原始固體配比: 60%麩皮，40%稻草粉， 無機鹽溶液: 3%(NH4)2SO4 ，1%KH2PO4發(fā)酵培養(yǎng)基：固體基質(zhì)按正交表（表2.3）中組合進行配制，不足6.0g的用稻草來補。無機離子組成：3%(NH4)2SO4 ，1%KH2PO4固液配比 :1:1.5， 裝料比: 每250ml錐形瓶加6.0g固體成分2.2.1.2 正交試驗（1）設(shè)計正交表表2.3 正交實驗各因素與水平因素麩皮木糖渣豆粉11（20%）1（10%）1（0%）22（40%）2（20%）2（1%）33（60%）3（30%）3（2%）（2）在超凈工作臺里，將

15、培養(yǎng)基放入，紫外滅菌15min，然后無菌操作接入一環(huán)孢子，放于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3）在培養(yǎng)過程中，從第五天開始，每隔24h取發(fā)酵基質(zhì)一瓶，加入60ml緩沖液（固體裝料質(zhì)量：緩沖液體積=1:10），浸提3-5h（4）取浸提液于離心管中，4000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。（5）根據(jù)2.2.4中酶活測定方法測定粗酶液的FPA酶活和CMC 酶活。2.2.2 觀察2.2.2.1 表面觀察 用PDA培養(yǎng)基活化保存的菌株，并在培養(yǎng)過程中觀察木霉TP100726菌株菌落形態(tài)隨時間變化的情況。2.2.2.4 霉菌形態(tài)觀察用乳酸石碳酸棉蘭染色液對木霉TP100726菌株進行染色并觀察，

16、首先于潔凈載玻片上滴一滴乳酸碳酸棉蘭染色液，再用解剖針從霉菌菌落的邊緣取少量帶有孢子的菌絲置于染色液中。細心地將菌絲挑散開，小心地蓋上蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡。最后置顯微鏡下進行觀察。2.2.3 制作葡萄糖標準曲線 取5支試管，按表2.4加入1000 g/ml標準葡萄糖液及去離子水，得到從100 g/mL800 g/ml的標準管。分別吸取上述不同濃度的葡萄糖溶液1 ml，DNS試劑1 ml，混合均勻，沸水浴加熱7 min，取出，用水冷卻，用去離子水定容至10 ml，置分光光度計上540 nm處測定光密度值，以空白管(0管)做對照。表2.4標準葡萄糖液配比管號1000 g/ml葡萄糖（ml）H2

17、O（ml）葡萄糖濃度C（g/L）001001190.12280.23460.44640.65820.8 2.2.4 酶活測定方法1921FPA測定：取0.5 ml適當稀釋的粗酶液，加入pH 5.0 的0.05 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液0.5 ml，混勻后加入1×6 cm新華濾紙條，空白對照中加入1ml DNS，于50保溫1 h（先預熱5 min），然后加入1 ml DNS沸水浴7 min，流水冷卻至室溫，用蒸餾水定容至10 ml，在540 nm處測定OD值，根據(jù)吸光度從葡萄糖標準曲線中查出相應的葡萄糖含量，根據(jù)葡萄糖生成量計算酶活。CMC 酶活測定：取0.5 ml適當稀釋粗酶

18、液，加入0.5 ml由pH 5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制而成的1% CMC-緩沖液，空白對照中加入1 ml DNS，50保溫30 min（先預熱5 min），然后加入1 ml DNS沸水浴7 min，流水冷卻至室溫，定容至10 ml，540 nm處測定OD值，根據(jù)吸光度從葡萄糖標準曲線中查出相應的葡萄糖含量，根據(jù)葡萄糖生成量計算酶活。實驗中酶活力定義（IU）：每克培養(yǎng)基中木霉TP100726號菌株每分鐘產(chǎn)生的葡萄糖的微摩爾數(shù)。即每毫升粗酶液每分鐘產(chǎn)生葡萄糖的微摩爾數(shù)乘以緩沖液浸提比。2.3 實驗結(jié)果2.3.1 觀察結(jié)果2.3.1.1 菌株長勢觀察菌落（如圖2.1）初為白色，致密，圓形，向四

19、周擴展，后從菌落中央產(chǎn)生綠色孢子，中央變成綠色。菌落周圍有白色菌絲的生長帶。分生孢子（如圖2.2）呈綠色，為橢圓球狀，菌絲呈不規(guī)則分枝形狀。表2.5為木霉TP100726菌株隨時間變化的生長情況：表2.5 木霉TP100726菌株生長情況培養(yǎng)時間生長情況24h局部有極少量白色菌絲，大部分培養(yǎng)基裸露48h白色菌絲量增加，形成塊狀，但菌絲量仍較少，無孢子72h白色菌絲布滿培養(yǎng)基表面，呈棉絮狀，其上長有一層綠色孢子96h培養(yǎng)及表面布滿綠色孢子，只可見少量白色菌絲96h以后培養(yǎng)基中滿是綠色孢子，無菌絲 圖2.1木霉TP100726菌株生長情況 圖2.2 菌絲及孢子形態(tài)2.3.2葡萄糖標準曲線制作以葡萄

20、糖濃度（g/L）為橫坐標，OD值為縱坐標制作葡萄糖標準曲線，如圖2.3所示：圖2.3 葡萄糖標準曲線 （公式1）x為OD值，y為葡萄糖含量，單位為g/L。2.3.3 酶活計算公式 （公式2）y為葡萄糖含量的數(shù)值（由標準曲線和所測OD值計算可得），N為粗酶液稀釋倍數(shù)，n為微摩爾數(shù)與摩爾數(shù)之間換算關(guān)系，為106，10為緩沖液所用體積與固體質(zhì)量之間比值，180.0為葡萄糖的摩爾質(zhì)量， 60為反應時間60min，1000為y的單位從g/L換算成g/ml。由以上可得OD值和酶活的直接計算公式 (公式3）2.3.4 正交實驗結(jié)果本次正交實驗目的是確定培養(yǎng)基中麩皮、木糖渣、豆粉和稻草粉這幾種物質(zhì)的最優(yōu)配比，

21、以得出木糖渣代替稻草粉的最大量。表2.6和表2.7分別為本實驗測定的濾紙酶活和CMC酶活。表2.6 濾紙酶活編號麩皮木糖渣豆粉結(jié)果11（20%）1（10%）1（0%）38.264212（20%）2（1%）38.551313（30%）3（2%）31.60342（40%）1240.848522343.545623137.23073（60%）1341.939832142.398933241.652K136.13940.35039.297K240.54141.49840.350K341.99636.82839.029R5.8574.6701.32110（原始配方）60%0044.350表2.7 CMC

22、酶活編號麩皮木糖渣豆粉結(jié)果11（20%）1（10%）1（0%）39.355212（20%）2（1%）41.996313（30%）3（2%）38.09242（40%）1238.379522341.250623137.28873（60%）1339.125832141.422933240.618K139.81438.95339.355K238.97241.55640.331K340.38838.66639.489R1.4162.8900.97610（原始配方）60%0041.996從以上兩表中可以看出，麩皮、木糖渣、豆粉三因素對纖維素酶活的影響因素大小順序為：濾紙酶活中，麩皮>木糖渣>豆

23、粉，CMC酶活中，木糖渣>麩皮>豆粉。由此可見，豆粉對纖維素酶活的影響較小。從均值來看，兩種酶活中均表現(xiàn)出培養(yǎng)基固體物質(zhì)最優(yōu)配比為麩皮60%，木糖渣20%，豆粉1%。可以初步認為木糖渣可以代替20%的稻草粉。但原配方中沒有這種組合，為了能更準確的確定最佳配比，仍需再次做一組培養(yǎng)實驗來進行對比。但由于各種原因，本實驗來不及做重復實驗了，這些數(shù)據(jù)只有留待下屆學生繼續(xù)完成。3 纖維素酶酶學性質(zhì)的研究3.1 實驗材料3.1.1 實驗原料 木霉TP100726菌株所產(chǎn)纖維素酶粗酶液，由所有發(fā)酵料混合浸取所得。3.1.2 實驗試劑及儀器見表2.1及表2.23.1.3 緩沖液配制不同pH的檸檬酸

24、緩沖液，配制方法如表3.1。表3.1不同pH的檸檬酸緩沖液pH0.05M 檸檬酸(ml)0.05M檸檬酸三鈉(ml)4.560605.040805.526946.0131073.2 實驗方法3.2.1 測定方法FPA及CMC酶活測定方法見2.2.3.葡萄糖測定方法：水解液中葡萄糖的測定采用由山東科學院生物研究所研發(fā)的SBA-40E生物傳感分析儀進行測定。測定方法如下：準確吸取稀釋適當?shù)臉悠?5 L注入到已經(jīng)定好標的生物傳感分析儀中，數(shù)據(jù)結(jié)果換算成樣品中葡萄糖再乘以稀釋倍數(shù)，計算出水解液中葡萄糖。木糖渣酶活： 木糖渣為底物的酶活定義：每克培養(yǎng)基中木霉TP100726菌株每小時產(chǎn)生的葡萄糖的微摩爾

25、數(shù)。即每毫升酶液每小時產(chǎn)生葡萄糖的微摩爾數(shù)乘以浸提比。計算方法： （公式4）T為SBA-40E生物傳感分析儀制定的數(shù)值 N為稀釋倍數(shù)。纖維素轉(zhuǎn)化率：定義為糖化木糖渣中所產(chǎn)生的葡萄糖的質(zhì)量占所加木質(zhì)纖維素的量的百分率。計算方法：纖維素轉(zhuǎn)化率=葡萄糖質(zhì)量*100/木質(zhì)素質(zhì)量 （公式5）3.2.2 粗酶液稀釋倍數(shù)的確定將粗酶液稀釋至50倍、100倍、200倍、400倍，按照2.2.3中的方法測定FPA及CMC酶活。3.2.3 酶學性質(zhì)研究（1） 酶液最適溫度將合適稀釋倍數(shù)的酶液分別在45°C、50°C、55°C、60°C下測定酶液的FPA和CMC酶活。（2）

26、酶的熱穩(wěn)定性取40 ml稀釋后的酶液，分裝于5個試管中，分別置于45°C、50°C、55°C、60°C恒溫水浴鍋中進行保溫3 h，從各個試管中取出0.5 ml酶液，測定在各個溫度下保溫過的酶的FPA和CMC酶活。以酶活最高的那個溫度下所得到的測定值為參照，其他溫度下測得的酶活力與最高值相比。（3） 酶最適pH值在室溫條件下，配置不同pH值的緩沖液，pH值設(shè)定為4.5、5.0、5.5、6.0，在最適的反應溫度下，測定不同pH值對酶活力的影響。（4） 酶的pH值穩(wěn)定性將粗酶液放入不同pH值的緩沖液中，混勻后封口于50°C下恒溫水浴3 h，測定在不同

27、pH條件下剩余的酶活，以酶活最高的那個pH值條件下所得到的測定值為參照，其他pH值條件下測得的酶活力與最高值相比。3.2.4 粗酶液糖化木糖渣條件初步研究（1）木糖渣糖化的最適pH檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液摩爾濃度為0.05 mol/L，料液比1:10，酶解溫度50°C，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min?？疾焖鈖H對酶解的影響。pH分別設(shè)置為4.5、5.0、5.5、6.0。酶解48 h后取樣測定水解液中葡萄糖濃度。（2） 木糖渣糖化的最適溫度在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液濃度為0.05 mol/L，料液比1:10，水解pH 5.0，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min下，考察溫度對酶解的影響。溫度分別設(shè)置為

28、45°C、50°C、55°C、60°C。酶解48h后取樣測定水解液中葡萄糖濃度。（3） 料液比對酶解的影響為考察不同料液比（1:20、1:15、1:10、1:8）對木糖渣糖化的影響，在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液摩爾濃度為0.05 mol/L，酶解溫度50°C，pH 5.0搖床轉(zhuǎn)速180 r/min下，48 h后測定水解液中葡萄糖濃度，計算木糖渣中纖維素轉(zhuǎn)化率。 （4） 粗酶液糖化不同木質(zhì)纖維素檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液摩爾濃度為0.05 mol/L，料液比1:10，水解pH為5.0，酶解溫度50°C，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，選用木糖渣，玉

29、米芯，稻草粉，酶解48 h后測定水解液中葡萄糖濃度。（5） 糖化木糖渣最適緩沖液選擇配制0.05 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，磷酸緩沖液，乙酸-乙酸鈉緩沖液，按照木糖渣與混合液比例為1:10與50°C，180 r/min下酶解48 h，測定水解液中葡萄糖濃度。3.3 結(jié)果與分析3.3.1 酶液稀釋倍數(shù)的確定粗酶液進行反應時，如果酶液濃度過高，就會使大部分酶分子不能接觸到底物，從而影響酶活的準確度；如果酶液濃度過低，則會使酶分子不能與底物良好接觸，同樣會影響酶活的準確度。因此，需要在實驗前確定好酶液的稀釋倍數(shù)，使其能最好的與底物進行反應，盡量減小實驗誤差。 圖3.1 粗酶液稀釋倍

30、數(shù)實驗數(shù)據(jù) 根據(jù)圖3.1所示及所測吸光度值的大小分析可得，濾紙酶活在酶液稀釋50倍100倍區(qū)間稀釋倍數(shù)最佳，CMC酶活在酶液稀釋100倍200倍區(qū)間稀釋倍數(shù)最佳。3.3.2 酶學性質(zhì)研究（1）纖維素酶最適溫度溫度是影響酶活性及酶穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)。一般說來，酶在一定的溫度范圍內(nèi)，催化反應的速率和溫度成正比，溫度越高，反應速率越快。但在超出一定范圍后，高溫可使酶蛋白失活，酶的反應速率就會迅速下降。如圖3.2所示，木霉TP100726號菌株所產(chǎn)粗酶液在4550°C時，其CMC酶活與FPA均隨溫度的升高而增加，5060°C時，其CMC酶活與FPA則下降。故纖維素酶的最適溫度為5

31、0，其濾紙酶活為48IU，CMC酶活為63IU。圖3.2 粗酶液最適反應溫度（2）纖維素酶最適pH纖維素酶活力與pH值密切相關(guān)，影響酶活的原理可能有以下幾個方面：過酸、過堿會影響酶蛋白的構(gòu)象，甚至使酶變性而失活；同時pH還會影響底物分子與酶分子的中間產(chǎn)物解離狀態(tài)，這些中間產(chǎn)物的離子化狀態(tài)與酶的專一性及酶分子的活力中心的構(gòu)象有關(guān)。一般情況下，木霉屬所產(chǎn)纖維素酶多為酸性纖維素酶，如圖3.3所示，纖維素酶受pH的影響較大，pH在4.55.0時，纖維素酶活性逐漸升高，而在5.06.0時纖維素酶活性則下降較快，可見該纖維素酶并不能在中堿性條件下發(fā)揮作用。所以木霉TP100726菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶促反應

32、最適pH為5.0，其濾紙酶活為25IU，CMC酶活為106IU。圖3.3 粗酶液最適反應pH（3）纖維素酶的熱穩(wěn)定性纖維素酶在一定的溫度下可達到較高酶活，但是在該溫度下并不一定是穩(wěn)定的，長時間保溫下容易變性失活，因此在不同溫度下考察其剩余酶活力情況，對纖維素酶的保存及纖維素酶用于長期水解木質(zhì)纖維素都有重要的意義。如圖3.4所示，在4550°C保溫3h后其酶活力損失較少，而在5060°C時，纖維素酶酶活力則迅速下降，此時可以看到大量的酶蛋白沉淀。所以纖維素酶可在50以下保持較高的活力。 圖3.4 纖維素酶粗酶液熱穩(wěn)定性（4）纖維素酶的酸堿穩(wěn)定性在一定溫度下，pH值對酶穩(wěn)定性會

33、產(chǎn)生很大的影響，通過研究不同pH值條件下酶的酸堿穩(wěn)定性以期找出最大限度發(fā)揮酶的催化活性的pH值。從圖3.5中可知，木霉TP100726菌株所產(chǎn)纖維素酶酶50°C時，pH在5.0左右時較為穩(wěn)定， pH低于5.0或高于5.5均導致纖維素酶活力下降。 圖3.5 纖維素酶粗酶液酸堿穩(wěn)定性3.3.3 粗酶液糖化木糖渣研究（1）糖化木糖渣的最適pH酶解中的pH對木糖渣的糖化效果的影響從圖3.6可以看出，粗酶液糖化木糖渣的效果受糖化過程中pH變化的影響較小。pH在4.5提高至5.0時，葡萄糖量由3.2%（%為1ml粗酶液中葡萄糖所占的百分量）提高至3.3%。將pH提高至5.0后，葡萄糖量迅速下降，

34、由3.3%降至3.0%。由此可知pH在5.0時效果最佳。圖3.6 糖化木糖渣最適酶解pH（2）糖化木糖渣的最適溫度最適的酶解溫度有利于提高酶解效果，提高水解液中葡萄糖的含量，溫度過高或過低都會影響酶解反應的效果。木霉多產(chǎn)粗酶液酶解纖維素的最適溫度多在4550°C之間。由圖3.7可知木霉TP100726菌株所產(chǎn)粗酶液在50°C左右均能夠很好的糖化木糖渣，但以50°C時最佳，此時葡萄糖濃度為3.4% 。圖3.7 糖化木糖渣最適溫度選擇（3）料液比對木糖渣糖化的影響料液比對酶解的影響結(jié)果從圖3.8可以看出，隨著料液比的提高，葡萄糖量逐漸增加，纖維素轉(zhuǎn)化率逐漸降低。料液比

35、從1:20增加到1:10時，葡萄糖量明顯提高，從1:10增加至1:8時，葡萄糖量增幅并不明顯，纖維素轉(zhuǎn)化率明顯下降。酶解液中糖濃度過低不利于發(fā)酵實驗，故選1:10作為最佳料液比，此時葡萄糖含量為3.6%。 圖3.8 不同料液比對糖化木糖渣的影響 （4）粗酶液糖化不同木質(zhì)纖維素情況以木糖渣、玉米芯、稻草為水解對象，考察木霉TP100726菌株所產(chǎn)粗酶液對不同的木質(zhì)纖維素水解情況。由圖3.9可知，在酶解48h后，酶解木糖渣所得葡萄糖量為3.8%。酶解稻草粉所得葡萄糖量為3.1%，玉米芯為3.0%。由此可見，糖化木糖渣水解的最佳底物為木糖渣。圖3.9 不同種類木質(zhì)纖維素水解情況（5）緩沖液體系選擇p

36、H緩沖系統(tǒng)對維持生物的正常pH值、正常生理環(huán)境起重要作用。不同的緩沖體系使所產(chǎn)酶產(chǎn)生不同的酶解效果。由圖3.10可知，三種緩沖體系對糖化木糖渣影響中以檸檬酸-檸檬酸鈉為宜，此時葡萄糖含量為3.8%。圖3.10 不同緩沖液體系對糖化木糖渣的影響4 結(jié)論與討論木霉TP100726菌株原始配方中沒有木糖渣，本實驗將木糖渣添加進去，考察了木糖渣對稻草粉替代的可能，并對改良后發(fā)酵的纖維素酶粗酶液水解木糖渣進行探所，結(jié)果如下：1、木霉TP100726菌株固體培養(yǎng)基中固體物質(zhì)配比為麩皮 60%，木糖渣20%，豆粉1%，稻草粉20%。木糖渣可替代原始配方中稻草粉含量的20%左右。2、木霉TP100726菌株所

37、產(chǎn)纖維素酶的最適反應溫度為50，最適pH為5.0，在50，pH5.0環(huán)境下可保持較高酶活3、以木糖渣為底物，檸檬酸緩沖液，料液比為1:10，溫度為50，pH5.0時，糖化木糖渣酶活最高。但是，由于時間的關(guān)系，本實驗還有很多方面需要改進。培養(yǎng)基固體配比實驗中只是優(yōu)化了一步，還需做進一步的優(yōu)化實驗。如對本實驗所得配比結(jié)果與其它幾組酶活較高的實驗組進行對比，進一步確定最優(yōu)的配比方案。影響酶活性質(zhì)的因素除了溫度和pH外，還有很多其他因素對纖維素酶的酶活有較大影響。如：金屬離子、酶解反應時間、底物濃度等，這些均需要做進一步的研究。參考文獻1 劉燕, 張宏福, 孫哲. 纖維素酶的分子生物學與基因工程研究進

38、展J. 飼料工業(yè), 2007, 28 (18) : 11- 14.2 高培基. 纖維素酶降解機制及纖維素酶分子結(jié)構(gòu)與功能研究進展J. 自然科學進展, 2003, 13(1): 21- 29.3 顧方媛, 陳朝銀, 石家驥等. 纖維素酶的研究進展與發(fā)展趨勢J. 微生物學雜志, 2008, 28 (1): 83- 86.4 Sukumaran RK, Singhania RR, Pandey A. Microbial cullulases production, applications and challenges J. Sci Ind Res, 2005, 64(11): 832-844.5

39、Wheeler Marsha M, Zhou XG, Scharf Michael E, et al. MoLecular and biochemical markers formonitoring dynamic shifts of celluolytic protozoa in Reticulitermes flavipes J. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2007, 37 (12): 1366 - 1374.6 陳小堅. 纖維素酶的分子生物學研究及應用進展J. 湖北民族學院學報, 2006, 23 (4) : 48- 51.7

40、龐宗文, 董志剛, 梁靜等. 高溫放線菌6PL1纖維素酶的酶學性質(zhì)研究J. 現(xiàn)代食品科技, 2006, 22(2): 2023.8 Zhang, Y.H.P, Lynd, L.R. A functionally based model for hydrolysis of cullulose by fungal cullulaseJ. Biotechnol. Bioeng, 2006, 94(5): 888898.9 吳翔, 陳強, 徐麗華. 一株降解纖維素的高溫放線菌的篩選及其產(chǎn)酶條件研究J. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2007, 26(增刊): 101- 104.10 李師翁, 孔凱, 馮佳麗. 產(chǎn)低溫纖維素酶放線菌的篩選、鑒定及酶學性質(zhì)初步研究J. 生物技術(shù)通報, 2010, 7: 216- 220.11 徐揚.纖維素酶高產(chǎn)菌的誘變選育及其酶學性質(zhì)的研究D.吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學，2011.12 Krisztina Kovács, George Szakacs