以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略

1、2010.12.31腫瘤疫苗和腫瘤疫苗和DCDC簡史簡史腫瘤細(xì)胞的免疫逃避機(jī)制和腫瘤細(xì)胞的免疫逃避機(jī)制和DCDC抗腫瘤機(jī)制抗腫瘤機(jī)制以以DCDC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略DCDC腫瘤疫苗的主要影響因素腫瘤疫苗的主要影響因素樹突狀細(xì)胞樹突狀細(xì)胞 dendritic cell; DC 1973 美國學(xué)者美國學(xué)者Steinman 小鼠的脾細(xì)胞小鼠的脾細(xì)胞因其成熟時(shí)伸出許多因其成熟時(shí)伸出許多樹突樣或偽足樣突起樹突樣或偽足樣突起而得名而得名目前所知的功能最強(qiáng)目前所知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞CD34骨髓干細(xì)胞骨髓干細(xì)胞腫瘤疫苗腫瘤疫苗dendritic cell vaccine

2、 DC vaccine1、增強(qiáng)腫瘤、增強(qiáng)腫瘤的的免疫原性免疫原性2、增強(qiáng)機(jī)體、增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤的抗腫瘤免疫免疫應(yīng)答應(yīng)答3、打破打破腫瘤腫瘤免疫免疫耐受耐受核核心心問問題題誘導(dǎo)主動(dòng)性免疫誘導(dǎo)主動(dòng)性免疫刺激宿主產(chǎn)生有效刺激宿主產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答的免疫應(yīng)答安全、無不良反應(yīng)安全、無不良反應(yīng)能為預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)能為預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)提供保護(hù)性的長期提供保護(hù)性的長期免疫記憶功能免疫記憶功能理理想想腫腫瘤瘤疫疫苗苗腫瘤疫苗的研究進(jìn)展腫瘤疫苗的研究進(jìn)展疫苗的出現(xiàn)疫苗的出現(xiàn)1796 Edward Jenner 接種疫苗接種疫苗天花天花 腫瘤疫苗嘗試性研究腫瘤疫苗嘗試性研究提高腫瘤自身免疫原性提高腫瘤自身免疫原性的方法的方

3、法增加機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)增加機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)1、WiUiam Coley丹毒患者的活的鏈球菌丹毒患者的活的鏈球菌注射注射腫腫瘤患者腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)瘤患者腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)激發(fā)起腫激發(fā)起腫瘤患者機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答瘤患者機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答 2、牛痘病毒牛痘病毒感染的腫感染的腫瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞腫瘤溶解物腫瘤溶解物注射人體注射人體3、混合、混合卡介苗卡介苗或或短小短小棒狀桿菌棒狀桿菌+經(jīng)過照射滅經(jīng)過照射滅活的腫瘤細(xì)胞活的腫瘤細(xì)胞共孵共孵育育注射人體注射人體沒有取得明顯肯定的治療效果沒有取得明顯肯定的治療效果 理論基礎(chǔ)的奠定理論基礎(chǔ)的奠定1971 Burnet Thomas 免疫監(jiān)視學(xué)說免疫監(jiān)視學(xué)說免疫系統(tǒng)免疫

4、系統(tǒng)細(xì)胞免細(xì)胞免疫機(jī)制疫機(jī)制識別清除識別清除腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞 臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)1、免疫缺陷免疫缺陷（尤其是細(xì)胞免疫缺陷）（尤其是細(xì)胞免疫缺陷）腫瘤發(fā)生率腫瘤發(fā)生率2、幼兒期幼兒期（免疫功能未發(fā)育成熟）（免疫功能未發(fā)育成熟）和和老年期老年期（免疫功能衰退）（免疫功能衰退）腫瘤發(fā)腫瘤發(fā)生率比其他年齡生率比其他年齡3、經(jīng)、經(jīng)抗淋巴細(xì)胞血清處理抗淋巴細(xì)胞血清處理或或胸腺摘胸腺摘除除的小鼠腫瘤發(fā)生率高的小鼠腫瘤發(fā)生率高腫瘤疫苗研究的飛躍腫瘤疫苗研究的飛躍20世紀(jì)末世紀(jì)末 90年代年代初以初以基因修飾腫瘤細(xì)基因修飾腫瘤細(xì)胞胞為基礎(chǔ)的疫苗發(fā)展為基礎(chǔ)的疫苗發(fā)展 腫瘤疫苗真正成為能夠應(yīng)用腫瘤疫苗真正

5、成為能夠應(yīng)用于臨床的腫瘤治療方法于臨床的腫瘤治療方法1997年年 美國美國Jefferson大學(xué)大學(xué) 約約60的黑色素細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移患者的黑色素細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移患者注射腫瘤疫苗后存活注射腫瘤疫苗后存活5年以上年以上1998年年 波士頓研究人員波士頓研究人員 制成一種經(jīng)生物工程改造的腫瘤制成一種經(jīng)生物工程改造的腫瘤疫苗，它包含一種可以刺激機(jī)體免疫苗，它包含一種可以刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使細(xì)胞保持較長時(shí)間的疫系統(tǒng)，使細(xì)胞保持較長時(shí)間的攻擊力。攻擊力。 （一）全腫瘤細(xì)胞疫苗（一）全腫瘤細(xì)胞疫苗 1、經(jīng)物理、化學(xué)等方法處理的疫、經(jīng)物理、化學(xué)等方法處理的疫苗苗 2、轉(zhuǎn)基因疫苗、轉(zhuǎn)基因疫苗 3、感染病毒類疫苗、感染病毒

6、類疫苗 4、細(xì)胞融合疫苗、細(xì)胞融合疫苗 （二）腫瘤抗原及抗原類分子疫苗（二）腫瘤抗原及抗原類分子疫苗該類疫苗的研究最為廣泛該類疫苗的研究最為廣泛,該類疫苗該類疫苗特異性高特異性高,但免疫原性低但免疫原性低 1、抗原疫苗、抗原疫苗 2、多肽類疫苗、多肽類疫苗 3、抗獨(dú)特型抗體疫苗、抗獨(dú)特型抗體疫苗 4、熱休克蛋白、熱休克蛋白肽類復(fù)合物疫苗肽類復(fù)合物疫苗 （三）核酸疫苗（三）核酸疫苗 （四）重組病毒、病菌疫苗（四）重組病毒、病菌疫苗 （五）樹突狀細(xì)胞疫苗（五）樹突狀細(xì)胞疫苗 腫瘤疫苗新熱點(diǎn)腫瘤疫苗新熱點(diǎn)近近10年來年來 以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤抗原特異性疫苗以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤抗原特異性疫苗

7、1991年年Steinman首次發(fā)現(xiàn)首次發(fā)現(xiàn)DC這一強(qiáng)大的抗原遞呈功能這一強(qiáng)大的抗原遞呈功能以來，以來，DC就被用于腫瘤的免就被用于腫瘤的免疫治療研究疫治療研究轉(zhuǎn)基因疫苗轉(zhuǎn)基因疫苗 表達(dá)的共刺激分子、表達(dá)的共刺激分子、細(xì)胞因子細(xì)胞因子,通過激活通過激活細(xì)胞使更多的抗原細(xì)胞使更多的抗原被攝取呈遞被攝取呈遞 臨床試驗(yàn)效果不如動(dòng)臨床試驗(yàn)效果不如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；物實(shí)驗(yàn)；瘤細(xì)胞獲取復(fù)雜；瘤細(xì)胞獲取復(fù)雜；滅活要求高；滅活要求高；基因?qū)氲陌踩珕栴}基因?qū)氲陌踩珕栴} 直接攜帶腫瘤抗直接攜帶腫瘤抗原的原的DC細(xì)胞作細(xì)胞作用則更為直接用則更為直接 可以活化靜息細(xì)胞，可以活化靜息細(xì)胞，激發(fā)更強(qiáng)抗腫瘤免疫激發(fā)更強(qiáng)抗腫瘤免

8、疫反應(yīng)反應(yīng) DC疫苗疫苗 易獲取，操作簡便，易獲取，操作簡便，效果和轉(zhuǎn)基因疫苗相效果和轉(zhuǎn)基因疫苗相當(dāng)甚至更好當(dāng)甚至更好 美國密執(zhí)安大學(xué)、瑞士蘇美國密執(zhí)安大學(xué)、瑞士蘇黎世大學(xué)等應(yīng)用黎世大學(xué)等應(yīng)用樹突狀細(xì)樹突狀細(xì)胞胞分別攜帶分別攜帶乳腺癌乳腺癌 、黑黑色素瘤抗原色素瘤抗原制備疫苗制備疫苗Dukes大學(xué)則應(yīng)用大學(xué)則應(yīng)用腫瘤細(xì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞均已進(jìn)入均已進(jìn)入期或期或期期 臨臨床試驗(yàn)。床試驗(yàn)。2005年年 中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院研發(fā)出研發(fā)出一種一種除了干細(xì)胞移除了干細(xì)胞移植、化療等常規(guī)治療方法植、化療等常規(guī)治療方法外的白血病治療方法外的白血病治療方法白血病白血病DC疫苗疫苗已在已在1

9、4位患者身上獲得明位患者身上獲得明顯療效，顯療效，國內(nèi)尚屬首創(chuàng)國內(nèi)尚屬首創(chuàng)。 1） 腫瘤的免疫原性較弱, 并具有抗原調(diào)變能力 2）MHC-IMHC-I類分子表達(dá)下降或消失。類分子表達(dá)下降或消失。腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)包括唾液酸在內(nèi)的粘多糖或其他的凝聚腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)包括唾液酸在內(nèi)的粘多糖或其他的凝聚系統(tǒng)；血清中的封閉因子（封閉抗體）封閉腫瘤表面抗原表系統(tǒng)；血清中的封閉因子（封閉抗體）封閉腫瘤表面抗原表位。位。漏逸的少量腫瘤細(xì)胞不能引起足夠的免疫應(yīng)答，反而可以漏逸的少量腫瘤細(xì)胞不能引起足夠的免疫應(yīng)答，反而可以刺激腫瘤不斷生長，產(chǎn)生免疫刺激。刺激腫瘤不斷生長，產(chǎn)生免疫刺激。存在于某些腫瘤組織內(nèi)的淋巴

10、細(xì)胞可以為腫瘤細(xì)胞提供某存在于某些腫瘤組織內(nèi)的淋巴細(xì)胞可以為腫瘤細(xì)胞提供某些腫瘤營養(yǎng)因子并刺激腫瘤細(xì)胞生長。些腫瘤營養(yǎng)因子并刺激腫瘤細(xì)胞生長。 Sakaguchi 等在等在1995年發(fā)現(xiàn)鼠源性的年發(fā)現(xiàn)鼠源性的CD4CD25 雙陽性雙陽性T細(xì)細(xì)胞亞群，能通過細(xì)胞與細(xì)胞間接觸以及分泌細(xì)胞因子顯著胞亞群，能通過細(xì)胞與細(xì)胞間接觸以及分泌細(xì)胞因子顯著抑制多種免疫細(xì)胞的功能。抑制多種免疫細(xì)胞的功能。 局部微環(huán)境的腫瘤抗原可顯著誘導(dǎo)特異局部微環(huán)境的腫瘤抗原可顯著誘導(dǎo)特異Treg細(xì)胞生成，稱細(xì)胞生成，稱為腫瘤特異為腫瘤特異Treg細(xì)胞。細(xì)胞。 很多資料顯示很多資料顯示Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境及患者外周血中富集

11、細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境及患者外周血中富集存在。存在。 腫瘤免疫抑制因子可以使腫瘤細(xì)胞躲避局部免疫效應(yīng)細(xì)胞腫瘤免疫抑制因子可以使腫瘤細(xì)胞躲避局部免疫效應(yīng)細(xì)胞的攻擊，還能進(jìn)入外周血循環(huán)，抑制宿主全身抗腫瘤免疫的攻擊，還能進(jìn)入外周血循環(huán)，抑制宿主全身抗腫瘤免疫功能。功能。 Lyon 小組應(yīng)用小組應(yīng)用“微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)(Cytometric Bead Array，CBA)”對對35例確診乳癌患者及例確診乳癌患者及24例疑似患者的樣本進(jìn)行了檢測對比，得出在所測的例疑似患者的樣本進(jìn)行了檢測對比，得出在所測的IL-1B、IL-2、IL4、IL-5、IL-6、 IL-7、

12、IL-8、IL-10、IL-12 (p70)、IL-13、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IFN-、MCP-1、MIP-1 B和和TNF-細(xì)胞因子中，除了細(xì)胞因子中，除了GMCSF，INF- 外，其他因子都外，其他因子都有顯著的增高。有顯著的增高。Ishigami 等的研究顯示, 胃癌組織中DC數(shù)量與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和周圍浸潤呈負(fù)相關(guān)。 1) 未成熟未成熟DC 與腫瘤細(xì)胞的直接接觸影響了與腫瘤細(xì)胞的直接接觸影響了DC 的成熟的成熟; 2) 腫瘤細(xì)胞釋放的可溶性免疫抑制因子影響著全身的腫瘤細(xì)胞釋放的可溶性免疫抑制因子影響著全身的DC 的成熟和功能的成熟和功能, 包括包括VEGF、

13、TNF-、TGF- 、 M-CSF、GM-CSF、I L-6 和和IL-10 等等 。 腫瘤局部腫瘤局部DC 浸潤數(shù)量可作為判斷腫瘤預(yù)后的浸潤數(shù)量可作為判斷腫瘤預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。獨(dú)立指標(biāo)。以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗策略腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞提取物沖擊腫瘤細(xì)胞提取物沖擊DC1蛋白質(zhì)沖擊蛋白質(zhì)沖擊DC2腫瘤抗原肽沖擊腫瘤抗原肽沖擊DC3腫瘤抗原腫瘤抗原DNA/RNA沖擊沖擊DC4腫瘤抗原在體內(nèi)沖擊腫瘤抗原在體內(nèi)沖擊DC51.腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞/ /腫瘤細(xì)胞提腫瘤細(xì)胞提取物沖擊取物沖擊DCDC1.腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞/ /腫瘤細(xì)胞提腫瘤細(xì)胞提取物沖擊取物沖

14、擊DCDC1.腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞/ /腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞提取物沖擊提取物沖擊DCDCYasuda1.1.腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞/ /腫瘤細(xì)胞提取物沖擊腫瘤細(xì)胞提取物沖擊DCDC2.蛋白質(zhì)沖擊蛋白質(zhì)沖擊DCDC 對于抗原表位尚不了解的腫瘤，可以可溶性蛋白作為抗原裝載DC 在腫瘤動(dòng)物模型和腫瘤患者中，以腫瘤抗原蛋白轉(zhuǎn)染的DC在體外和體內(nèi)均可誘導(dǎo)出針對腫瘤的抗原特異性CTL反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：可使那些因優(yōu)點(diǎn)：可使那些因MHCMHC限制而排除在肽限制而排除在肽疫苗治療之外的患疫苗治療之外的患者受益。者受益。3.腫瘤抗原肽沖擊腫瘤抗原肽沖擊DCDC 以腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原肽裝載DC的腫瘤疫苗4.腫瘤抗原腫瘤抗原DN

15、A/RNADNA/RNA沖沖擊擊DCDC 載體載體4.腫瘤抗原腫瘤抗原DNA/RNADNA/RNA沖擊沖擊DCDC DNA/RNA疫苗可在體外合成而大量獲得，并可包含多個(gè)抗原表位，還可經(jīng)修飾使其功效加強(qiáng)。 RNA疫苗只在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，DNA疫苗需進(jìn)入細(xì)胞核后轉(zhuǎn)錄癌變的潛在危險(xiǎn) DNA疫苗穩(wěn)定性好，功效長久5. 5. 腫瘤抗原在體內(nèi)沖擊腫瘤抗原在體內(nèi)沖擊DCDC腫瘤抗原GM-CSF, IL-4脂質(zhì)體DC裝載載抗原策略免疫佐劑劑的使用DC的體外擴(kuò)擴(kuò)增免疫途徑徑臨臨床病人的選擇選擇DC腫瘤疫苗的主要影響因素腫瘤疫苗的主要影響因素DC的來源的來源DC的分離純化的分離純化DC的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基DC

16、培養(yǎng)使用的細(xì)胞因子培養(yǎng)使用的細(xì)胞因子DC細(xì)胞的鑒定細(xì)胞的鑒定DC的培養(yǎng)技術(shù)的培養(yǎng)技術(shù)DC的來源的來源骨髓骨髓取材有限，取材有限， HSC 含量極少含量極少,大約為大約為1/ 105 單個(gè)核細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞。BM 為侵入性操作為侵入性操作,患者不容易接受?；颊卟蝗菀捉邮?。其增殖及多向分化能力隨供者年齡增加其增殖及多向分化能力隨供者年齡增加體質(zhì)衰弱而減弱。體質(zhì)衰弱而減弱。在體外培養(yǎng)過程中有自發(fā)分化和衰老的現(xiàn)象在體外培養(yǎng)過程中有自發(fā)分化和衰老的現(xiàn)象,且且BM 有病毒污染的可能有病毒污染的可能DC的來源的來源外周血外周血標(biāo)本來源充足標(biāo)本來源充足,取材方便取材方便,因子組合簡單因子組合簡單,培養(yǎng)步驟簡單

17、、培養(yǎng)步驟簡單、經(jīng)濟(jì)經(jīng)濟(jì)。HSC 含量極少含量極少, 最終收獲的最終收獲的DC 數(shù)量少數(shù)量少,活力和純度均活力和純度均不高。不高。其端粒及端粒酶活性均長于和高于其端粒及端粒酶活性均長于和高于BM 及及PB HSC/ HPC ,并且低表達(dá)或不表達(dá)細(xì)胞凋亡配基并且低表達(dá)或不表達(dá)細(xì)胞凋亡配基CD95/ Fas ,故體外生故體外生存期更長存期更長DC的來源的來源臍帶血臍帶血較豐富的原始且能重建長期造血的較豐富的原始且能重建長期造血的HSC/ HPC , 自我增殖及多向分化能力較強(qiáng)自我增殖及多向分化能力較強(qiáng)對刺激因子的反應(yīng)和增殖能力、體外集落形成能力、刺激后進(jìn)對刺激因子的反應(yīng)和增殖能力、體外集落形成能力

18、、刺激后進(jìn)入細(xì)胞周期的速度以及自泌生長因子能力均強(qiáng)于入細(xì)胞周期的速度以及自泌生長因子能力均強(qiáng)于BM 及及PB 的的HSC/ HPC ,臍帶血臍帶血優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)產(chǎn)量大、純度高等產(chǎn)量大、純度高等母嬰無不良影響母嬰無不良影響,不涉及社會(huì)、倫理及不涉及社會(huì)、倫理及法律等方面的爭論法律等方面的爭論,受胎盤屏障保護(hù)受胎盤屏障保護(hù),被污染概率低被污染概率低CB 量較少量較少,通常只有通常只有50150 ml ;CB HSC 對理化變化較敏感對理化變化較敏感,洗滌、分離或運(yùn)用傳統(tǒng)方法去除紅細(xì)胞洗滌、分離或運(yùn)用傳統(tǒng)方法去除紅細(xì)胞的方法均會(huì)導(dǎo)致的方法均會(huì)導(dǎo)致HSC的嚴(yán)重丟失的嚴(yán)重丟失分離純化分離純化操作簡單操

19、作簡單, 細(xì)胞成分復(fù)雜細(xì)胞成分復(fù)雜,多次傳代后不能純化多次傳代后不能純化,增殖活力相對較低增殖活力相對較低連續(xù)連續(xù)貼壁法貼壁法操作簡單操作簡單,成本低廉成本低廉,純化率較低純化率較低密度梯度密度梯度離心法離心法細(xì)胞純度高細(xì)胞純度高( 90 %) ,但操作復(fù)雜但操作復(fù)雜,價(jià)格昂貴價(jià)格昂貴,單克隆抗體選擇不當(dāng)單克隆抗體選擇不當(dāng),容容易丟失目的細(xì)胞易丟失目的細(xì)胞免疫磁珠免疫磁珠分選法分選法聯(lián)合聯(lián)合DC的培養(yǎng)基10%胎牛血清胎牛血清引起機(jī)體免疫反應(yīng)引起機(jī)體免疫反應(yīng)自體單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基自體單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基細(xì)胞因子維持維持DC 分化、發(fā)育、存活、功能的最基本分化、發(fā)育、存活、功能的最基本的的CK,主要使主要使HSC 向向DC、單核及巨噬細(xì)胞、單核及巨噬細(xì)胞分化分化,并以生成單核細(xì)胞為主并以生成單核細(xì)胞為主GM-CSFIL-4IL-4 通過抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞方向的分化而通過抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞方向的分化而誘導(dǎo)其向誘導(dǎo)其向DC 方向分化方向分化IL-4 可以增加并穩(wěn)固可以增加并穩(wěn)固GM-CSF