微生物來(lái)源a―L―鼠李糖苷酶的分子和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進(jìn)展

1、https:/微生物來(lái)源微生物來(lái)源 a L 鼠李糖苷酶的分子和結(jié)構(gòu)生物學(xué)鼠李糖苷酶的分子和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進(jìn)展研究進(jìn)展摘要：a-L-鼠李糖苷酶（a-L-rhamnosidase（EC0）是一種水解酶，分布在 GH13、GH28、GH78 和 GH106 家族，其中 3 種 GH78 家族的-L-鼠李糖苷酶具有典型的（/）6 桶狀結(jié)構(gòu)，它能夠特異性地水解許多糖苷類(lèi)物質(zhì)末端的-L-鼠李糖基，在食品飲料加工工業(yè)和醫(yī)藥業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。介紹了微生物來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶的性質(zhì)及應(yīng)用，主要闡述了-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表達(dá)及該酶晶體結(jié)構(gòu)方面的研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞：-L-鼠李糖苷酶；基因

2、克?。换虮磉_(dá)；晶體結(jié)構(gòu)中圖分類(lèi)號(hào)：Q71；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）01-0068-07ProgressesonMolecularBiologyandStructuralBiologyof-L-rhamnosidasefromMicrobialSourcesZHANGXia1，LILi-jun1*，NIHui1.23，CA1Hui-nong1.2，3，SUWen-jin1，2，3（ 1.CollegeofBioengineering ， JimeiUniversity ， Xiamen361021 ，F(xiàn)ujian，China；2.ResearchCen

3、terofFoodMicrobiologyandEnzymeEngineeringTechnology，Xiamen361021，F(xiàn)ujian，China.，3.ResearchCenterofFoodBiotechnologyofXiamenCity，Xiamen361021，F(xiàn)ujian，China）Abstract：a-L-rhamnosidase（EC0）cleavesterminal-L-rhamnosespecificallyfromalargenumberofglycosides.Theenzymeisabiotechnologicallyimportanthydr

4、olyticenzymeduetoitsapplicationsinthefoodandbeverageprocessingindustryandpharmaceuticalindustry.Basedonprimarysequencesimilarities ， -L-rhamnosidasesareclassifiedwithintheCarbohydrate activeenzymes（ CAZy ） databaseintofourglycosidehydrolase （ GH ） families （ GH13 ，GH28，GH78andGH106family），andthree-L

5、-rhamnosidasesofGH78haveatypical（/）6-barrelstructure.Propertiesandapplicationsof-L-rhamnosidasefromdifferentmicrobialsourceshavebeenintroduced.Inaddition，therecentdevelopmentsoncloning，expressionofoiLi.hamnosidasegeneandthecrystalstructureoftheenzymeweresuhttps:/mmarized.Keywords ： -L-rhamnosidase ；

6、 genecloning ； geneexpression ；crystalstructure（LifeScienceResearch，2015，19（1）：068?074）-L-鼠李糖昔酶（-L-rhamnosidase（EC0）屬于轉(zhuǎn)化糖苷水解酶類(lèi)，能夠?qū)Ｒ?、高效地水解許多糖苷類(lèi)物質(zhì)如柚皮苷（naringin）、蘆?。╮utin）、橙皮苷（hesperidin）等末端的-L-鼠李糖基1。-L-鼠李糖苷酶的來(lái)源廣泛，在動(dòng)物組織、植物和微生物中均發(fā)現(xiàn)了-L-鼠李糖稈酶。目前關(guān)于動(dòng)物組織2和植物來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶的報(bào)道相對(duì)較少，主要是通過(guò)細(xì)菌（如芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、乳桿菌屬及

7、單胞菌屬等）和真菌（如曲霉屬、青霉屬、木霉屬、犁頭霉屬及裂殖菌屬等）發(fā)酵來(lái)獲取-L-鼠李糖苷酶。不同微生物來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)存在差異。細(xì)菌來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶最適 pH 呈中性或堿性，而真菌分泌的-L-鼠李糖苷酶的最適 pH 一般在酸性范圍內(nèi)，主要在 4.07.03-5之間。微生物中的-L-鼠李糖稈酶的最適反應(yīng)溫度一般是 45?604、6。近年來(lái)也有發(fā)現(xiàn)耐熱、嗜低溫及耐堿性的-L-鼠李糖苷酶，如白曲霉 MBRC43086分泌的-L-鼠李糖苷酶，在 60保溫 1h 后酶活仍有初始酶活的 80%；ThermophilicbacteriumPRI-16867產(chǎn)生的-L-鼠李糖苷酶最適溫

8、度為 70，在 60處理 24h 后酶活為處理前的 20%；而亞南極環(huán)境中的單胞菌屬細(xì)菌8中的-L-鼠李糖苷酶在-1-8具有活性。Rojas9等從白黃筍頂孢霉菌（Acrostalagmus luteo albus）分離到一種新型堿性-L-鼠李糖苷酶，以對(duì)硝基苯酚-I-鼠李糖苷（pNPR）為底物測(cè)得酶反應(yīng)的最適 pH 值為8.0，它可以在堿性條件下水解橙皮苷、柚皮苷以及槲皮苷等糖苷物質(zhì)，擴(kuò)大了-L-鼠李糖苷酶的應(yīng)用范圍。-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橙皮背酶的主要活性成分，是去除柑梧類(lèi)果汁苦味的有效物質(zhì)1。果汁中的苦味物質(zhì)柚皮苷被柚苻酶水解的過(guò)程共有兩步反應(yīng)，首先在-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮背

9、生成普魯寧，接著在-D-葡萄糖苷酶的作用下，生成柚皮素。在果汁酶法脫苦過(guò)程中，-L-鼠李糖苷酶參與的第一步反應(yīng)是脫苦的關(guān)鍵，Chien10等用 HPLC 法證明僅有柚苷酶的另一組份-D-葡萄糖背酶存在時(shí)，苦味物質(zhì)抽皮苷是不能被水解的。有研究報(bào)道，對(duì)葫溪蜜柚果汁進(jìn)行脫苦時(shí)，在-L-鼠李糖苷酶加量為 10U/mL 的條件下 40處理60min，苦味就能降低到閾值以下11。除了在飲料行業(yè)中用來(lái)去除柑橘類(lèi)果汁的苦味3、12，在其他行業(yè)也具有很多潛在的應(yīng)用價(jià)值，如通過(guò)水解柚皮苷生產(chǎn) L-鼠李糖1和普魯寧降低黃酮類(lèi)化合物的生產(chǎn)成本；增加釀造酒的香味14、15，改善葡萄汁和飲料的香氣成分；切除一些糖苷類(lèi)藥物

10、原料末端的 L-鼠李糖等16。由于-L-鼠李糖苷酶的重要應(yīng)用價(jià)值，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于該酶的研究開(kāi)發(fā)。本文分別對(duì)微生物來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表達(dá)以及該酶的晶體結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述。 1-L-鼠李糖苷酶的分子生物學(xué)研究微生物分泌的-L-鼠李糖苷酶是一種誘導(dǎo)酶，需要誘導(dǎo)物柚皮苷、橙皮苷、https:/鼠李糖等存在時(shí)才能合成-L-鼠李糖苷酶，而且微生物中-L-鼠李糖苷酶的誘導(dǎo)受到碳源代謝調(diào)節(jié)，給微生物發(fā)酵產(chǎn)-L-鼠李糖苷酶造成阻礙。同時(shí)隨著-L-鼠李糖苷酶的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，傳統(tǒng)發(fā)酵的生產(chǎn)方式不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的需求，也很難達(dá)到很高的純度。因此，選擇現(xiàn)代生物技術(shù)來(lái)研究-L-鼠李糖苷酶

11、是一種必然趨勢(shì)1.1-L-鼠李糖苷酶基因的克隆早期對(duì) a-L-鼠李糖苷酶的研究主要是該酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)，2000 年后對(duì)-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究日漸增多，表 1 列舉了 2000 年以來(lái)微生物中 GH78 家族和近兩年其他家族已克隆的-L-鼠李糖苷酶基因目前，從微生物中克隆-L-鼠李糖苷酶基因主要采用 PCR 和構(gòu)建文庫(kù)的方法。據(jù) PuriM 等報(bào)道，采用構(gòu)建文庫(kù)的方法克隆-L-鼠李糖苷酶基因可以通過(guò)以下兩種方法篩選陽(yáng)性克??；一種是利用 pNPR 作為底物篩選含有-L-鼠李糖苷酶活性的陽(yáng)性克??；另外一種是采用多克隆抗體篩選產(chǎn)鼠李糖苷酶的陽(yáng)性克隆。細(xì)菌來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶基因的克隆

12、研究比真菌稍早，在 2000 年18就有學(xué)者報(bào)道對(duì) Clostridium.stercorarium 菌株中鼠李糖苷酶基因 ramA 的克隆。有些細(xì)菌中存在多個(gè)編碼-L-鼠李糖苷酶的基因，且它們的序列存在差異，在Bacillussp.GLl31中克隆到 rhaA 和 rlmB 兩個(gè)編碼-L-鼠李糖苷酶的基因，它們 分 別 編 碼 兩 個(gè) 不 同 的 -L- 鼠 李 糖 苷 酶 。 來(lái) 自 植 物 乳 酸 桿 菌 （ Latto-bacillusplantarum）23的 rhaB1 和 rhaB2 都是編碼-L-鼠李糖苷酶的基因，它們的序列相似性?xún)H為 26%。不同細(xì)菌中編碼-L-鼠李糖苷酶的基

13、因序列各異，Bacillussp.GLl31中 rhaA 和 rhaB 與 Clostridiumstercorarium 中 ramA 序列相似性分別為 41%和 23%。植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）23中的-L- 鼠 李 糖 酶 KhaB1 和 RhaB2 與 Bacillussp.GLl31 中 該 蛋 質(zhì) （ 登 錄 號(hào) ：BAB62315）的氨基酸序列相似性均為 23%，與 ThermomicrobiaPRI-16867中的 RhaB（登錄號(hào)：AAR96047）相似性分別為 22%和 23%。而少動(dòng)鞘氛醇單胞菌 FP2001（Sphingornona

14、spaucimobilis）21中克隆的-L-鼠李糖苷酶基因rhaM，共有 3354 個(gè)核苷酸，同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)它與其他屬于糖基水解酶（GH）家族 78 的-L-鼠李糖苷酶基因沒(méi)有顯著的同源性。國(guó)外關(guān)于真菌中-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究主要集中在來(lái)源于曲霉屬的-L-鼠李糖苷酶目前，曲霉屬中的棘孢曲霉19、白曲霉6和構(gòu)巢曲霉29等已有克隆-L-鼠李糖苷酶基因的研究報(bào)道。對(duì)目前已知的-L-鼠李糖苷酶基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶基因序列差異較大。從棘孢曲霉19中克隆的兩種編碼-L-鼠李糖苷酶的基因 rhaA 和 rlmB 的核苷酸序列幾乎沒(méi)有相似性，二者氨基酸序列相似性為 60%，

15、而它們與 Clostridiumstercorarium 中該酶的氨基酸序列18的一致性?xún)H有 11%。白曲霉中6-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列與棘孢曲霉19中 rhaA 和 rhaB 的氨基酸序列相似性分別為 75%和 67%，與細(xì)菌7、18、20、21來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列一致性低于 30%。有些真菌中存在著多個(gè)編碼-L-鼠李糖苷酶的基因，如在棘孢曲霉19中分離到兩種-L-鼠李糖苷酶，并克隆了它們對(duì)應(yīng)的基因：有研究者對(duì)構(gòu)巢曲霉29的基因https:/組信息進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，至少存在 8 個(gè)可能具有-L-鼠李糖苷酶功能的基因，而目前已克隆到 rhaA 和 rhaE 兩種：我國(guó)學(xué)者對(duì)-L-

16、鼠李糖苷酶基因克隆的研究相對(duì)較晚，主要是對(duì)犁頭霉屬32-34的-L-鼠李糖苷酶基因的克隆，已成功克隆出蘆丁-鼠李糖苷酶基因 cDNA 片段32和人參皂甙-鼠李糖苷酶基因33、34。近年有研究者從黑曲霉 DLFCC-90 菌株26中克隆到-L-鼠李糖苷酶基因，該序列和-淀粉酶的序列有較高的同源性，被歸類(lèi)到糖苷水解家族 GH13。此外，筆者巳經(jīng)從黑曲霉 JMU-TS528（集美大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程研究室保藏的菌株）中克隆到-L-鼠李糖苷酶基因，共編碼 655 個(gè)氨基酸，序列已上傳至 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：KC750908.1），經(jīng)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它與白曲霉6（AB374267.1）中的-L

17、-鼠李糖苷酶基因的相似性高于 90%。雖然對(duì)微生物來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶基因克隆的報(bào)道越來(lái)越多，但對(duì)該基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控研究并不多。目前，僅指出-L-鼠李糖苷酶基因的表達(dá)量受誘導(dǎo)碳源的影響，葡萄糖在轉(zhuǎn)錄水平抑制該基因的表達(dá)。因此，筆者認(rèn)為今后的研究可在克隆-L-鼠李糖苷酶基因的基礎(chǔ)上進(jìn)一步鑒定與該基因跨膜轉(zhuǎn)移或翻譯直接相關(guān)的基因和蛋白，闡明葡萄糖抑制基因與-L-鼠李糖苷酶基因相互作用的關(guān)系，從而明確碳源代謝調(diào)控-L-鼠李糖苷酶基因的機(jī)制。1.2-L-鼠李糖苷酶基因的表達(dá)通過(guò)-L-鼠李糖苛酶水解柚皮苷生產(chǎn)普魯寧可以降低普魯寧的生產(chǎn)成本，但目前報(bào)道的-L-鼠李糖苷酶大多數(shù)是以柚苷酶的形式存在，

18、而在柚苷酶水解柚皮苷的過(guò)程中，普魯寧作為一種中間產(chǎn)物，會(huì)進(jìn)一步被分解成柚皮素，不能大量積累普魯寧。所以表達(dá)出只具-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白質(zhì)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。近幾年有人對(duì)-L-鼠李糖苷酶基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，表 2 列出了具有代表性的微生物中-L-鼠李糖苷酶基因表達(dá)出的具有活性的蛋白。在研究-L-鼠李糖苷酶基因表達(dá)時(shí)，大腸桿菌是研究者常用的表達(dá)宿主。雖然采用原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)真核微生物中的基因容易出現(xiàn)沒(méi)有活性的產(chǎn)物，目前已有不少研究者將微生物來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶基因，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)出有活性的蛋白。如 Jules22等將植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantaram.）和嗜酸

19、乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）中克隆得到的鼠李糖苷酶基因ram1Lp 、 ram2Lp 和 ramALa ， 在 E.coli 中 表 達(dá) 出 活 性 蛋 白 Ram1Lp 、Ram2Lphe RamALa，其中 RamALa 酶活最大，達(dá)到 8.5mU/g。不同的-L-鼠李糖苷酶基因表達(dá)后產(chǎn)物的水解底物不同，乳酸片球菌24中編碼-L-鼠李糖苷酶的基因 ram 和 ram2，采用 E.coli 表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出活性蛋白 Ram 和Ram2，但 Ram 只能有效地水解合成底物 pNPR，而 Ram2 能特異性水解橙皮苷和蘆丁糖，兩種酶均不能水解柚皮苷，以 pNP

20、R 為底物測(cè)得 Ram 和 Ram2 的酶活分別為 8.7U/mg 和 0.036U/mg。植物乳酸桿菌 NCC2451231 中 rhaB1 和rhaB2 基因表達(dá)的 RhaBl 和 RhaB2 能特異性地水解-1，6 糖苷鍵，但不能水解柚皮苷中的 a-1，2 糖苷鍵，RhaB1 和 RhaB2 的最適底物是橙皮苷和蘆丁。有研究者發(fā)現(xiàn)有些細(xì)菌中編碼-L-鼠李糖苷酶的基因表達(dá)后的產(chǎn)物是二聚體，例如Clostridium stercorarium18 中 編 碼 -L- 鼠 李 糖 苷 酶 的 基 因 ramA 成 功 在https:/（ PWS1261 ） 細(xì) 胞 中 表 達(dá) 出 的 蛋 白

21、Ram78A 包 含 兩 個(gè) 相 同 的 亞 基 ，Lactobacillusplantatum23中 rhaB1 和 rhaB2 基因采用 E.coli 表達(dá)出的-L-鼠李糖苷酶以二聚體形式存在。 由于原核表達(dá)系統(tǒng)本身存在的一些缺陷，有時(shí)表達(dá)出的-L-鼠李糖稈酶不具有活性36，所以有研究者采用真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)-L-鼠李糖苷酶基因。目前對(duì)-L-鼠李糖苷酶基因的真核表達(dá)的報(bào)道并不多，我國(guó)研究者已在酵母中成功表達(dá)了蘆丁鼠李糖苷酶基因36、人參皂苷-鼠李糖苷酶基因33以及黑曲霉中編碼-L-鼠李糖苷酶的基因26。其中黑曲霉中的-L-鼠李糖苷酶基因序列與-淀粉酶基因序列相似性較高，通過(guò)酵母表達(dá)后的產(chǎn)物

22、具有水解蘆丁、柚皮苷及橙皮苷的功能。米用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)將Alternaria sp.L128中 rhal1 編碼的-L-鼠李糖苷酶固定在釀酒酵母細(xì)胞表面，該細(xì)胞能特異性地水解葡萄柚果汁中的柚皮苷達(dá)到果汁脫苦的作用。RhaL1 固定在釀酒酵母細(xì)胞表面后，該酶在 70環(huán)境中活性很高，在 60處理 2h 后酶活達(dá)到處理前的 95%，擴(kuò)大了該酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。目前對(duì)黑曲霉來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶基因的異源表達(dá)研究較少，筆者正在研究從黑曲霉 jMU-TS528 菌株中克隆到的-L-鼠李糖苷酶基因的真核表達(dá)。國(guó)外的研究者報(bào)道了土曲霉25、構(gòu)巢曲霉29和棘孢曲霉35中編碼-L-鼠李糖苷酶的基因在

23、酵母中的成功表達(dá)。鼠李糖能夠誘導(dǎo)構(gòu)巢曲霉29中 rhaE 的表達(dá)，葡萄糖對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，rhaE 在釀酒酵母中表達(dá)的產(chǎn)物，能夠水解底物 pNPR，酶活達(dá)到 1.4U/mL。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在真菌來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶基因中，rhaE 是首個(gè)與細(xì)菌中-L-鼠李糖苷酶基因親緣關(guān)系比其他真菌中的-L-鼠李糖苷酶基因更近的基因。土曲霉中-L-鼠李糖苷酶基因采用酵母表達(dá)系統(tǒng)得到的產(chǎn)物和天然發(fā)酵的-L-鼠李糖苷酶一樣，都可以水解蘆丁，重組酶酶活力高達(dá)9U/mL，比天然酶高出 3 倍，而且大大縮短了天然發(fā)酵獲取-L-鼠李糖苷酶的時(shí)間，同時(shí)酶的產(chǎn)量比天然發(fā)酵的-L-鼠李糖苷酶提高了 4 倍

24、。盡管近年來(lái)，利用基因工程技術(shù)來(lái)構(gòu)建產(chǎn)-L-鼠李糖苷酶的工程菌的研究逐漸增多，并取得了一定的進(jìn)展，但酶活水平始終未能達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用的要求；目前國(guó)際上對(duì)-L-鼠李糖苷酶分泌機(jī)制的研究也不多，因此如何進(jìn)一步提高該酶的胞外分泌水平，是該酶能否得到推廣應(yīng)用的關(guān)鍵：2-L-鼠李糖苷酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)蛋內(nèi)質(zhì)需要形成一定的空間結(jié)構(gòu)才能有活性，近年來(lái)，雖然對(duì)-L-鼠李糖苷酶基因克隆和表達(dá)的報(bào)道很多，佴對(duì)它的結(jié)構(gòu)方面的研究報(bào)道還比較少：2000年 Zverlov 成功克隆 Clostridiumstercorarium18中編碼-L-鼠李糖苷酶基因ramA 后，首次通過(guò)圓二色譜法測(cè)得該酶二級(jí)結(jié)構(gòu)包含 27%的-螺旋

25、和 50%的-折疊結(jié)構(gòu)。CAZy（http：//）數(shù)據(jù)庫(kù)依據(jù)氨基酸序列相似性對(duì)糖苷水解酶類(lèi)進(jìn)行了分類(lèi)，微生物來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶包含在 GH13、GH28、GH78和 GH106 糖苷水解酶家族中。目前，由 PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)可以搜到 3 個(gè)鼠李糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)，分別是來(lái)自 Bacteroides thetaiutaomicronVPI-5482 菌中的-L-鼠李糖苷酶（PDBcode：3CIH）、Bacillus sp.GLI（PDBcode：20KX）和Streptoinycesavermitilis（PDBcode：3W5M、3W5N）菌株中-L-鼠李糖苷https

26、:/酶。Cui31等于 2007 年解析了-L-鼠李糖苷酶（RhaB）的晶體結(jié)構(gòu)，該酶由N、D1、D2、C 和 A5 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成；結(jié)構(gòu)域 A 包含其（/）6 的桶狀結(jié)構(gòu)，Asp567、Glu572、Asp579 和 Glu841 在該酶的催化作用和底物結(jié)合方面起到了關(guān)鍵作用，它們與鼠李糖相互作用，將其突變后，-L-鼠李糖苷酶（RhaB）酶活大幅度降低；并認(rèn)為 RhaB 的空間結(jié)構(gòu)與 Lactobacillusbrevis 菌株的麥芽糖磷酸化酶 MalP 和 Vibrioproteolyti-cus 菌株的殼二糖磷酸化酶 ChBP 的結(jié)構(gòu)相似。來(lái)自 Streptmnyces avermitil

27、is37菌株的-L-鼠李糖苷酶（SaRha78A）的晶體結(jié)構(gòu)有兩種，一種是原蛋白形式，另外一種是包含 L-鼠李糖的晶體結(jié)構(gòu)，這兩種形式的結(jié)構(gòu)變化很小，RMSD 值僅為 0.21A，它們均由 1 個(gè)和 5 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別是 N、D、E、F、A 和 C；結(jié)構(gòu)域 A 包含（/）6 的桶狀結(jié)構(gòu)，與 Cui31等報(bào)道的 RhaB 的催化域相似；SaRha78CM 由 13 個(gè)-螺旋組成，結(jié)構(gòu)域 N 包含 10 個(gè)-折疊，結(jié)構(gòu)域 D 的 11 個(gè)-折疊和 E 的 13 個(gè)-折疊展現(xiàn)出一個(gè)-卷心折疊，結(jié)構(gòu)域 F 由 16 個(gè)-折疊組成兩個(gè)平行的-折疊片；L-鼠李糖分別結(jié)合在結(jié)構(gòu)域 A 和 D 中，結(jié)構(gòu)域

28、 A 中的 L-鼠李糖結(jié)合在該酶的活性口袋的芳香基氨基酸 TrP747 和 TrP640 之間，與周?chē)陌被嵝纬?12 個(gè)氫鍵，結(jié)合后的船型構(gòu)象被認(rèn)為是 GH78 家族-L-鼠李糖苷酶水解聚糖的過(guò)渡態(tài)構(gòu)象；結(jié)構(gòu)域 D 中的 L-鼠李糖結(jié)合在-折疊間，L-鼠李糖的 O2、O3 和 O4 原子分別和-L-鼠李糖苷酶的 Trp203、Asnl80 和 AsP179 形成氫鍵，L-鼠李糖的O3、O4 位置與一個(gè)正二價(jià)鈣離子形成配位共價(jià)鍵，同時(shí)鈣離子與該酶通過(guò)Aspl79、ASnl80、Asn228 和 Pro233 氨基酸產(chǎn)生相互作用：Glu636 和 Glu895是在該-L-鼠李糖苷酶的催化作用中

29、的關(guān)鍵氨基酸，Glu636 在催化過(guò)程中提供質(zhì)子，將其突變后，該酶酶活下降了 40 倍。通過(guò)對(duì)-L-鼠李糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，該酶有 4 個(gè)結(jié)構(gòu)域高度保守（RhaB：A、C、D2、D1；SaRha78A：A、C、E、F），GH78 家族-L-鼠李糖苷酶的催化域是一個(gè)（/）6 的桶狀結(jié)構(gòu)，鼠李糖結(jié)合在該桶狀結(jié)構(gòu)的深溝里31。此外，在streptomyces awermitilis37菌株的-L-鼠李糖苷酶中還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的非催化碳水化合物結(jié)合域（non-catalyticcarbohydratebindingmodule，SaCBM67），SaCBM67 位于結(jié)構(gòu)域 D，通過(guò)鈣依賴(lài)的方式與

30、 L-鼠李糖結(jié)合，在用 EDTA 螯合鈣之后，SaCBM67 失去與 L-鼠李糖結(jié)合的功能。通過(guò)對(duì) 179 和 180 位置的氨基酸的突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，突變后該酶水解阿拉伯樹(shù)膠的活性大大降低，而對(duì)水解芳香基鼠李糖苷的活性影響不大，研究者認(rèn)為 SaCBM67 對(duì)該菌株中的-L-鼠李糖苷酶酶活有著一定的影響。 3 展望微生物來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶具有很多潛在的應(yīng)用價(jià)值，近年來(lái)，對(duì)該酶的研究越來(lái)越受到學(xué)者的關(guān)注，從不同水平對(duì)-L-鼠李糖苷酶進(jìn)行了研究。首先，在-L-鼠李糖苷酶產(chǎn)酶菌株的篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及酶的分離純化和性質(zhì)研究日趨成熟，為產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)-L-鼠李糖苷酶酶制劑及-L-鼠李糖苷酶在食品醫(yī)藥加工

31、工業(yè)中的應(yīng)用提供了一定的參考價(jià)值；其次，在分子生物學(xué)方面，對(duì)不同來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶基因進(jìn)行了克隆，并通過(guò)生物信息學(xué)分析、基因的表達(dá)以及晶體結(jié)構(gòu)的研究，使得對(duì)-L-鼠李糖苷酶的了解進(jìn)一步深入。這些研究為構(gòu)建工程菌生產(chǎn)-L-鼠李糖苷酶，提高-L-鼠李糖苷酶的酶產(chǎn)量，降低目前生產(chǎn)-L-鼠李糖苷酶的成本提供了理論指導(dǎo)。但目前對(duì)不同來(lái)源的-L-鼠李糖苷酶的合成途https:/徑、誘導(dǎo)機(jī)制和催化機(jī)制研究較少，因此，可進(jìn)一步通過(guò)利用分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和計(jì)算生物化學(xué)等技術(shù)，對(duì)-L-鼠李糖苷酶進(jìn)行更深層次的研究。從分子水平上來(lái)研究-L-鼠李糖苷酶的催化機(jī)理，結(jié)合定點(diǎn)突變等技術(shù)來(lái)提高-L-鼠李糖苷酶的催化

32、活性。同時(shí)，通過(guò)計(jì)算模擬等手段研究-L-鼠李糖苷酶的底物結(jié)合特異性，擴(kuò)大-L-鼠李糖苷酶在各生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用范圍因?yàn)樽匀环蛛x純化的酶難以滿(mǎn)足苛刻的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程，所以酶的改造成為一種非常有效的替代途徑，依照-L-鼠李糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)信息，加深對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)，為-L-鼠李糖苷酶定向進(jìn)化和改造奠定理論基礎(chǔ)：參考文獻(xiàn)（References）：1YADAV V， YADAV P K， YADAV S， el al. -L-rhamnosidase： areviewJ. Process Biochemistry， 2010，45（8）： 1226-1235.2|QIAN S ，WANG H Y ，Z

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