雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)參考模板

1、雙分子熒光互補技術(shù)（BiFC）一、技術(shù)簡介BiFC是由Hu 等在2002 年最先報道的一種直觀、快速地判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用的新技術(shù)1. 有報道在GFP 的兩個片層之間的環(huán)結(jié)構(gòu)（loop）上有許多特異位點可以插入外源蛋白而不影響GFP的熒光活性，BiFC技術(shù)正是利用該熒光蛋白家族的這一特性，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標(biāo)蛋白連接。如果兩個目標(biāo)蛋白因為有相互作用而接近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因而發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標(biāo)蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作

2、用發(fā)生的時間、位置、強弱、所形成蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性，以及細(xì)胞信號分子對其相互作用的影響等，這些信息對研究蛋白質(zhì)相互作用有重要意義。其后發(fā)展出的多色熒光互補技(multicolor BiFC)，不僅能同時檢測到多種蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成，還能夠?qū)Σ煌鞍踪|(zhì)間產(chǎn)生相互作用的強弱進行比較.這項技術(shù)不需要特殊的設(shè)備，相互作用的蛋白也不需要特別的理論配比。因此，BiFC技術(shù)已被國際上眾多實驗室采用，在活細(xì)胞內(nèi)證明蛋白質(zhì)的相互作用。本實驗室成功應(yīng)用該技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、ATF2和c-Fos在原代神經(jīng)元中的競爭性相互作用2。BiFC技術(shù)以下幾個特點使其對于研究蛋白質(zhì)相互作用具有獨特的優(yōu)勢：1、能在顯微鏡

3、下直接觀察到蛋白相互作用而且不依賴于其它次級效應(yīng)；2、該相互作用可以在活細(xì)胞中進行觀察，排除了由于細(xì)胞裂解或固定可能帶來的假陽性結(jié)果；3、蛋白質(zhì)在近似生理條件的環(huán)境下表達，表達水平及特性如翻譯后修飾極大地接近于內(nèi)源蛋白；4、不需要蛋白質(zhì)有特別的理論配比，能檢測到不同亞群蛋白質(zhì)間的相互作用；5、多色BiFC技術(shù)不僅能同時檢測到多種蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成，還能夠?qū)Σ煌鞍踪|(zhì)間產(chǎn)生相互作用的強弱進行比較；6、BiFC技術(shù)除了熒光倒置顯微鏡外，不要求特殊的設(shè)備。實驗簡單、快捷、直觀，并適用于原核、真菌、植物、動物等多種組織、細(xì)胞. 該技術(shù)的完善與發(fā)展必然會為蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖的建立帶來福音1

4、 / 3. 但是，該技術(shù)與大多檢測蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)一樣，也存在著假陰性和假陽性的問題，需要在實驗中仔細(xì)驗證。二、實驗步驟：1. 將目的基因插入到含有N片段或C片段的載體中，構(gòu)建成融合蛋白表達載體2. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察是否有相互作用。三、應(yīng)用實例：Fig1: Potassium deprivation increases BiFC signals formed by JunVN173 and ATF2VC155. CGNs were transfected with plasmids encoding JunVN173 (JunVN) and ATF2VC155 (ATF2VC)

5、together with ECFP. JunL3VN were served as a control. After 16 hr, CGNs were switched to 25K, 5K media for 1h. Photos were taken on a fluorescence microscope at a magnification of 200×. The white arrows indicated the BiFC signals (Venus fluorescence). The transfected cells were lysed for Wester

6、n blotting by anti-Flag and anti-ATF2 (20F1 CST). CFP were reprobed for normalizing the tranfection efficiency. The percentage of CFP-positive cells exhibiting Venus fluorescence was scored. Data were presented as means ± S.E., n=3, Students t test, p<0.052.1.Hu, C.D., Y. Chinenov, and T.K. Kerppola, Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell, 2002. 9(4): p. 789-98.2.Yuan, Z., et al., Opposi