引物設(shè)計(jì)原則(必看)參考模板

1、mi引物設(shè)計(jì)原則1. 引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。3. 引物3端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5端序列對(duì)PCR影響不太大，因

2、此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。5. 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。6. G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5端和中間G值相對(duì)較高的引物。引物的3端的G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。7. 引物二聚體及

3、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8. 對(duì)引物的修飾一般是在5端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物序列應(yīng)該都是寫成5-3方向的，Tm之間的差異最好控制在1度之內(nèi)，另外我覺(jué)得擴(kuò)增長(zhǎng)度大一些比較好，500bp左右。要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。2 / 10 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。

4、 引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機(jī)分布。 引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。1.引物的特異性 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。 2.避開產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū) 某些引物無(wú)效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G°）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避

5、開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。 3.長(zhǎng)度 寡核苷酸引物長(zhǎng)度為1530bp，一般為2027mer。引物的有效長(zhǎng)度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因?yàn)?gt;38時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度（74),不能保證產(chǎn)物的特異性。 4.G+C含量 G+C含量一般為40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件

6、最佳。 5.堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。6.引物自身 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。 7.引物之間 兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 8.引物的3端 引物的延伸是從3端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（

7、AS-PCR）反應(yīng)中，引物3端不能發(fā)生錯(cuò)配。 在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四種dNTP各200mol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。AA錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20，AG和CC錯(cuò)七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯(cuò)配對(duì)PCR影響是等同的。 9.引物的5端 引物的5端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒

8、光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。 10.密碼子的簡(jiǎn)并 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。Hairpin 發(fā)卡結(jié)構(gòu)如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng)如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對(duì)區(qū)域在3 末端問(wèn)題會(huì)更為嚴(yán)重3 末端配對(duì)很容易引起引物二聚體擴(kuò)增使Pair Rating 匹配度評(píng)分匹配度低的引物對(duì)常常不太有效是因?yàn)樵谕瑯油嘶饻囟认耇m低的引物決定擴(kuò)增的特異性而Tm高的引物更易于

9、形成非特異性結(jié)合而造成錯(cuò)誤的起始【1】引物的長(zhǎng)度以1530bp為宜，否則會(huì)影響擴(kuò)增的特異性?！?】 】堿基盡可能隨機(jī)分布，避免相同的堿基成串排列，引物的G+C含量在4060之間，若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C，若GC含量太高，可在5'端加上一些A或T?！?】 應(yīng)避免每條引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)及兩條引物的3'端互補(bǔ)形成引物二聚體，避免在引物的3'端有3個(gè)G或3個(gè)C成串排列，3'端的末位堿基最好選T、C、G,而不選A，也有建議在引物的兩端用12個(gè)嘌呤堿基?！?】 盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過(guò)5），退火溫度根據(jù)較低的Tm值選定，也

10、可以通過(guò)改變引物的長(zhǎng)度來(lái)平衡兩條引物的退火溫度。Tm值可以根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算。而對(duì)于較長(zhǎng)的引物，Tm值需要考慮動(dòng)力學(xué)參數(shù)、從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù)都采用這種方式。（注：對(duì)于Tm值的計(jì)算有爭(zhēng)議的地方是附加序列應(yīng)不應(yīng)該計(jì)算在內(nèi)，我覺(jué)得有值得商討的地方。因?yàn)閺睦碚撋现挥凶铋_始的循環(huán)引物的附加序列是不與模板鏈結(jié)合的，而在后來(lái)的PCR反應(yīng)中，引物的附加序列是和模板鏈結(jié)合了的。）【5】 引物的3端要與模板嚴(yán)格配對(duì)，而5端堿基沒(méi)有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的部分足夠長(zhǎng)，其5端堿基可不與模板DNA配對(duì)而呈游離狀態(tài)，這樣，我們可以在引物的5末端加上

11、酶切位點(diǎn)（引入酶切位點(diǎn)時(shí)，要考慮到進(jìn)行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來(lái)困難）、啟動(dòng)子，方便下游操作?！?】 不要在擴(kuò)增序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)設(shè)計(jì)引物，以免退火困難。也要考慮引物設(shè)計(jì)處模板的特異性。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。 要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。 現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物。一般引物長(zhǎng)度為1530堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1

12、00600堿基對(duì)。 讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G C含量一般為40%60%。而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設(shè)計(jì)的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物。 同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性，一般一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)。 引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾，例如可以在引物的5端加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大。但3端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?端開始的。這里還需提醒的是3端不要終止于密碼子的第3位，因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。 綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計(jì)原

13、則： 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。 G C含量在40%60%之間。 堿基要隨機(jī)分布。 引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。 PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。 1.引物的特異性 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8

14、個(gè)互補(bǔ)堿基同源。 2.避開產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū) 某些引物無(wú)效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G°）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。 3.長(zhǎng)度 寡核苷酸引物長(zhǎng)度為1530bp，一般為2027mer。引物的有效長(zhǎng)度：Ln=2（G C） （A T ，Ln值不能大于38，因?yàn)?gt;38時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度（74),不能

15、保證產(chǎn)物的特異性。 4.G C含量 G C含量一般為40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G C） 2（A T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。 5.堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。 6.引物自身 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)

16、性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。 7.引物之間 兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 8.引物的3端 引物的延伸是從3端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3端不能發(fā)生錯(cuò)配。 在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四種dNTP各200mol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。AA錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20，AG和CC錯(cuò)七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯(cuò)配對(duì)PCR影響是等同的。 9